一种低度起泡苹果酒的苹果酸乳酸发酵技术

摘要

一种低度起泡苹果酒的苹果酸乳酸发酵技术，涉及苹果酒的酿造技术领域。本发明采用在苹果酒酿造过程中，在酵母发酵的前酵采用以苹果原汁或浓缩苹果汁为原料，加苹果酒酵母CCTCC.NO.M201022进行前酵发酵，在前酵结束后，顺序进行苹果酸乳酸发酵，接种的菌种为乳酸菌酒明串珠菌(Oenococcus oeni)，确定了苹果酸乳酸发酵的起始总酸浓度、接种量、发酵温度和发酵时间。以O.oeni为苹果酸乳酸发酵菌株，在设定的工艺参数下进行顺序苹果酸乳酸发酵，得到低度起泡苹果酒产品，酒精度仅为316mg/L左右(3～4度)，口感柔和圆润、爽口，有很好的生物稳定性。对我国苹果资源的开发利用，进行苹果的精深加工，生产适应市场需求的优质苹果酒，具有很高的经济效益和社会效益。

说明书

技术领域

一种低度起泡苹果酒的苹果酸乳酸发酵技术，涉及苹果酒的酿造技术领域。

背景技术

苹果酒是一类由苹果汁或浓缩苹果汁发酵而成的、含酒精的果酒，分成佐餐酒、特种苹果酒(包括起泡酒和苹果利口酒)和混合型(低度清爽型)酒三类，它是世界上仅次于葡萄酒的第二大果酒类型。这几年国内以苹果为原料的苹果酒生产发展很快，年产量约为8500吨。然而，目前生产的苹果酒酒度大都在11-13％(v/v)，相对偏高，人们的消费主要以佐餐为主，所以开发出低度起泡、爽口的苹果酒(cider)不仅可以满足消费者的需求，又可以解决我国苹果过剩以及苹果深加工等问题。

“Cider”是起泡型苹果酒中的一个重要类别，是以新鲜果汁或浓缩果汁发酵而成的低度、带汽的苹果酒。Cider的特点是酒度较低，酒中又富含CO₂，具有起泡特性和清爽感，故近年来颇受广大消费者喜欢。随着人们对生活品质要求的提高和市场的发展，cider苹果酒必定成为人们消费的一种趋势。

苹果酒(cider)酿造技术的关键点包括：①苹果原料以及发酵菌种；②苹果酒生产工艺方法以及工艺参数；③发酵后期的生物稳定性问题。按照国际上常用分类，酿造苹果酒的原料苹果可分为尖酸(Sharp)、苦酸(Bittersharp)、苦甜(Bittersweet)和甜(Sweet)苹果四大类。我国苹果主要品种包括红富士、国光、红星、嘎啦、金冠、乔金纳、红香蕉和青香蕉等，属于低酸的食用的甜品种，不同于国外专用的酿制苹果酒的尖酸和苦酸型苹果品种。我们选用了一种专用的苹果酒酵母，专门用于国产食用甜品种苹果的发酵酿制苹果酒，见中国专利01127081.0，较好的解决了国产苹果原料及发酵菌种的问题。此外，为了解决这些因素给cider风味和品质带来的影响，国外大多数酿酒师在cider的酿造中采用苹果酸乳酸发酵。苹果酸乳酸发酵(malolactic fermentation，简称MLF)是现代果酒生产中重要的二次发酵过程，该过程是在乳酸菌苹果酸乳酸酶的作用下，直接将L-苹果酸(二元酸)转化成为L-乳酸(一元酸)并释放出CO₂，该转化过程如下式所示。

果酸乳酸发酵在果酒酿造中有着重要的作用，主要有：①苹果酸乳酸发酵有利于果酒口味的改善。由于苹果酸和乳酸在感官上表现的不同，所以经过苹果酸乳酸发酵可减少生果酒的酸涩和粗糙感，使之柔和、圆润；②通过苹果酸乳酸发酵可以实现果酒的降酸，使得采用尖酸浆果酿造的果酒pH升高；③果酒在苹果酸乳酸发酵后不容易被杂菌污染，提高了果酒的生物稳定性。

实际的果酒生产中，苹果酸乳酸发酵很难得到很好的控制。由于自发的苹果酸乳酸发酵在触发和发酵时间上的不确定，所以在现代化的酿酒厂，大都采用直接添加乳酸菌来触发苹果酸乳酸发酵。采用这种方式不仅可以在短时间内结束苹果酸乳酸发酵，并能通过乳酸菌形成的特定的风味物质来控制苹果酸乳酸发酵的质量，使口感柔和、增加果香和香气的复杂性。从1972年Pilone和Kunkee开始这方面研究以来，已有大量的酒明串珠菌发酵剂。之所以只采用明串珠菌作为发酵剂，是因为Nelssen等从经过MLF的法、意等欧洲国家的葡萄酒中分离出的乳酸菌中，有77％属于明串珠菌属。此外，由于明串珠菌能够耐低pH和高的酒精浓度，因此无论是在自然发酵或人工接种进行的MLF中，它均为常见菌株。但是，Simona Guerrini等在研究中发现在明串珠菌属中有60％的菌株能产生组胺、腐胺等物质，这和先前认为明串珠菌属大都不产胺类物质的观点是不一致的，鉴于酒中胺类物质不利于人们的健康，所以人们在选择发酵剂的时候应该把是否产胺作为一个指标。

由于苹果酸乳酸发酵是在前酵结束以后开始进行，所以乳酸菌的生长以及代谢都很大程度上受到苹果酒酒体各因素的影响，如SO2，酒精度，pH，温度等。加上我国苹果含酸量较低，其苹果酸乳酸发酵的技术有其独特的特征，实际生产中苹果酸乳酸发酵会受到很多条件的制约，我们筛选到一株适合于苹果酒酵母CCTCC.NO.M201022发酵后的原酒再进行苹果酸乳酸发酵的菌株及确定其顺序发酵工艺条件对我国苹果酒的生产是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种低度起泡苹果酒的苹果酸乳酸发酵技术，本发明以国产低酸的食用的甜品种苹果的苹果汁为原料，加苹果酒酵母CCTCC.NO.M201022进行前酵发酵，再采用一株合适的苹果酸乳酸发酵菌株及确定其顺序发酵工艺条件。

本发明的技术方案：在苹果酒酵母发酵的前酵采用以国产低酸的食用的甜品种苹果的苹果原汁或浓缩苹果汁为原料，加苹果酒酵母CCTCC.NO.M201022进行前酵发酵，在前酵结束后，顺序进行苹果酸乳酸发酵，接种的菌种为乳酸菌酒明串珠菌(Oenococcus oeni)，苹果酸乳酸发酵的起始总酸浓度为6.37g/L～4.72g/L，接种量为6～7％即初始接种细胞密度达到6×105cfu/ml，发酵温度20～25℃，发酵时间12～15天。乳酸菌酒明串珠菌(Oenococcus oeni)为CECT 4727、或CECT 4730、或CCRC 14062等。

前酵工艺，酿造原料为国产低酸的食用的甜品种苹果榨汁获得的苹果原汁或浓缩苹果汁，将果汁稀释，使固形物浓度在13-14°，总酸调至以苹果酸计为5g/l，前酵发酵温度采用15～20℃低温发酵，发酵时间15天，控制前酵结束酒精浓度体积比为5-6％，发酵结束后，分离酵母。

苹果酸乳酸发酵

菌种

果酒生产中常常添加乳酸菌来进行苹果酸乳酸发酵，一株优良的苹果酸乳酸菌株的标准简单来说可以有：①能在苹果酒中良好生长②有适当的苹果酸乳酸转化能力③有利于苹果酒感官质量的提高。本发明采用的乳酸菌为酒明串珠菌(Oenococcus oeni)，为CECT 4727、或CECT 4730、或CCRC 14062等。

培养基及培养条件

乳酸菌保藏培养基：是改良的MRS培养基，以g计％成分如下：胰蛋白胨1，进口酵母粉0.5，葡萄糖1，果糖0.5，MgSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.005，柠檬酸二铵0.35，盐酸-L-半胱氨酸0.05，Tween-80 1ml，番茄汁100ml，pH4.8；

苹果酸乳酸发酵乳酸菌种子培养基：苹果汁调整到13～14°+0.05％酵母粉。

乳酸菌斜面培养条件：培养温度30℃，厌氧培养4-5天；厌氧培养，每隔12小时充CO2气一次，充气时间30min。

乳酸菌发酵种子培养条件：培养温度30℃，培养4-5天以达到稳定期。

乳酸菌O.oeni在低度起泡苹果酒(Cider)中苹果酸乳酸发酵(MLF)的参数确定单位细胞密度下采用顺序发酵有利于提高发酵速率，苹果酸降解速率最大，柔和指数最高，柔和指数越高，表明口味圆满、醇和而味长，这一点与感官品尝的结果是一致的。通过综合比较发酵方式，发现顺序发酵所需要的发酵时间最短，生成乙酸量最低，发酵结束柔和指数最高，所以cider的MLF宜采用此接种方式。

不同起始总酸浓度对苹果酸乳酸发酵的影响

苹果酸浓度越高，越有利于乳酸菌O.oeni对苹果酸的降解，其苹果酸降解速率随之升高。当cider体系酸度越高，越不利于乙酸的生成。当总酸浓度在8.53g/l和6.37g/l时，MLF发酵后酒样乙酸浓度分别比对照高61.9mg/l和29.14mg/l，但是当总酸在4.72g/1时，其乙酸浓度增加了391.47mg/l。

在不同起始苹果酸浓度下，有机酸的组成有较大的改变，奎尼酸浓度随着苹果酸浓度上升而下降，下降幅度较大，这种结果有可能是高浓度的苹果酸阻止了其他途径的代谢而导致奎尼酸浓度降低。

不同接种量对苹果酸乳酸发酵的影响

在实际生产中，苹果酸乳酸发酵很难触发，所以酿酒工程师通常通过增加乳酸菌接种量而减少发酵的触发时间。但是过高的接种量可能会使cider在MLF后因乙酸含量过高而具有不好口感。当接种量大于6×10⁵cfu/ml时，对于MLF的进行几乎没有影响，苹果酸降解速率相差不大。通过实验，发现乳酸菌的接种量越高，发酵结束以后乙酸的浓度也就越高，在接种量从6％变化到10％的过程中，乙酸的浓度增加了近一倍，所以为了提高苹果酒的品质，要严格控制接种量。在苹果酸乳酸发酵顺利进行的情况下，采用较小的接种量有利于提高苹果酒的风味，柔和指数升高，最终采用接种量6～7％(初始接种细胞密度达到6×10⁵cfu/ml)。

不同发酵温度对苹果酸乳酸发酵的影响

在相同接种量的情况下，温度越高，乳酸菌O.oeni生长越快，MLF所需要的时间越短，当温度大于20℃时，MLF只需要9天，苹果酸降解速率也分别达到493.92mg/l·d(20℃)和490.81mg/l·d(25℃)。然而，温度越高，发酵产生的乙酸也随之升高，尤其当发酵温度为25℃，乙酸含量在MLF后达到了500.13mg/l。从柔和指数的变化来看，当温度在20℃时，柔和指数值为3.76，比MLF发酵前升高了2.45。

低温虽不利于乳酸菌的生长，但是有利于减少乙酸的生成，而且低温发酵有利于保持苹果酒的香气物质，所以综合考察温度对MLF的影响，本发明最终选用20～25℃作为MLF的发酵温度。

发酵时间对苹果酒苹果酸乳酸发酵的影响

在苹果酒苹果酸乳酸发酵过程中，发酵时间的长短影响着发酵的程度，发酵的程度又影响着酒中有机酸的变化，显而易见，发酵不彻底，苹果酸的含量肯定比发酵彻底的苹果酸浓度要高。随着发酵时间的增加，苹果酸降解速率逐渐降低，所以可以认为苹果酸的降解阶段主要是发酵前期。

发酵时间过长不利于苹果酒的感官风味。从柔和指数的变化来看，发酵12天和发酵15天的柔和指数基本保持不变，所以也可以判定发酵时间过长对cider的感官也没有贡献，所以本发明选择苹果酸乳酸的发酵时间为12～15天。

本发明的有益效果：本发明针对我国大多数苹果品种均属于低酸的食用的甜品种，不同于国外专用于酿制苹果酒的尖酸和苦酸型苹果品种。我们选用了一种专用的苹果酒酵母，用于国产低酸的食用甜品种苹果的发酵酿制苹果酒，见中国专利01127081.0，较好的解决了国产苹果原料及发酵菌种的问题。O.oeni是一种优良的苹果酸乳酸发酵菌株，对其在cider的具体应用工艺确定起泡苹果酒进行苹果酸乳酸发酵的工艺参数。

采用顺序发酵在MLF发酵过程中产乙酸最少，仅增加了70.25mg/l；并且该方式下苹果酸降解速率达到最高，为419.79mg/l·d；经过对不同发酵温度的MLF进行比较，发现温度越高，发酵产生的乙酸量也越高，但同时考虑到低温会延长发酵时间，最终选择最佳的发酵温度为20℃；在已确定此工艺条件下，对发酵时间进行研究，结果表明发酵12天即可完成MLF，最终cider的乙酸浓度仅为316.38mg/l；当乳酸菌接种量为6×10⁵cfu/ml时，已能够顺利进行苹果酸乳酸发酵，并发现接种量越大MLF过程中产生的乙酸量也越大；O.oeni对苹果酸的转化能力较好，发酵初始总酸在6.37g/l以下都能顺利完成苹果酸乳酸发酵。对我国苹果资源的开发利用，进行苹果的精深加工，生产适应市场需求的优质苹果酒，具有很高的经济效益和社会效益。

生物材料样品保藏

酵母属酵母，保藏日期2001年6月24日，保藏单位名称及简称：中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为NO：M201022。

具体实施方式

实施例1

以国产低酸的食用的甜品种苹果榨汁获得的苹果原汁或浓缩苹果汁为酿造原料，将果汁稀释，使固形物浓度在13-14°，总酸调至以苹果酸计为5g/l，前酵发酵温度采用15～20℃低温发酵，发酵时间15天，控制前酵结束酒精浓度体积比为5-6％，发酵结束后，分离酵母，然后进行苹果酒的苹果酸乳酸发酵。以乳酸菌酒明串珠菌(Oenococcus oeni)CECT 4730为菌种，苹果汁前酵结束后接种乳酸菌，苹果酸乳酸发酵的起始总酸浓度为6.37g/L，接种量为6％即初始接种细胞密度达到6×10⁵cfu/ml，发酵温度20℃，发酵时间12天。发酵结束后，苹果酸浓度降为27.47mg/L，乙酸含量为241.86mg/l，苹果酒口感柔和圆润、爽口，有很好的生物稳定性。

实施例2

前酵操作同实施例1，再以乳酸菌酒明串珠菌(Oenococcus oeni)CECT 4727为菌种，苹果汁前酵结束后接种乳酸菌，苹果酸乳酸发酵的起始总酸浓度为5.01g/L，接种量为6％即初始接种细胞密度达到6×10⁵cfu/ml，发酵温度20℃，发酵时间12天。发酵结束后，苹果酸浓度降为40.74mg/L，乙酸含量为206.92mg/l，苹果酒口感较柔和圆润、爽口，有很好的生物稳定性。

实施例3

前酵操作同实施例1，再以乳酸菌酒明串珠菌(Oenococcus oeni)CCRC14062为菌种，苹果汁前酵结束后接种乳酸菌，苹果酸乳酸发酵的起始总酸浓度为4.72g/L，接种量为7％即初始接种细胞密度达到7×10⁵cfu/ml，发酵温度25℃，发酵时间15天。发酵结束后，苹果酸浓度降为25.50mg/L，乙酸含量为550.67mg/l，苹果酒口感较柔和圆润、爽口，有较好的生物稳定性。