基于用丙二烯氧合酶将脂质过氧化物酶消除的心脏保护疗法

摘要

本发明涉及与丙二烯氧合酶家族的酶在减少随心肌梗塞、血栓溶解、血管成形术和冠状动脉搭桥术出现的心肌缺血再灌注损伤中的用途有关的方法和组合物。本发明的方法包括给予一种作为有效的心脏保护药物、能消除脂质过氧化物的丙二烯氧合酶。本发明基于下述发现：在严重的全心缺血之后给予丙二烯氧合酶可刺激心脏恢复。

说明书

发明领域

本发明涉及与丙二烯氧合酶家族的酶在减少随心肌梗塞、血栓溶解、血管成形术和冠状动脉搭桥术出现的心肌缺血再灌注损伤中的用途有关的方法和组合物。本发明的方法包括给予一种作为有效的心脏保护药物、能消除脂质过氧化物的丙二烯氧合酶。本发明基于下述发现：在严重的全心缺血(global ischemia)之后给予丙二烯氧合酶可刺激心脏恢复。

背景技术

缺氧的临床术语“缺血”是引起世界上人们死亡的主要原因。导致死亡的缺血的最普遍的形式是由血流中断引起的。心脏病、中风和跌打损伤引起的严重失血是缺血的实例，其引起的死亡数目超过所有死亡数目的50％。

在缺血的临床情况中，即刻的目标是尽可能快的恢复患者的血流。如果血流在适宜的时间周期内恢复，则可以防止组织损伤。然而，明显地延迟血流恢复可导致称为缺血-再灌注损伤的第二种病症。当缺血发作后形成了有害的活性氧时，则会出现再灌注损伤。活性氧通过复杂的、自发的自由基反应而产生，该自由基反应可损害脂质、蛋白质和DNA，并且最终可杀死细胞。细胞膜中的脂质是血液中的氧的主要的早期攻击靶点，所述的氧在极有细胞毒性的脂质过氧化物的形成过程中产生(Kilgore KS和Lucchesi BR.1993，Clin Biochem 26：359-70；Kloner RA.，1993，J Am CollCardiol 21：537-45；Huynh TT等人，1999，J Surg Res 84：223-32；KesavuluMM等人，2001，Diabetes Res Clin Pract 53：33-9)。

缺血-再灌注损伤在缺血事件后可逐渐恶化，并且导致组织不可逆性地损伤。临床实例包括心脏收缩功能障碍、心率失常和在心肌梗塞(心脏病发作)后的不可逆性肌细胞损伤(心肌细胞坏死)。虽然目前没有药物可用于治疗缺血-再灌注损伤，然而如果及时地给予某种治疗，由缺血-再灌注损伤引起的损伤是可以防止和可逆的。临床上最相关的治疗包括给予抗氧剂。内源性抗氧剂如谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶可作为主要的防御机制起作用。另外，饮食性的维生素E在减弱缺血-再灌注损伤中可起次要作用。在再灌注之前或之后给予外源性抗氧剂添加物在实验体系中已经表现出某些效用(Abunasra HJ等人，2001，Eur JCardiothorac Surg.20：153-8；Cuzzocrea S等人，2001，Pharmacol Rev 3月53：135-59；Dhalla NS等人，2000，Cardiovasc Res 47：446-56；Galang N等人，2000，Toxicology 148：111-8；Hangaishi M等人，2001，Biochem Biophys ResCommun 285：1220-5；Kanamasa K等人，2001，Acta Cardiol 56：181-6；Laurindo FR等人，1991，Circulation 83：1705-15；Li Q，2001，Circulation103：1893-8；Prasad K等人，1996，Can J Cardiol 12：1083-91；Rowland RT等人，1995，Surgery 118：446-52；Van Remmen H等人，2001，Am J PhysiolHeart Circ Physiol 281：H1 422-32)。然而，SOD治疗在人临床实验中没有表现出有利的效应(Flaherty JT，1994，Circulation 89：1982-91)。

丙二烯氧合酶由于能快速从体系中清除脂质过氧化物而作为抗氧剂(美国专利US6,132,711；Pan Z等人，1998，J Biol Chem 273：18139-18145)。本发明提供了一种基于给予丙二烯氧合酶而减少缺血-再灌注损伤的方法。

发明简述

本发明涉及与丙二烯氧合酶家族的酶在减少随心肌梗塞、血栓溶解、血管成形术和冠状动脉搭桥术出现的心肌缺血再灌注损伤中的用途有关的方法和组合物。本发明的方法包括给予作为能有效对抗缺血再灌注损伤的心脏保护药物的丙二烯氧合酶。本发明基于下述发现：在严重的全心缺血之后给予丙二烯氧合酶能刺激心脏恢复。

发明详述

本发明提供了含丙二烯氧合酶家族的酶的组合物以及该组合物在预防和/或治疗心血管疾病中的用途。该心血管疾病包括例如心肌梗塞、心绞痛、血栓溶解、血管成形术、冠状动脉搭桥术、血管或心肌缺血以及本领域技术人员公知的涉及心脏或脉管系统的功能障碍或对其的损伤、特别是涉及与细胞毒性的脂质过氧化物的聚集有关的组织损伤的相关病情。

另外，本发明的组合物和方法还可用于治疗与受累的组织中细胞毒性的脂质过氧化物的聚集有关的其它类型的缺血。该缺血包括但不局限于肠系膜、脑(中风)、四肢、眼和肝的缺血。

多数丙二烯氧合酶是已知的，因此可根据已知的方法由已知的原料制备，或者可根据文献中所描述的用于制备丙二烯氧合酶的方法制备。例如，丙二烯氧合酶可按照美国专利US6,132,711中描述的方法重组表达。或者，丙二烯氧合酶可自商业购得。就本发明的目的而言，丙二烯氧合酶家族的任何成员均可被采用，其前提是所选择的酶能降低细胞毒性的脂质过氧化物的水平。

本发明提供了含有丙二烯氧合酶和可药用载体的药物组合物。该载体包括任何适宜的生理溶液或分散剂等，如生理盐水或缓冲生理盐水。载体也可包括例如任意的稀释剂、赋形剂、助悬剂、润滑剂、辅料、载体、传输系统、乳化剂、吸收剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或甜味剂、抗菌剂和抗真菌剂、渗透压调节剂和吸收延迟剂(absorption delayingagents)等。除了那些与活性成分不相容的之外，常规的介质、载体或试剂均可用在本发明的组合物中。

本发明还涉及预防和/或治疗心血管疾病的方法。本发明在外科手术(如冠状动脉搭桥)中特别有用。在这种情形下，丙二烯氧合酶可常规地在手术前以及如果必要的话在手术后给药。丙二烯氧合酶也可在自发性缺血事件后的缺血再灌注之前或期间使用。该自发性事件包括但不局限于患有冠状动脉闭塞的患者。

本发明的方法包括下述步骤：在缺血再灌注损伤之前和/或当时给予患者能降低脂质过氧化物水平的量的丙二烯氧合酶，使丙二烯氧合酶与组织有效接触以减少缺血再灌注损伤。本发明的组合物可采用多种不同的方法给药，所述方法包括但不局限于口服、经肺、非胃肠道(肌内、关节内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、吸入(经由细粉末制剂或细喷雾)、透皮、经鼻、阴道、直肠或舌下给药途径，并且可配制成适于每种给药途径的剂型。

在本发明的优选实施方案中，丙二烯氧合酶在缺血再灌注损伤之前给药，通常是通过将丙二烯氧合酶输注入血流来给药。或者，丙二烯氧合酶在缺血再灌注损伤期间和由缺血再灌注损伤引起的组织损伤晚期(termination)之前给予。当在丙二烯氧合酶在缺血再灌注损伤发生后给予的情形下，应当在该损伤发生的五天内进行给药，更优选在损伤发生后的24小时内给药，最优选在损伤发生后的1小时内给药。

所给予的本发明的组合物的剂量可参考多个参数确定，所述参数包括患者的种属、年龄、体重以及疾病状态和需要表型修饰的特定生理条件。优选选择剂量，以便给药可产生有效的结果，如分子测定或表型修饰所测定的。该测定包括例如心脏功能测定，即收缩压和舒张压、收缩性和心输出量的测定。

6.实施例：丙二烯氧合酶在缺血后刺激心脏机械功能的恢复

6.1.材料和方法

动物

从Charles River实验室获得雄性Wistar大鼠(300-350g)。将动物每个笼子中圈养两只，自由饮食(标准鼠粮)和饮水。本研究中所用的动物按照实验室动物的照顾和使用指南(The guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)，国立卫生研究院，Publ.No.85-23，1986年修订中的建议饲养。

缺血方案

将从预先吸CO₂过量致晕并断头的大鼠中取得的心脏进行灌流和插管，作为工作心脏。简而言之，将心脏迅速切除，放置在冰冷的缓冲液中，立即用含(mM)118 NaCl、4.7 KCl、1.2 KH₂PO₄、1.2 MgSO₄、2.5 CaCl₂、0.5 EDTA、25 NaHCO₃、11葡萄糖、1.75Ca²⁺(pH7.4，通入气体95％O₂-5％CO₂)的Krebs-Henseleit缓冲液经由主动脉逆行灌流。在灌流期间，将心脏修剪去多余的组织，将左心房入口插管。接着将心脏转换至工作模式，在含11mM葡萄糖和1.2mM与3％牛血清白蛋白预先结合的棕榈酸盐的再循环缓冲体系中以11.5mmHg左心房充溢压和80mmH主动脉后负荷进行灌流。心脏用该浓度的脂肪酸灌流，因为它模拟了在随心脏手术出现的缺血和再灌注的临床环境中所观察到的情形。需氧灌流15分钟后，通过夹住左心房充溢和主动脉后负荷的线路使心脏接受30分钟的全心缺血。在缺血后，恢复左心房和主动脉的液流，心脏再灌注30分钟。丙二烯氧合酶在使用时以250μg浓度于再灌注期前15分钟时直接加入灌流液中。当再灌注结束时，从插管上移去心脏并冷冻在液N₂中。使用在线Transonic流量探测器(T206型)和Dig Med Heart PerformanceAnalyzer(HPA-tau型)记录心脏功能。在整个灌注方案中，用水箱套保持灌流液温度为37℃。

统计分析

使用Student t-检验，对组的平均值进行统计学分析。p＜0.05，表示具有显著性差异。所有值以平均值±SEM表示。

6.2.结果

表1显示了ADS对严重全心缺血后的心脏再灌注恢复的作用。在需氧条件下，对照组和丙二烯氧合酶处理组的心脏之间机械功能是相似的。然而，在30分钟严重的无液流缺血后，丙二烯氧合酶对机械功能的恢复是有利的。实际上，在5分钟时加入再灌注，与未经处理的心脏相比，丙二烯氧合酶处理的心脏的收缩压、舒张末期压、收缩性和CO的恢复显著改善。在再灌注期的整个剩余时间内，可观察到丙二烯氧合酶对收缩压、收缩性和心输出量的有益作用。

在接触高浓度棕榈酸盐的缺血心脏的再灌注中典型地观察到的大量氧自由基的出现可导致心脏功能障碍。显而易见，在再灌注发生之前加入丙二烯氧合酶是有益的。

表1.AOS对缺血再灌注恢复的作用

组 HR          PSP        EDP       +dP/dt         -dP/dt         CO(次/min)    (mmHg)     (mmHg)    (mmHg/sec)     (mmHg/sec)     (ml/min)需氧灌注对照+AOS 231±11     104±3     47±2     1898±160       1243±100     41±5223±6      116±4     44±2     2089±124       1372±152     46±25分钟再灌注对照+AOS 174±24     56±18     33±5      743±429       455±193      12±9221±11     112±3^*   48±1^*   2152±157^*    1232±159^*   40±2^*10分钟再灌注对照+AOS 164±3      75±12     41±2     795±494        831±108      10±5210±6      117±7^*   42±4     2149±119^*    1340±177^*   41±4^**20分钟再灌注对照+AOS 172±19     82±11     44±3     1093±359       831±132      17±9221±7      119±4^*   43±1     2472±101^**   1482±140^*   50±4^*30分钟再灌注对照+AOS 190±18     85±8      50±3     1174±241      727±169      16±9234±4^*   118±4^**   42±1     2603±155^**   1650±124^**  56±3^**

数值以每组4只动物的平均值±SEM表示。HR，心率；PSP，收缩压峰值；EDP，舒张末期压；+dP/dt，收缩速率；-dP/dt，舒张速率；CO，心输出量。

*与对照组相比有显著性差异，p＜0.05。

**与对照组相比有显著性差异，p＜0.01。

本发明不局限于此处所描述的具体实施方案的范围。实际上，除了此处描述的方案，根据前面的描述，本发明的各种修改对本领域技术人员来说是显而易见的。这样的修改落在所附的权利要求范围内。此处引用了各种参考文献，其全部内容引入作为参考。