检测海、鸟、堪萨斯、偶发分枝杆菌四重荧光定量PCR的构建

摘要

目的：构建检测海、鸟、堪萨斯、偶发分枝杆菌的四重荧光定量PCR，探讨荧光定量PCR技术检测非结核分枝杆菌（NTM）的优缺点，为NTM感染的诊断提供更加简便、可靠的实验室方法。
　　方法：通过总结前期研究成果和检索现有文献，分别查找扩增海分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌及偶发分枝杆菌四种感染手部常见NTM基因序列的特异引物和通用引物。首先用通用引物PCR扩增标准菌DNA后测序，测序结果用GeneBank数据库比对以验证标准菌符合要求；其次用普通PCR验证多重特异引物的特异性；然后用特异引物构建四重荧光定量PCR，分别检测以上四种标准菌DNA，评估荧光定量PCR的特异性及敏感性；最后用该四重荧光定量PCR检测16份海、鸟、堪萨斯、偶发分枝杆菌感染的标本。
　　结果：1、查找到4对分别扩增海、鸟、堪萨斯、偶发分枝杆菌基因序列的特异引物及1对特异扩增NTM基因序列的通用引物；2、构建了能检测海、鸟、堪萨斯、偶发分枝杆菌四种感染手部常见NTM的荧光定量PCR方法；3、该荧光定量PCR可检测NTM的DNA浓度为5.2fg/μl，低于普通PCR最低检测浓度（52fg/μl）；4、该四重FQ-PCR检测16份临床标本，11份标本结果为阳性，其中海分枝杆菌4份，鸟分枝杆菌3份，堪萨斯分枝杆菌2份，偶发分枝杆菌2份，经多重普通PCR检测，无标本出现两种以上NTM的感染；5、该四重荧光定量PCR检测NTM所需时间约为3小时。
　　结论：本研究建立的FQ-PCR能检测海分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌四种手部感染常见的NTM，可快捷、准确、灵敏地诊断这四种NTM所致感染，为临床诊断NTM感染提供了新的检测方法。

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前言

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.2 主要实验仪器

1.3 主要实验试剂

1.4 实验方法

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 所用引物序列

2.2 通用引物PCR扩增标准菌及测序

2.3 普通PCR检测引物特异性

2.4 检测四重引物FQ-PCR的鉴别能力及准确性

2.5 检测普通PCR及该FQ-PCR能测出的DNA模板浓度

2.6 三种方法检测临床标本

2.7 FQ-PCR和普通PCR检测临床标本结果对比

2.8 FQ-PCR检测所需时间

3 讨论

3.1 荧光定量PCR引物的确定

3.2 荧光染料的选择

3.3 荧光定量PCR熔解曲线分析

3.4 FQ-PCR与普通PCR对比及标本检测

3.4 该四重FQ-PCR的优点

4 结论

参考文献

综述: 荧光定量PCR在手部非结核分枝杆菌感染中的研究进展

致谢

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