肠出血性大肠杆菌的志贺菌毒素家族基因的检测试剂

摘要

本发明提供了优选用于肠出血性大肠杆菌(EHEC)的2型志贺菌毒素家族基因(stx)的快速和特异性基因检测试剂的寡核苷酸的组合。更具体地，本发明提供了用于检测EHEC的stx2 RNA的方法，所述方法通过使用具有与EHEC的stx2基因特异的碱基序列同源或互补的并且位于基因型之间无变化的位点之间的序列引物以及结合stx2 RNA的特定位点的寡核苷酸而仅特异扩增stx2 RNA。

说明书

发明领域

本发明涉及临床检查、公共健康检查、食物评价和食物中毒检查中检测肠出血性大肠杆菌的检测试剂。

现有技术

志贺菌毒素家族(stx)是肠出血性大肠杆菌(EHEC)如病原性大肠杆菌O157产生的烈性毒素。与EHEC感染相关的主要症状包括水样稀便，继之发生严重的腹部疼痛和血性便。此外，一些受感染的人发生导致溶血性尿毒症(HUS)和脑病的并发症，已经报导这在最坏情况下导致死亡。

尽管EHEC的血清型非常不同，有超过60种血清型，但是按照检测频率最常见的血清型是O157:H7。此外，基于抗原性的不同，stx还被广义上分为1型(stx1)或2型(stx2)。

尽管O157抗原试验和其他试验是检测和鉴定EHEC的公知方法，但是扩增EHEC基因中和来自所述基因的RNA中存在的特定序列后检测所述序列的方法在灵敏性、速度和操作的容易性方法是优选的。在恒温扩增目标核酸的方法在试验系统的自动化方面是尤其优选的。

发明公开

已经报导了检测和鉴定EHEC的一种方法，其中在相对低的温度(41℃)特异扩增来自stx1和stx2的RNA(日本特开2002-253257)。在该方法中，使用了一种RNA扩增方法，该方法包括步骤：使用来自stx1或stx2的RNA的特定序列作为模板，以及具有与所述特定序列互补的序列的第一引物，和具有与所述特定序列同源的序列的第二引物，用RNA依赖的DNA聚合酶产生cDNA，从而形成双链RNA-DNA，其中第一引物或第二引物具有这样的序列，其中RNA聚合酶的启动子序列被加到引物之一的5’末端，通过核糖核酸酶H降解双链RNA-DNA的RNA，从而产生单链DNA，并用DNA依赖的DNA聚合酶使用所述单链DNA作为模板产生具有这样启动子的双链DNA，所述启动子能够转录为由所述RNA序列组成的RNA，或转录为与所述RNA序列互补的序列，其中所述双链DNA在RNA聚合酶存在下产生RNA转录产物，所述RNA转录产物作为随后用RNA依赖的DNA聚合酶进行cDNA合成的模板。此外，在荧光嵌入染料标记的寡核苷酸存在下实施RNA扩增方法，其中所述寡核苷酸的序列与RNA转录产物的序列的至少一部分互补，并且在所述寡核苷酸与所述RNA转录产物存在互补结合的情况下，反应液的荧光特征与没有复合体形成的情况相比发生改变，从而，可以通过测量反应液的荧光强度进行检测。

然而，上面提到的方法在灵敏性和速度方面有问题。根据日本特开2002-253257，对于stx2 RNA的最初量为10²份拷贝的情况，检测时间为约17分钟，这比使用stx1 RNA检测试剂的检测时间慢(在约14分钟检测stx1 RNA的10²份拷贝)(见实施例1)。此外，上面提到的方法的第二引物可能具有基因型中差异导致的碱基序列错配，并且认为携带具有错配的基因型的EHEC导致更长的检测时间或者不能被检测到(参考图1)。

因此，本发明的目的是提供与基因型差异无关的具有更好的速度和特异性的stx2 RNA的检测试剂。

作为对具有更好的速度和特异性的EHEC stx2 RNA的检测试剂开发的深入研究的结果，本发明的发明人开发了能够解决错配问题(见图1)和基于不同基因型中没有改变的位点设计寡核苷酸在约14分钟检测10²份拷贝的stx2 RNA的最初量的试剂。

本发明涉及用于检测样品中存在的肠出血性大肠杆菌的2型志贺菌毒素家族基因(stx2)的检测试剂，该试剂用于使用RNA扩增方法的检测法，该方法包括步骤：

使用来自stx2的RNA的特定序列作为模板，以及具有与所述特定序列同源的序列的第一引物，和具有与所述特定序列互补的序列的第二引物，用RNA依赖的DNA聚合酶产生cDNA，从而形成双链RNA-DNA，其中第一引物或者第二引物具有这样的序列，其中RNA聚合酶的启动子序列已经被添加到该引物的5’末端；

通过核糖核酸酶H降解所述双链RNA-DNA的RNA部分，从而产生单链DNA；和

使用所述单链DNA作为模板用DNA依赖的DNA聚合酶产生具有这样启动子的双链DNA，所述启动子能够转录为由所述RNA特定序列组成的RNA，或转录为与所述RNA特定序列互补的序列；其中，

双链DNA在RNA聚合酶存在下产生RNA转录产物，所述RNA转录产物作为随后用RNA依赖的DNA聚合酶进行cDNA合成的模板；

其中试剂含有，作为第一引物，由SEQ.ID No.1所示序列的至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸，或者为这样的寡核苷酸，其中由SEQ.ID No.1所示序列的至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸中的一个或多个核苷酸被缺失、替换或者添加并且能够特异结合与该特定序列互补的序列，或者在高严格条件下与该由SEQ.ID No.1所示序列的至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸杂交并且能够特异结合与该特定序列互补的序列的寡核苷酸；和作为第二引物，由SEQ.ID No.2所示序列的至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸，或者为这样的寡核苷酸，其中由SEQ.ID No.2所示序列的至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸的一个或多个核苷酸被缺失、替换或者添加并且能够特异结合与该特定序列互补的序列，或者在高严格条件下与该由SEQ.ID No.2所示序列的至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸杂交并且能够特异结合与该特定序列互补的序列的寡核苷酸。

高严格杂交条件指任何杂交条件并且，例如，为下面的实例中所指的条件，由在60mM Tris、17mM氯化镁、100-150mM氯化钾和1mM DTT存在下在41℃到44℃的温度下进行杂交组成。

此外，对于旨在检测与来自stx2的RNA互补的RNA的情况，具有与上面提到的第一引物互补的序列并且其序列从5’末端到3’末端被颠倒的寡核苷酸应该被用作第一引物，具有与上面提到的第二引物互补的序列并且其序列从5’末端到3’末端被颠倒的寡核苷酸应该被用作第二引物。

优选地，在切割用寡核苷酸的存在下进行前述RNA扩增方法，该切割用寡核苷酸在前述特定序列的5’末端切割前述目标RNA并且具有与所述特定序列的5’末端相邻并重叠的区域互补的序列。

在一个优选的方面，前述第一引物是SEQ.ID No.1中所示序列的寡核苷酸。

在另一优选的方面，前述第二引物是SEQ.ID No.2中所示序列的寡核苷酸。

在更优选的方面，前述第一引物是SEQ.ID No.1中所示序列的寡核苷酸，并且前述第二引物是SEQ.ID No.2中所示序列的寡核苷酸。

在另一优选的方面，在荧光嵌入染料标记的寡核苷酸存在下进行前述RNA扩增过程，并且通过测量反应液的荧光强度进行EHEC的检测。这里，所述寡核苷酸的序列与RNA转录产物的序列的至少一部分互补，并且在所述寡核苷酸与所述RNA转录产物的互补结合存在的情况下，反应液的荧光特征与没有复合体形成的情况相比发生改变。

优选地，前述荧光嵌入染料标记的寡核苷酸由SEQ.ID No.3中所示至少10个相邻碱基组成。

使用本申请发明的检测试剂的检测方法用于检测肠出血性大肠杆菌的stx2 RNA，而与基因型的差异无关，该检测方法比现有技术中的方法(日本特开2002-253257)更快并且有更高的特异性。

附图简述

图1显示了实施例1和实施例2中所用检测stx2 RNA的每一寡核苷酸的结合位点以及RNA扩增区和三种stx2基因的外围碱基序列(见Ito等，Microbial Pathogenesis 8，47-60(1990)和GenBank No.X07865)。碱基序列中用“-”指出的位点表示与GeneBank No.X07865的碱基序列相同的位点。本申请的发明中所用的所有寡核苷酸都基于基因型之间没有改变的位点设计。

图2(A)显示了随着反应时间和RNA产物的增加(最初stx1 RNA量从10²个拷贝/实施例1中进行的试验到10⁵个拷贝/实施例1中进行的试验)荧光强度的比率图(stx1的荧光强度图)，(B)显示了随着反应时间和RNA产物的增加(最初stx2 RNA量从10²个拷贝/实施例1中进行的试验到10⁵个拷贝/实施例1中进行的试验)荧光强度的比率图(stx2的荧光强度图)。“Nega”指其中使用稀释剂代替RNA样品的样品。在约14分钟检测到10²个stx1 RNA拷贝，而约17分钟检测到10²个stx2 RNA拷贝，并且指出stx2 RNA的检测时间比stx1 RNA的检测时间长。

图3(C)显示了在最初RNA量的对数值和从10²份拷贝/在实施例1中进行的试验到10⁵份拷贝/实施例1中进行的试验的最初stx1 RNA量的上升时间之间得到的校正曲线(stx1的校正曲线)，和(D)显示了在最初RNA量的对数值和从10²份拷贝/在实施例1中进行的试验到10⁵份拷贝/实施例1中进行的试验的最初stx2 RNA量的上升时间之间得到的校正曲线(stx2的校正曲线)。

图4(A)显示了随着反应时间和RNA的产生(最初stx2 RNA量为从10²份拷贝/在实施例2中进行的试验到10⁵份拷贝/在实施例2中进行的试验)荧光强度比率图(stx2的荧光强度图)，和(B)显示了最初RNA量的对数值和上升时间之间得到的校正曲线(stx2的校正曲线)。“Nega”指其中用稀释剂代替RNA样品的样品。在约14分钟检测到stx2 RNA的10²份拷贝，表明与现有技术的方法相比更短的检测时间(日本特开2002-253257)。

下面提供了本发明的详细说明。

实施本发明的最佳模式

下面提供了本发明的详细说明。

在本发明中，尽管序列表中每个所列碱基序列的全长可分别用于第一和第二引物，但是由于约10个碱基已足够特异结合到特定核酸序列等，所以也可以使用由每一序列中至少10个相邻碱基组成的寡核苷酸的组合。

本发明的扩增方法包括NASBA方法、3SR方法和TRC方法(见例如，日本特开2000-014400)，本发明的扩增方法通过反转录酶和RNA聚合酶的协同作用扩增stx2 RNA序列(通过在反转录酶和RNA聚合酶协同作用的条件下使它们反应)。这里，尽管对温度没有特定限制，但是优选35到50℃。

在本申请的前述发明的一个方面，目标RNA必须在特定序列的5’末端被切割。以这种方式切割该目标RNA的一个优选方法由通过加入具有与和该特定序列的5’末端相邻并重叠的区域互补的序列的寡核苷酸(切割用寡核苷酸)，用核糖核酸酶H等切割目标RNA组成。这里，重叠碱基的数目尤其优选为5或6个碱基。在所述切割用寡核苷酸中，3’末端羟基优选被化学修饰并且，例如，可以被胺化，以抑制从3’末端的延伸反应。

尽管在前述核酸扩增方法中得到的扩增产物可以用公知的核酸检测方法检测，但是在该方法的一个优选方面，优选在嵌入荧光染料标记的寡核苷酸存在下进行前述核酸扩增，然后测定反应液的荧光特征的变化。在所述寡核苷酸中，由于嵌入荧光染料通过衔接子结合该寡核苷酸中的磷原子，与目标核酸形成双链的嵌合部分(互补核酸)而嵌入到双链部分，导致荧光特征的改变，从而导致不需要分离并分析的特征(Ishiguro，T.等(1996)Nucleic Acid Res.24(24)4992-4997)。

被所述寡核苷酸结合的序列可以是对stx2 RNA特异的任何序列，虽然对其没有特定限制，但是优选由SEQ.ID No.3中所示序列中至少10个连续碱基组成的序列或其互补序列。此外，所述寡核苷酸的3’末端的羟基优选被化学修饰以抑制通过使用该寡核苷酸作为引物可能发生的延伸反应，其一个实例是日本特开2000-316587中描述的方法。

结果，可以在单个试管中，在恒温下一步快速并具有高度特异性地扩增和检测EHEC的stx2 RNA，从而方便了自动化应用。

实施例

尽管下面通过实施例提供了对申请的发明的更详细说明，但是本发明不被这些实施例所限制。

实施例1

使用日本特开2002-253257中描述的寡核苷酸的组合检测了不同拷贝数的肠出血性大肠杆菌(EHEC)stx1 RNA和stx2 RNA。

(1)将含有EHEC stx1 RNA的碱基编号228到1558(RNA的碱基编号根据Calderwoods等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(13)，4364-4368(1997)，GeneBank No.M16625)的标准RNA样品(1337个碱基)通过260nm处紫外吸收定量，然后用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(TakaraBio))从10⁵个拷贝/5μL稀释到10²个拷贝/5μL。仅仅稀释剂用于对照组(阴性对照)。

(2)将含有EHEC stx2 RNA的碱基编号125到1479(RNA的碱基编号根据GeneBank No.X07865)的标准RNA样品(1361个碱基)通过260nm处紫外吸收定量，然后用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))从10⁵个拷贝/5μL稀释到10²个拷贝/5μL。仅仅稀释剂用于对照组(阴性对照)。

(3)具有下面指出的组分的20μL反应液置于0.5mL PCR管(GeneAmp薄壁反应管，Applied Biosystems)，然后向其中加入5μL前述RNA样品。此外，制备溶液制得了第一引物、第二引物、切割用寡核苷酸和用嵌入染料标记的寡核苷酸的组合如表1中所示的组合。

反应液的组分(浓度以30μL最终反应液体积中的浓度显示)

60mM Tris-HCl缓冲液(pH8.6)

17mM氯化镁

100mM氯化钾(对于stx1)或

150mM氯化钾(对于stx2)

6U RNase抑制剂

1mM DTT

0.25mM每一种dATP、dCTP、dGTP和dTTP

3.6mM ITP

3.0mM每一种ATP、CTP、GTP和UTP

0.16μM切割用寡核苷酸

1.0μM第二引物

1.0μM第一引物

25nM嵌入染料标记的寡核苷酸

13％DMSO

用于调节体积的蒸馏水

(3)在44℃(对stx1)或41℃(对stx2)孵育前述反应液5分钟后，加入具有下面指出的组分并在44℃(对stx1)或41℃(对stx2)预热2分钟的5μL酶溶液。

酶溶液的组分(值以30μL最终反应液体积中的浓度显示)

2.0％山梨糖醇

3.6μg牛血清白蛋白

142U T7 RNA聚合酶(Invitrogen)

6.4U AMV反转录酶(LifeScience)

用于调节体积的蒸馏水

(4)随后，使用具有温度控制功能并且能够直接测量PCR管的荧光分光光度计，在激发波长470nm和荧光波长520nm下，随时间测量每个PCR管中的反应液(这些反应液在44℃(对stx1)或41℃(对stx2)被孵育)。

通过将酶的加入时间设定为0分钟，stx1和stx2样品的荧光强度比率(预定时间的荧光强度值+背景荧光强度值)的随时间的变化在图2(A)和2(B)中显示。此外，在图3(C)和3(D)中显示了stx1和stx2样品的对最初RNA量和“上升时间”(荧光比率增加到阴性对照样品的平均值加上3个标准误的和的1.2倍所需要的时间)之间的关系所得结果。此外，对于tx1和tx2，最初的RNA量为10²个拷贝/试验到10⁵个拷贝/试验。

根据图2，在约14分钟检测到stx1 RNA的10²个拷贝，在约17分钟检测到stx2 RNA的10²个拷贝。根据这些结果，日本特开2002-253257中描述的使用寡核苷酸组合检测stx2 RNA表明了与用于检测stx1 RNA的那些寡核苷酸组合相比更慢的检测时间。

表1

组合切割用寡核苷酸第一引物第二引物用嵌入染料标记的寡核苷酸用于stx1 RNA检测VT1-5SVT1-5FVT1-6RYO-VT1-S-G用于stx2 RNA检测VT2-5SVT2-5FVR2-7RYO-VT2-S-G

表1显示了用于实验体系的第一引物、第二引物、切割用寡核苷酸和用嵌入染料标记的寡核苷酸的组合。在图1中显示了检测stx2所用的每一种寡核苷酸组合相应于EHEC的stx2 RNA中寡核苷酸的位点。切割用寡核苷酸的碱基序列的3’末端羟基被胺化。从第一引物的碱基序列的5’末端开始的1位“A”到22位“A”的区域是T7启动子区，随后的从23位“G”到28位“A”的区域是增强子序列。用嵌入染料标记的寡核苷酸在YO-VT1-S-G(SEQ.ID No.9)的5’末端的6位“C”和7位“G”之间，和在YO-VT2-S-G(SEQ.ID No.3)的5’末端的12位“T”和13位“A”之间的磷原子处用嵌入染料标记，3’末端的羟基用乙二醇基团修饰。

切割用寡核苷酸：

VT1-5S(SEQ.ID No.4)

VT2-5S(SEQ.ID No.5)

第一引物：

VT1-5F(SEQ.ID No.6)

VT2-5F(SEQ.ID No.7)

第二引物：

VT1-6R(SEQ.ID No.8)

VT2-7R(SEQ.ID No.2)

嵌入染料标记的寡核苷酸：

YO-VT1-S-G(SEQ.ID No.9)

YO-VT2-S-G(SEQ.ID No.3)

实施例2

使用本申请发明的寡核苷酸的组合检测不同最初拷贝数的EHEC的stx2 RNA。

(1)类似于实施例1，用RNA稀释剂(10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，1mM EDTA，5mM DTT，0.25U/μL RNase抑制剂)(Takara Bio))将EHEC的stx2 RNA从10⁵个拷贝/5μL稀释到10²个拷贝/5μL。仅仅稀释剂用于对照组(阴性对照)。

(2)将具有下面指出的组分的20μL反应液置于PCR管(体积：0.5mL，GeneAmp薄壁反应管，Applied Biosystems)中，然后向其中加入5μL前述RNA样品。

反应液的组分(浓度以30μL的最终反应液体积中的浓度显示)

60mM Tris-HCl缓冲液(pH8.6)

18mM氯化镁

100mM氯化钾

6U RNase抑制剂

1mM DTT

0.25mM每一种dATP、dCTP、dGTP和dTTP

3.6mM ITP

3.0mM每一种ATP、CTP、GTP和UTP

0.16μM切割用寡核苷酸(VT2-12S，SEQ.ID No.10；其3’末端羟基被胺化)

1.0μM第一引物(VR2-12F，SEQ.ID No.11)

1.0μM第二引物(VT2-7R，SEQ.ID No.2)

25nM嵌入染料标记的寡核苷酸(YO-VT2-S-G，SEQ.ID No.3，在5’末端的12位“T”和13位“A”之间的磷原子处用嵌入荧光染料标记，并且其3’末端的羟基被乙二醇基团标记。)

13％DMSO

用于调节体积的蒸馏水

(3)将前述反应液在43℃孵育5分钟后，加入具有下面指出的组分并在43℃预热2分钟的酶溶液。

酶溶液的组分(值以30μL最终反应液体积中的浓度显示)

2.0％山梨糖醇

3.6μg牛血清白蛋白

142U T7 RNA聚合酶(Invitrogen)

6.4U AMV反转录酶(LifeScience)

用于调节体积的蒸馏水

(4)随后，使用具有温度控制功能并且能够直接测量PCR管的荧光分光光度计，在激发波长470nm和荧光波长520nm下，于43℃孵育时随时间测量每个PCR管中的反应液。

通过将酶的加入时间设定为0分钟，样品的荧光强度比率(预定时间的荧光强度值+背景荧光强度值)的随时间的变化在图4(A)中显示。此外，在图4(B)中显示了从最初RNA量和“上升时间”(荧光比率增加到阴性对照样品的平均值加上3个标准误的和的1.2倍所需要的时间)之间的关系所得结果。此外，最初的RNA量为10²个拷贝/试验到10⁵个拷贝/试验。

根据图4，在约14分钟检测到10²个拷贝，表明检测比现有技术的方法更快(日本特开2002-253257和实施例1)。此外，由于本申请的发明中所用的所有寡核苷酸都基于基因型之间没有改变的位点设计(见图1)，所以认为本申请发明的检测方法在特异性方面也优于现有技术(日本特开2002-253257)的方法。

工业可应用性

如上面已经解释的，本申请的发明的检测方法可用于检测肠出血性大肠杆菌的stx2 RNA，而与基因型的差异无关，比现有技术(日本特开2002-253257)中的方法更快且具有更高特异性。

本申请的发明的寡核苷酸不限于序列表中所列的碱基序列(具有20到23个碱基)，而是可以是由这些序列中至少10个相邻碱基组成的核苷酸。这是因为很明显约10个碱基的碱基序列在相对低温(优选43℃)条件下足以保证对引物或探针的目标核酸的特异性。

本领域技术人员将明白尽管将本发明与特定实施方案和实施例一起描述，但是本发明不一定被如此限制并且可以得到与这些实施方案、实施例和用途相偏离但不脱离本申请的发明范围的多种其他实施方案、实施例、用途、修改方案。

                               序列表

<110>东曹株式会社

<120>肠出血性大肠杆菌的志贺菌毒

     素家族基因的检测试剂

<130>R003

<150>JP 2004-026996

<151>2004-02-03

<160>11

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VT2-12F-T7

<400>1

ataccactct gcaacgtgtc gca                                            23

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VT2-7R

<400>2

gtaaggcttc tgctgtgaca                                                20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>YO-VT2-S-G

<400>3

ttaacgccag atatgatgaa                                                20

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VT1-5S

<400>4

aaaaaacatt atttgtcctg ttaacaaatc ctgtcacat                           39

<210>5

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VT2-5S

<400>5

tagaaagtat ttgttgccgt attaacgaac ccggccaca                           39

<210>6

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VT1-5F

<400>6

aattctaata cgactcacta tagggagatt tttatcgctt tgctgatttt tca           53

<210>7

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VT2-5F

<400>7

aattctaata cgactcacta tagggagatt ctaccgtttt tcagatttta cac           53

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VT1-6R

<400>8

tggcgattta tctgcatccc                                                20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>YO-VT1-S-G

<400>9

tgtaacgtgg tatagctact                                                20

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VT2-12S

<400>10

tggtataact gctgtccgtt gtca                                           24

<210>11

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VT2-12F

<400>11

aattctaata cgactcacta tagggagaat accactctgc aacgtgtcgc a             51