广州管圆线虫宿主肠道侵袭：组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶AC-cathB-1的功能初探

摘要

广州管圆线虫是引起嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎和脑膜脑炎的主要病原生物，该病也因此被命名为广州管圆线虫病。广州管圆虫属于管圆线虫属，中间宿主为软体动物，终末宿主为啮齿类动物，人因误食未煮熟的携带其第三期幼虫(L3)的软体动物而意外感染，L3污染的其他食物或水源也可导致感染。近年来，随着人们饮食习惯的改变和水陆交通日趋发达，该病的流行呈上升趋势。然而，我们在其诊断和治疗方面仍缺乏有效手段，因此对其的进一步研究很有必要。
　　小肠壁作为机体防御病原体入侵的天然屏障之一，是大部分食源性且经历宿主体内移行过程的寄生虫必须逾越的屏障，广州管圆线虫也不例外。然而， L3究竟凭借什么能够突破小肠粘膜进入循环系统中，其中的分子机制又是什么，对此我们仍然知之甚少。考虑到肠道实验操作的不方便性以及每次实验必须要牺牲动物，我们首先建立了一个广州管圆线虫-肠上皮细胞共培养模型，期望用它来分析L3侵袭过程中与肠上皮细胞间发生的相互作用。在L3和宿主小肠上皮细胞发生的初始相互作用中，我们发现L3识别小肠上皮细胞并攻击它以造成机械损伤，同时通过释放蛋白酶及其他相关分子来打开上皮细胞层的紧密连接和扩大相邻细胞间的间隙以便于屏障穿越，但不引起细胞凋亡的增加。
　　尽管我们已经初步了解L3是依靠哪些方式穿透肠壁，但对于涉及其中的分子机制，特别是相关关键基因还还不甚了解。组织蛋白酶B是一类广泛分布的半胱氨酸蛋白酶，与哺乳动物中通常分布于溶酶体中不同，它在寄生虫中通常是一种分泌蛋白，被认为与寄生虫的致病、组织入侵、体内移行、营养摄取和免疫逃避等重要过程有关。本室前期克隆的AC-cathB-1基因是一种组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶。实时定量PCR结果显示，它在L3中表达量明显高于第一期幼虫(L1)、第五期幼虫(L5)和成虫，因此我们选择它作为目标基因研究其在L3感染宿主过程中的作用。
　　不同物种间，或同一物种中的不同组织蛋白酶B在理化性质、分布和功能方面各不相同，它们的表达情况总是和其功能相关。我们将AC-cathB-1基因构建入原核表达系统，获得了大量原核表达重组蛋白，并制备了AC-cathB-1蛋白抗血清。利用抗血清，我们考察了AC-cathB-1蛋白在L3上的定位，发现它在体壁、食道和肠道表达，说明它可能参与到L3的蜕皮和营养摄取过程;另外，在排泄管中也有明显阳性信号，说明它可能被释放到机体外起作用。Western印迹实验结果显示，L3分泌排泄产物(ESP)样品中有AC-cathB-1蛋白，综合前期结果我们确证该蛋白为L3的ESP组成成分，参与寄生虫宿主的相互作用。实时定量PCR结果显示，大鼠组织提取物能诱导AC-cathB-1基因mRNA水平的上调，说明该基因在此过程中可能是效应基因。
　　原核表达系统表达产物通常缺乏必要的修饰，因此我们利用哺乳动物表达系统获得了具有生物学活性的重组蛋白。AC-cathB-1重组蛋白以低水解活性的蛋白酶原形式存在，需要通过加工激活形成成熟蛋白酶而发挥作用。我们发现在胃蛋白酶存在的情况下，AC-cathB-1重组蛋白被切出略小于35kD的肽段，且水解荧光底物的能力升高了7倍以上，说明胃液可以激活L3 ESP中的AC-cathB-1。通过梯度pH值实验，我们发现该蛋白酶在pH6.0有最高活性，而在强酸强碱环境中活力低下。
　　寄生虫的蛋白酶类在宿主组织穿越过程中的作用主要体现在其具有降解细胞外基质组分的酶学活性。我们的结果显示，激活的重组AC-cathB-1可以降解细胞外基质组分纤连蛋白、层粘连蛋白，但对Ⅰ型胶原蛋白不起作用;明胶酶谱实验显示它具有水解明胶的活性。因此我们推测它参与到L3对宿主肠壁的穿越过程。为了验证这一推测，我们将激活的重组AC-cathB-1添加到贴壁培养的IEC-6细胞中，发现细胞间隙显著增大;而与蛋白酶孵育3 h后的大鼠小肠也显示了上皮细胞自基底膜脱落的表型。这说明，AC-cathB-1蛋白确实可以破坏大鼠的小肠组织。
　　因为缺乏有效的遗传修饰手段，寄生线虫特定基因的功能研究进展缓慢。近年来，RNA干扰技术为我们提供了一种选择，然而在广州管圆线虫上还没有成功的应用。哺乳动物细胞研究中常用特异抗体封闭分泌型配体和受体间的相互作用，因其基于抗原抗体的相互作用而具有特异性。我们借鉴这一方法，使用抗血清封闭AC-cathB-1重组蛋白的活性，抑制效率达到了78.7％。抗血清预处理的L3对体外屏障模型和大鼠离体小肠袋的穿透能力均显著降低，说明该蛋白确实在L3的宿主肠壁穿越过程中有重要作用。
　　综上所述，本文首先构建了寄生虫-上皮细胞相互作用模型，并借此研究了广州管圆线虫L3侵袭小肠上皮细胞的具体模式。接着，我们探讨了特定基因AC-cathB-1在此过程中的特性和功能。发现该蛋白作为L3的ESP组分，在宿主的胃中被胃蛋白酶激活，并在小肠的弱酸性环境中起作用，帮助寄生虫破坏宿主小肠粘膜从而侵入机体。我们认为，AC-cathB-1基因可以作为开发针对广州管圆线虫感染的特异药物的潜在靶点。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1．广州管圆线虫

1．1．1．广州管圆线虫与广州管圆线虫病

1．1．2．广州管圆线虫的生活史概述

1．1．3．广州管圆线虫的结构

1．1．4．广州管圆线虫病的流行与分布

1．1．5．广州管圆线虫病的主要传播途径和控制

1．1．6．广州管圆线虫病的致病机制、诊断和治疗

1．1．7．分泌排泄产物在寄生虫宿主相互作用中的功能

1．2．肠道屏障

1．2．1．肠道屏障的结构和功能

1．2．2．肠道屏障和寄生虫

1．2．3．上皮细胞系

1．2．4．体外相互作用模型

1．3．寄生虫蛋白酶的研究进展

1．3．1．蛋白酶的分类

1．3．2．寄生虫蛋白酶的研究

1．3．3．寄生虫中的半胱氨酸蛋白酶

1．3．4．组织蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶

1．4．本论文研究的目的

第二章 广州管圆线虫宿主肠道穿越方式的研究

2．1．材料与方法

2．1．1．材料

2．1．2．方法

2．2．结果

2．2．1．广州管圆线虫L3的ESPs不能诱导IEC-6细胞凋亡

2．2．2．广州管圆线虫L3能对上皮细胞造成机械损伤且具有细胞特异性

2．2．3．L3的ESPs中的蛋白酶降解IEC-6细胞的ECM

2．2．4．广州管圆线虫ESPs导致IEC-6细胞间紧密连接打开

2．2．5．蛋白酶抑制剂降低广州管圆线虫的体外屏障穿越能力

2．3．讨论

第三章 AC-cathB-1基因的克隆、表达和抗体制备

3．1．材料与方法

3．1．1．材料

3．1．2．方法

3．2．结果

3．2．1．AC-cathB-1基因克隆和原核表达载体构建

3．2．2．AC-cathB-1基因的原核诱导表达

3．2．3．His-tagged AC-cathB-1重组蛋白的纯化

3．2．4．AC-cathB-1抗血清的制备和纯化

3．2．5．AC-cathB-1基因真核表达载体构建(慢病毒)

3．2．6．AC-cathB-1基因稳转细胞系的建立(293T-cathB1)

3．2．7．上清收集和纯化

3．3．讨论

第四章 AC-cathB-1基因的差异表达和蛋白定位

4．1．材料与方法

4．1．1．材料

4．1．2．方法

4．2．结果

4．2．1．Realtime qPCR反应条件优化

4．2．2．AC-cathB-1在广州管圆线虫发育不同时期的表达量变化

4．2．3．AC-cathB-1蛋白在广州管圆线虫L3中的定位

4．2．4．AC-cathB-1蛋白是广州管圆线虫L3 ESP的组成部分

4．2．5．胃液处理不影响L3 AC-cathB-1基因表达的变化

4．2．6．宿主组织和IEC-6对L3 AC-cathB-1基因的表达有诱导作用

4．3．讨论

第五章 AC-cathB-1基因在宿主肠道穿越中的功能验证

5．1．材料与方法

5．1．1．材料

5．1．2．方法

5．2．结果

5．2．1．胃蛋白酶能够加工激活AC-cathB-1蛋白酶

5．2．2．AC-cathB-1蛋白酶的最适pH

5．2．3．AC-cathB-1蛋白酶的底物偏好性

5．2．4．重组AC-cathB-1对IEC-6的水解活性

5．2．5．重组AC-cathB-1的对宿主小肠的水解活性

5．2．6．CA074和抗血清能抑制AC-cathB-1蛋白酶活性

5．2．7．AC-cathB-1蛋白酶在L3入侵过程中有重要作用

5．3．讨论

总结和展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢