抗肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺样毒素Ⅱ基因工程抗体的实验研究

摘要

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7是一种重要的新发人畜共患传染病病原菌。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的近30年中，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHECO157∶H7感染可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagiccolitis，HC)，还可在5～10％的病例中引发溶血性尿毒综合症(hemolyticuremicsyndrome，HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura，TTP)等严重并发症，严重者可导致死亡。EHECO157∶H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性和抗生素治疗可加剧病情的危险性等特点，已经成为全球性的公共卫生问题。我国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。同时，O157∶H7菌培养容易、繁殖迅速、感染力强、感染途径广泛，使之极有可能作为未来军事斗争中的细菌战剂和生物恐怖战剂。美国疾病预防控制中心(CDC)已将EHECO157∶H7菌列为B类生物恐怖病原体严加防范。 目前，EHECO157∶H7的全基因组测序已经完成，但对其感染仍缺乏有效的治疗方法。临床上针对O157∶H7菌的感染主要采用抗生素治疗及相应的对症治疗。新近的研究发现，抗生素使菌体破裂，导致O157∶H7菌志贺样毒素(Shigaliketoxin，Stx)的释放水平大大提高，使得抗生素对病程无明显影响甚至导致病程的延长，从而增加发生并发症的危险并引起死亡。人类同感染性疾病作斗争的历史证明，抗体是治疗某些感染性疾病的首选方法。由于O157∶H7菌的感染易引起暴发流行，且对其感染尚缺乏有效的治疗方法，治疗性抗体的研究就显得尤为紧迫。 EHECO157∶H7主要产生两种毒素，分别称为志贺样毒素Ⅰ(Stx1)和志贺样毒素Ⅱ(Stx2)。在细菌体内，Stx2为分泌型表达，Stx1为胞内表达。两种毒素均由1个A亚单位和5个B亚单位组成，A亚单位具有细胞内毒性，能与28SrRNA作用从而抑制蛋白质合成，是大肠杆菌O157∶H7引起临床表现的病理基础；B亚单位具有细胞结合特性，能与具有特定糖鞘脂受体(Gb3)的细胞结合，从而引导A亚单位发挥作用，是志贺样毒素致病的关键。多数O157∶H7细菌产生Stx2，而且Stx2毒性强于Stx1，与HUS及TTP等严重并发症的相关性更为密切。因此Stx2是该菌致病性的重要物质基础，是理想的制备中和毒素的特异性抗体的靶抗原。 EHECO157∶H7感染致病的机理主要包括两个方面，即在肠道的定植以及产生毒素Stx，Stx可以进入血液循环，引起靶组织器官，如肾小球和结肠内皮细胞的损伤。Stx与其糖鞘脂受体Gb3的特异性结合决定了该毒素的致病性，因此特异性阻止Stx和Gb3受体结合的能中和Stx的抗体可以防止进一步引起病理变化。 基于以上认识，本研究从以下几个方面进行治疗性抗肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺样毒素Ⅱ基因工程抗体的实验研究。 1.O157∶H7全毒素及其亚单位抗原的获得 方法；按Genbank公布的Stx2核酸序列，根据引物设计原则设计了三对引物，以Stx2cDNA为模板，选择合适的PCR反应条件进行扩增。T-A克隆后构建原核表达质粒，经测序鉴定后转化E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导表达。经镍离子亲和层析联合分子筛纯化目的蛋白Stx2A及Stx2B，并经SDS-PAGE、Westernblot、免疫家兔等鉴定重组蛋白的纯度和免疫学活性。通过对HeLa细胞的细胞毒作用及对Balb/c小鼠攻毒实验，鉴定重组蛋白Stx2的生物学活性。结果PCR法自O157∶H7菌基因组分别扩增得到stx2(约1240bp)、stx2a(约890bp)及stx2b(约210bp)的基因片段，片段大小与预期相符。原核表达质粒pET11c-stx2、pET11c-stx2a、pET22b(+)-stx2b经酶切及测序鉴定与GenBank公布的序列完全一致。转化E.coliBL21(DE3)后，经IPTG诱导，Stx2、Stx2A及Stx2B蛋白的表达率分别为25％、30％、30％。破菌后SDS-PAGE证实，Stx2A蛋白以包涵体形式表达，Stx2B蛋白以可溶形式表达。纯化后的Stx2A及Stx2B蛋白，纯度＞85％。Stx2A及Stx2B免疫家兔获得了较高效价的多抗血清，双扩效价分别为1∶16和1∶8。重组蛋白Stx2主要以包涵体形式表达，亦有可溶形式表达。可溶形式表达的Stx2具有与Gb3结合活性，CD50约为35pg，对小鼠的LD100为0.010mg；O157∶H7菌超声破菌上清中的Stx2毒素对HeLa细胞的CD50约为50pg，对小鼠的LD100约为0.050mg，结果表明，在总蛋白浓度相同的条件下，重组工程菌pET11c-stx2/BL21超声破菌上清中的Stx2毒素含量高于野生型O157∶H7菌株的Stx2含量，差异极显著，p＜0.01。结论重组蛋白Stx2A及Stx2B具有免疫学活性，可以替代野生型O157∶H7分泌的天然毒素Stx2蛋白，以用作抗原制备抗Stx2的新型的基因工程抗体。可溶形式表达的重组蛋白Stx2具有生物学活性，可用于O157∶H7感染的基础与临床研究。 2.鼠抗Stx2亚单位单克隆抗体的制备及生物学功能研究 方法；单克隆抗体的制备参照传统杂交瘤技术方法进行，将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与Stx2A(Stx2B-BSA)免疫的Balb/c小鼠的脾脏B淋巴细胞在聚乙二醇(PEG)作用下进行细胞融合，ELISA法筛选出稳定分泌抗Stx2A(Stx2B)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水以获得大量单克隆抗体。采用亲和层析法(蛋白A-Sepharose)纯化腹水IgG，并对其类和亚类及轻链型进行鉴定。SDS-PAGE鉴定IgG纯度，ELISA法检测腹水效价，间接ELISA法测定抗体的亲和常数，Westernblot鉴定单克隆抗体特异性及其作用抗原的分子量，通过非标记ELISA相加试验分析单抗所识别的抗原表位。通过检测抗体体外抑制Stx2对HeLa细胞的细胞毒作用和在小鼠体内中和毒素的实验鉴定抗体的生物学功能。结果获得2株能稳定分泌抗Stx2A抗体的单克隆杂交瘤细胞株，5F3和5C11；2株能稳定分泌抗Stx2B抗体的单克隆杂交瘤细胞株1A4和1A5。将4株细胞分别注入小鼠腹腔，均成功诱生大量腹水。腹水IgG抗体经亲和层析法纯化后纯度均达85％以上。杂交瘤单克隆细胞株5F3、5C11、1A4和1A5分泌的单克隆抗体分别属于IgG1、IgG2a、IgG1和IgG1，轻链均为κ型；亲和常数Ka分别为1.7×109、6.3×108、5.7×107和1.9×107。Westernblot结果表明，单抗5F3、5C11、1A4和1A5均能与野生型O157∶H7超声破菌上清中的天然Stx2毒素蛋白特异结合。4株单抗在体外均能中和野生型O157∶H7菌超声上清中的Stx2毒素，从而抑制Stx2对HeLa细胞的细胞毒作用，与无关抗体1D6比较，差异极显著，p＜0.01；同等剂量的抗体，抑制Stx2对HeLa细胞的细胞毒作用的抑制率不同， 5F3＞5C11＞1A4＞1A5，差异极显著，p＜0.01；50％抑制率时4株单抗的剂量约为0.1～0.25μg。在动物体内，4株单抗均具有一定的中和活性，对Stx2毒素致死小鼠产生免疫性保护，与1D6对照组比较，小鼠的存活率差异极显著，p＜0.01；同等剂量的抗体，对Stx2毒素致死小鼠的免疫保护作用不同，5F3＞5C11＞1A4＞1A5，小鼠的存活率差异极显著，p＜0.01；0.15mg的抗Stx2A抗体5F3在小鼠体内能中和致死剂量的毒素，对Stx2毒素致死小鼠的免疫保护达80％。 结论；4株抗Stx2单抗均具有一定的中和活性，中和活性最强的抗Stx2A单抗5F3可用于构建抗Stx2A单链抗体。 3.抗Stx2A单链抗体的构建及基因结构分析 方法；从杂交瘤细胞5F3中提取总RNA，以oligo(dT)15为随机引物，RT-PCR逆转录生成cDNA，然后采用通用的兼并性引物分别扩增抗体轻、重链可变区基因。将抗体轻、重链可变区基因用一编码(Gly4Ser)3短肽的DNA片段连接成5’VH-Linker-VL3’片段，PCR扩增该片段。纯化后的scFv片段与经改造的载体pCANTAB6his相连，转化E.coliTG1。对抗体基因进行测序，采用生物信息学方法对所得序列与现有已报道的其它各种抗体基因进行同源性比较，并分析其胚系基因来源。对由DNA序列推导的氨基酸序列进行分析并通过分子建模分析其二级结构。 4.抗Stx2A单链抗体在体外、体内中和Stx2的实验研究 方法；重组子转入E.coliHB2151，构建重组工程菌。经IPTG诱导，收集诱导前后的培养上清液、重组工程菌及超声破菌上清液与沉淀。超声上清液和培养上清液经镍离子亲和层析纯化scFv。经SDS-PAGE、Westemblot等鉴定scFv抗体的纯度和特异性。通过检测抗体体外抑制Stx2对HeLa细胞的细胞毒作用和在小鼠体内中和毒素的活性鉴定抗体的生物学功能。 综上所述，，本课题的实施作为本室O157∶H7感染治疗性抗体研究的起步，希望能为这个意义重大的研究课题奠定一定的基础。

目录

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英文缩略表

摘要

前言

第一部分EHEC O157:H7志贺样毒素Ⅱ(Stx2)及其亚单位的克隆、表达与部分生物学活性研究

第二部分抗重组志贺样毒素Ⅱ亚单位(Stx2A、Stx2B)单克隆抗体的制备与生物学功能研究

第三部分抗重组志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位(Stx2A)单链抗体(scFv)的构建与基因结构分析

第四部分抗重组志贺样毒素Ⅱ毒素亚单位(Stx2A)单链抗体(scFv)的表达与生物学功能研究

全文总结

致谢

附图

参考文献

文献综述单链抗体及其在生物医学中的应用

在读期间取得的成果及发表的文章