一种偶发分枝杆菌及在微生物转化生产睾酮中的应用

摘要

本发明涉及偶发分枝杆菌(Mycobacterium foru－itum)突变株CGMCC1241及在微生物转化生产睾酮中的应用。该菌株能以高转化率实现底物动植物甾醇到产物睾酮的转化，具备产业化应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物转化技术领域，具体涉及一种偶发分枝杆菌及在微生物转化生产睾酮中的应用。

背景技术

甾体类药物是一大类在临床上具有特殊治疗作用，且其他药物无法替代的极其重要的药物。其中，睾酮(17β-羟基雄甾-4-烯-3-酮，Testosterone，TS；具下述式I结构)

作为一种雄激素药物，可以促进雄性动物第二性征的发育和性器官的成熟，近年来作为替代疗法被用于治疗男性患者的原发性或继发性性腺功能减退症。国外对此已有大量研究。另外，睾酮是蛋白同化激素的重要前体物质，蛋白同化激素的主要作用在于改善蛋白代谢，促进蛋白质合成和减少蛋白质异生，减少钙、磷排泄，减轻骨髓抑制，恢复和增强体力、利尿降压等。由于其具有显著的抗衰老和抗癌作用，应用范围日益扩大。

生产睾酮传统工艺是以来自天然植物资源的甾体皂苷作为原料进行一系列的化学合成。其中不仅涉及到天然资源的消耗，还由于大量化学反应步骤的参与而造成严重的环境污染。

微生物转化技术的应用使甾体类药物的制备工艺研究得到了长足的进步。特别是二十世纪八十年代以来，将微生物转化技术应用于甾体关键中间体制备的研究取得突破性的进展。世界医药强国，尤其是美国和日本，利用本国的农副产品——植物甾醇为原料经微生物转化获得关键中间体，以此合成甾体药物，从而不仅解决了植物资源有限而带来的原料瓶颈问题，且大大地降低了制造成本和减少了环境污染。

对于睾酮而言，国外也相应进行了微生物转化方法方面的研究。目前报道的主要是使用雄甾烯二酮(androst-4-ene-3，17-dione，4AD；见下述式II结构)作为底物进行一步微生物氢化转化成睾酮；或者使用单一甾醇如谷甾醇进行微生物转化得到睾酮。

由于前者牵涉到制备4AD底物本身还需经过一系列反应步骤，故相比之下后者更为优越。如能获得转化能力足够高、而且易于大规模培养的微生物菌种，则可大大提升该线路的工业化应用价值。

发明内容

本发明的目的在于通过菌种选育手段结合转化条件的优化，获得可实现睾酮高转化率、具产业化应用价值的突变菌株。

本发明公开的高转化率的睾酮生产菌株为偶发分枝杆菌(Mycobacterium foruitum)突变株，该菌种微生物保藏号为CGMCCNo.1241。该菌株以偶发分枝杆菌(Mycobacterium foruitum)DSMZ2966为出发菌种，经自然选育、化学物理诱变等处理而获得。具体诱变、筛选步骤包括：

1、出发菌株

偶发分枝杆菌(Mycobacterium foruitum)DSMZ 2966

2、培养基

斜面/平板培养基：含适量葡萄糖、酵母粉、蛋白胨及琼脂。此培养基用于出发菌株的培养、菌种的自然分离、菌种常规传代等目的。

转化培养基：葡萄糖4.0％，酵母浸出粉1.0％，磷酸二氢钾0.7％，谷甾醇0.5％，吐温80 0.1％。

3、转化产物的分析方法-HPLC

试样制备：转化液2ml中定量加入丙酮8ml，振荡混匀后放置过夜。取上层清液1ml于15000rpm离心10分钟，上清液供HPLC检测。

色谱柱：C₁₈，ODS，4.6mm×250mm，5μm

检测器：Agilent 1100

检测波长：242nm

柱温：50℃

流动相：甲醇∶水＝80∶20(体积比)

流速：0.8ml/min

4、自然分离

取菌种的新鲜斜面一支加入少量无菌水，轻轻刮下菌苔倒入装有无菌玻璃珠和无菌水的三角瓶中，充分振摇10分钟，用塞有脱脂棉的无菌漏斗过滤，得到菌悬液。菌悬液梯度稀释后涂布于平板培养基上，培养到长出单菌落。

5、紫外诱变

(1)长波紫外诱变

按上述自然分离中同样方法获取菌悬液，以380nm的辐射波长对菌种进行诱变处理。处理后梯度稀释并涂布于平板培养基，于28℃避光培养。

(2)短波紫外诱变

按上述自然分离中同样方法获取菌悬液，以260nm的辐射波长对菌种进行诱变处理。处理后梯度稀释并涂布于平板培养基，于28℃避光培养。

6、γ-射线(⁶⁰Co)诱变

按上述自然分离中同样方法获取菌悬液，取出2ml置于容量为10ml的无菌加塞三角瓶中。将三角瓶置于⁶⁰Co辐射源照射。处理后梯度稀释并涂布于筛选平板，于28℃培养。

7、NTG诱变

在由磷酸缓冲液制备的菌悬液系统中加入NTG于28℃摇床上培养处理后，取样梯度稀释涂布筛选平板，28℃培养。

8、摇瓶筛选

将经选育处理得到的单菌落接种斜面28℃培养成熟后，接种到含转化培养基的摇瓶中进行液体培养转化，HPLC检测转化产物。

经过反复筛选最终得到一株转化率是出发菌株10倍以上的突变菌株，该突变菌株经传代考察证明其遗传稳定，经合理的传代次数后转化生成睾酮的能力可保持在同等水平。该微生物菌种公开保藏号为CGMCC 1241。菌株选育系谱见图1；出发菌株和筛得的突变菌株各自转化产物的HPLC图谱见图2和图3。

采用本发明诱变、筛选获得的CGMCC 1241菌株进行睾酮制备时，可以4AD、动植物甾醇为底物直接转化生成睾酮；其中动植物甾醇选白胆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇或它们的混合物。底物甾醇的添加浓度为0.1％-3.0％。

采用本发明菌株进行睾酮制备时，其培养基中可利用的碳源选自糊精、柠檬酸盐、甘油、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉，含量为1.0％-6.0％；氮源可选自酵母粉、复合氨基酸、蛋白胨、玉米浆、尿素、硝酸盐、铵盐，含量0.2％-5.0％；转化中可添加磷酸盐、镁盐、纳盐等微量元素；还可添加吐温80等表面活性剂，以促使固体甾醇更好地溶解，有利于转化率提高。

本发明采用CGMCC 1241菌株进行睾酮制备时，优选的转化培养基为葡萄糖1.0％-6.0％、酵母粉0.2％-2.0％、磷酸二氢钾0.5％-1.5％、动植物甾醇0.1％-3.0％，吐温80 0-0.5％；转化温度为20℃-40℃，优选25℃-30℃；转化pH为4-9，优选pH5-7；转化时间5-9天。

采用上述条件优化组合制备睾酮，在从250ml三角摇瓶到10吨发酵罐上最终可实现80％以上的转化率。转化产物经萃取、柱层析等步骤可获得纯度高于90％的睾酮产品。

本发明获得的突变菌株达到了高转化率生成睾酮的目的，具有产业化应用价值。

附图说明

图1.偶发分枝杆菌(Mycobacterium foruitum)CGMCC 1241菌种选育系谱

其中NS表示自然分离，UV₃₈₀表示380nm波长的紫外线处理，UV₂₆₀表示260nm波长的紫外线处理，NTG表示亚硝基胍处理。

图2.出发菌株转化产物的HPLC图谱

图3.菌株CGMCC 1241转化产物的HPLC图谱

具体实施方式

实施例1  菌种稳定性考察---传代对转化的影响

斜面培养基：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，聚蛋白胨0.8％，琼脂粉1.5％。

种子培养基：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，磷酸二氢钾0.2％。

转化培养基：葡萄糖4.0％，酵母浸出粉1.0％，磷酸二氢钾0.7％，谷甾醇0.5％，吐温80 0.1％；消前pH6.5。

培养条件：斜面培养温度28℃，培养时间5天；种子液培养温度28℃，培养时间2天；转化培养温度28℃，培养时间5天。摇瓶转速220rpm/min，旋转式摇床振荡培养。

  传代代数    1    2    3    4    5 TS相对生成量    (％)    100    97    95    94    96

实施例2  突变株与出发菌株转化率的比较

培养基及培养条件同实施例1。

突变株与出发菌株的对照试验结果如下：

 菌种出发菌株DSMZ 2966菌种CGMCC 1241 TS生成量265μg/ml4100μg/ml TS相对量100％1547％ 相对提高倍数——14.5倍

实施例3  摇瓶转化试验

斜面培养基、种子培养基和各阶段培养条件同实施例1。

转化培养基：糊精5.0％，蛋白胨1.2％，硝酸钾0.1％，磷酸二氢钾0.5％，胆甾醇1.0％，吐温80 0.2％；消前pH 5.8。

培养条件同实施例1。

转化率为80.2％。

实施例4  摇瓶转化试验

斜面培养基、种子培养基和各阶段培养条件同实施例1。

转化培养基：可溶性淀粉3.5％，葡萄糖1.0％，玉米浆2.0％，磷酸二氢钾0.8％，混合植物甾醇(谷甾醇∶菜油甾醇＝2∶1)2.0％，吐温80 0.1％。

转化培养时间7天，其余培养条件同实施例1。

转化率为83％。

实施例5  7吨发酵罐转化试验

斜面培养基、种子培养基、转化培养基、斜面和种子培养条件同实施例4。7吨发酵罐条件控制如下：温度25℃，通气量1∶1(vol∶vol)，搅拌转速300rpm，周期7天。生成睾酮转化率为81.7％。

实施例6

按实施例5得到的转化液经过丙酮浸泡，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，经过硅胶柱层析(洗脱液环己烷∶乙酸乙酯＝7∶1)得到纯度为92％的睾酮产品。