抑制由α4整合素介导的白细胞粘附的杂芳基化合物

摘要

本发明揭示与α4整合素相结合的化合物，其中该α4整合素较佳为VLA－4。某些该些化合物亦可抑制白细胞粘附，尤其是由α4整合素介导的白细胞粘附，其中α4整合素较佳为VLA－4。这类化合物可用于治疗患病的哺乳动物(例如人类)的炎症性疾病，例如哮喘病、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、动脉粥样硬化、AIDS痴呆症、糖尿病、炎症性肠病、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移及心肌局部缺血。这些化合物还可用于治疗炎症性脑病，例如多发性硬化症。

说明书

技术领域

本发明涉及可抑制白细胞粘附且尤其是由α₄整合素介导的白细胞粘附的化合物，其中α₄整合素较佳为VLA-4。

背景技术

在本专利案中以上标号形式来引用下列公开物、专利案及专利申请案：

¹ Hemler和Takada，欧洲专利申请案第330,506号，1989年8月30日公开。

² Elices，等人，Cell，60：577-584(1990)

³ Springer，Nature，346：425-434(1990)

⁴ Osborne，Cell，62：3-6(1990)

⁵ Vedder，等人，Surgery，106：509(1989)

⁶ Pretolani，等人，J.Exp.Med.，180：795(1994)

⁷ Abraham，等人，J.Clin.Invest，93：776(1994)

⁸ Mulligan，等人，J.Immunology，150：2407(1993)

⁹ Cybulsky，等人，Science，251：788(1991)

¹⁰ Li，等人，Arteriosckr.Thromb.，13：197(1993)

¹¹ Sasseville，等人，Am.J.Path.，144：27(1994)

¹² Yang，等人，Proc.Nat.Acad.Science(USA)，90：10494(1993)

¹³ Burkly，等人，Diabetes，43：529(1994)

¹⁴ Baron，等人，J.Clin.Invest.，93：1700(1994)

¹⁵ Hamann，等人，J.Immunology，152：3283(1994)

¹⁶ Yednock，等人，Nature，356：63(1992)

¹⁷ Baron，等人，J.Exp.Med，177：57(1993)

¹⁸ van Dinther-Janssen，等人，J.Immunology，147：4207(1991)

¹⁹ van Dinther-Janssen，等人，Annals.Rheumatic Dis.，52：672(1993)

²⁰ Elices，等人，J.Clin.Invest，93：405(1994)

²¹ Postigo，等人，J.Clin.Invest，89：1445(1991)

²² Paul，等人，Transpl.Proceed.，25：813(1993)

²³ Okarhara，等人，Can.Res.，54：3233(1994)

²⁴ Paavonen，等人，Int.J.Can.，58：298(1994)

²⁵ Schadendorf，等人，J.Path.，170：429(1993)

²⁶ Bao，等人，Diff.，52：239(1993)

²⁷ Lauri，等人，British J.Cancer，68：862(1993)

²⁸ Kawaguchi，等人，Japanese J.Cancer Res.，83：1304(1992)

²⁹ Konradi，等人，PCT/US00/01686，2000年1月21日提出申请。

上述所有公开物的全部内容均如同明确并单独地指明每一单独公开物那样以引用的方式并入本文中。

VLA-4(亦称为α₄β₁整合素及CD49d/CD29)最初由Hemler和Takada¹识别，其为β1整合素类细胞表面受体的一成员，β1整合素的每一成员均包含两个亚单位，即一条α链及一条β链。VLA-4包含一条α4链和一条β1链。整合素至少有9种，其均共有相同的β1链但各具有不同的α链。这9种受体均可与多种细胞基质分子的一种不同补体(例如，纤维连接蛋白、层粘联蛋白、胶原)结合。例如，VLA-4可与纤维连接蛋白结合。VLA-4还可与内皮细胞及其它细胞所表达的非基质分子相结合。这些非基质分子包括VCAM-1，其在培养基中的经细胞因子激活的人类脐静脉内皮细胞上表达。使VLA-4具有纤维连接蛋白和VCAM-1结合活性的抗原决定部位不同，并且已证实每一活性均可独立地加以抑制²。

通过VLA-4及其它细胞表面受体介导的细胞间粘附与许多炎症反应有关。在损伤或其它炎症性刺激部位，激活的血管内皮细胞表达对白细胞具有粘附性的分子。白细胞对内皮细胞粘附的机制部分地与白细胞上的细胞表面受体对内皮细胞上相应的细胞表面分子的识别及结合有关。一旦结合，这些白细胞将移行越过血管壁进入受损部位并释放出化学介质来与感染作斗争。对于免疫系统的粘附受体的评论，参见(例如)Springer³和Osborn⁴。

炎症性脑病，例如实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)、多发性硬化症(MS)及脑膜炎，均为其中内皮/白细胞粘附机制导致对原本健康的脑组织造成破坏的中枢神经系统疾病实例。在这些炎症性疾病中，大量白细胞移行越过血脑屏障(BBB)。白细胞释放有毒介质可引起广泛组织损伤，从而导致神经传导受损和瘫痪。

在其它器官系统中，粘附机制亦会造成组织损伤，从而导致白细胞迁移或激活。例如，已经显示，心肌局部缺血后对心脏造成的初始损伤会因白细胞进入受损组织而进一步恶化，从而引起更进一步的损伤(Vedder等人)⁵。其它由粘附机制介导的炎症性或需治疗的病症包括，(例如)哮喘病^6-8、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化^9-10、AIDS痴呆症¹¹、糖尿病^12-14(包括急性青少年糖尿病)、炎症性肠病¹⁵(包括溃疡性结肠炎和克隆氏病(Crohn’s disease))、多发性硬化症^16-17、类风湿性关节炎^18-21、组织移植²²、肿瘤转移^23-28、脑膜炎、脑炎、中风和其它大脑创伤、肾炎、视网膜炎、异位性皮肤炎、干癣、心肌局部缺血及白细胞介导的急性肺部损伤(例如在成人呼吸窘迫症候群中发生的损伤)。

已揭示，经取代的氨基嘧啶，作为一类化合物，可抑制VLA-4与VCAM-1的结合，因此呈现抗炎症的特性。²⁹尽管这些化合物对此类结合具有拮抗性，但这些化合物的生物利用率提高将会增强其效能。

发明内容

本发明涉及以下发现：与先前揭示的其它经取代的氨基嘧啶化合物相比，当通过其AUC测量时，某些N-[2-N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺酰基苯基嘧啶-4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸化合物具有出乎意料高的生物利用率。

在其组合物的一个方面中，本发明涉及一式(I)化合物：

其中每一X均独立为氟、氯或溴；

p为0或一从1到3的整数；

R¹选自由甲基和乙基组成的群组；

R²选自由低碳烷基、低碳烯基和低碳亚烷基环烷基组成的群组；

及其医药上可接受的盐。

在一较佳实施例中，本发明提供若干式(II)化合物：

其中每一X均独立选自由氟和氯组成的群组；

m为一等于1或2的整数；

R²选自由低碳烷基、低碳烯基和低碳亚烷基环烷基组成的群组；

及其医药上可接受的盐。

在一尤其较佳实施例中，本发明提供式(III)化合物：

其中每一X均独立为氟或氯；

n为0或1；

R²为-CH₂-R′，其中R′选自由氢、甲基或-CH＝CH₂组成的群组；

及其医药上可接受的盐。

在另一尤其较佳实施例中，本发明提供式(IV)化合物：

其中每一X均独立为氟、氯或溴；

p为0或一从1到3的整数；

R¹选自由甲基和乙基组成的群组；

R²为低碳炔基；

及其医药上可接受的盐。

在再一尤其较佳实施例中，本发明提供式(V)化合物：

其中每一X均独立选自由氟和氯组成的群组；

m为一等于1或2的整数；

R²为低碳炔基；

及其医药上可接受的盐。

在另一尤其较佳实施例中，本发明提供式(VI)化合物：

其中每一X均独立为氟或氯；

n为0或1；

R²为低碳炔基；

及其医药上可接受的盐。

在式IV、V或VI中的任一式中R²较佳为炔丙基。

本发明所涵盖的N-[2-N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺酰基苯基嘧啶-4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸化合物包括下表I所列的那些：

                            表I

本发明所涵盖的具体化合物包括以下化合物。下文所用的这些化合物是基于丙酸衍生物命名，但这些化合物也可基于N-[2-N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺酰基苯基-嘧啶-4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸衍生物衍生物命名。

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氯苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(2-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰基氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(3-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)异丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺酰基)异丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰基氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺酰基)异丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)环丙基甲基-氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氯苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氯苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)-正丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)烯丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)异丁氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)-正丁氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(2，6-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(2，3-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)炔丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺酰基)炔丙基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)-(2-三氟乙基)-氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

及其医药上可接受的盐。

另一方面，本发明提供若干包含一医药上可接受载剂及一治疗有效量的本文所定义化合物的医药组合物。

在其一方法方面中，本发明涉及一种用于治疗一患者至少部分由α₄整合素(较佳VLA-4)介导的疾病的方法，该方法包括投予一包含一医药上可接受的载剂及一治疗有效量的本发明化合物的医药组合物。

本发明的化合物及医药组合物可用于治疗至少部分由α₄整合素(较佳VLA-4)或白细胞粘附介导的疾病状况。该类疾病状况包括，例如，哮喘病、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、AIDS痴呆症、糖尿病(包括急性青少年糖尿病)、炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎和克隆氏病)、多发性硬化症、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移、脑膜炎、脑炎、中风和其它大脑创伤、肾炎、视网膜炎、异位性皮肤炎、干癣、心肌局部缺血及白细胞介导的急性肺部损伤(例如在成人呼吸窘迫症候群中发生的损伤)。

其它病症包括(但不限于)炎症性疾病，例如，结节性红斑、过敏性结膜炎、视神经炎、葡萄膜炎、过敏性鼻炎、强直性脊椎炎、干癣性关节炎、血管炎、莱特尔综合征(Reiter′s syndrome)、系统性红斑狼疮、进行性系统性硬化症、多肌炎、皮肌炎、韦格纳氏肉牙肿病(Wegner′s granulomatosis)、主动脉炎、类肉瘤病(sarcoidosis)、淋巴细胞减少症、颞动脉炎、心包炎、心肌炎、充血性心脏衰竭、结节性多动脉炎、过敏综合征、过敏症、嗜酸细胞过多综合征、Churg-Strauss综合征、慢性阻塞性肺病、过敏性肺炎、慢性活动性肝炎、间质性膀胱炎、自体免疫性内分泌衰竭、原发性胆汁性肝硬化、自体免疫性再生障碍性贫血、慢性迁延性肝炎及甲状腺炎。

在一较佳实施例中，该由α₄整合素介导的病症为一炎症性疾病。

具体实施方式

如上述，本发明涉及可抑制白细胞粘附并且尤其是至少部分由α₄整合素(较佳VLA-4)介导的白细胞粘附的化合物。然而，在进一步详细阐述本发明之前，首先定义以下术语。

除非另有说明，否则在说明书及专利申请范围中所用的以下术语具有以下涵义：

本文所用“低碳烷基”指具有1至5个碳原子的单价烷基基团，其包括直链及具支链的烷基基团。该术语可用(例如)甲基、乙基、异丙基、正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基等基团来举例说明。“低碳烷基”可视情况用一卤素(例如氯、氟、溴等)取代。

本文所用“低碳亚烷基”指具有1至4个碳原子的二价亚烷基基团，其包括直链及具支链的亚烷基基团。该术语可用(例如)亚甲基、亚乙基、正亚丙基、异亚丙基、(-CH₂CH(CH₃)-及-CH(CH₃)CH₂-)等基团来举例说明。

术语“低碳炔基”指一较佳具有2至6个碳原子且具有至少1个(较佳仅1个)炔基不饱和位点(即，-C≡C-)的炔基基团。该术语可通过(例如)乙炔基(-C≡CH)、炔丙基(-CH₂-C≡CH)、3-丁炔基(-CH₂CH₂C≡CH₃)等基团来举例说明。

“低碳环烷基”指具有一单环的3至6个碳原子的环烷基基团，其包括(例如)环丙基、环丁基、环戊基及环己基。

术语“低碳亚烷基环烷基”指由如本文所定义的一低碳亚烷基-低碳环烷基组成的基团。该类基团可用亚甲基环丙基(-CH₂-环丙基)、亚乙基环丙基等来举例说明。

“医药上可接受的载剂”指一可用于制备一医药组合物的载剂，其通常安全、无毒并且在生物学上及其它方面皆无不良后果，包括一可满足兽医应用以及人类医药应用要求的载剂。说明书及权利要求书中所用的“一医药上可接受的载剂”包括一种或一种以上该载剂。

“治疗”一疾病包括：

(1)预防该疾病，即，使一暴露于该疾病下或易感染该疾病但尚未患病或尚未表现出该疾病症状的哺乳动物该疾病的临床症状不再发展。

(2)抑制该疾病，即，阻止或减轻该疾病的发展或其临床症状；或

(3)减轻该疾病，即，使该疾病或其临床症状消退。

一“治疗有效量”指，当投予一哺乳动物用以治疗一疾病时，一化合物足以实现该疾病的上述治疗的量。该“治疗有效量”将视该化合物、该疾病及其严重程度以及待治疗的哺乳动物的年龄、体重等情况而不同。

“医药上可接受的盐”指一式I化合物的医药上可接受的盐，该些盐来源于多种在此项技术中习知的有机和无机抗衡离子，包括(仅举例而言)钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等；并且当该分子包含一碱性官能团时，指有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。

整合素是一大类同源跨膜联接蛋白，其为动物细胞上用于与大多数细胞外基质蛋白(例如胶原、纤维连接蛋白、层粘联蛋白)结合的主要受体。整合素为由一α链与一β链构成的异源二聚体。迄今，人们已经鉴别出20种不同的整合素异源二聚体，它们由9种不同的α亚单位及14种不同的β亚单位构成。术语“α₄整合素”指异源二聚体类酶联细胞表面受体，其包含与这些β亚单位中的任一个配对的α₄亚单位。VLA-4是一α₄整合素的实例，并且是α₄和β₁亚单位的异源二聚体，其亦称为α₄β₁整合素。

化合物制备

本发明化合物可用以下实例中阐明的方法和程序由易获得的起始材料制得。这些方法和程序概括说明了制备N-(2-[N′，N′-二乙氨基-5-氨基磺酰基苯基嘧啶-4-基]-p-甲酰氧基-苯丙氨酸化合物的特定反应方案。涵盖于本发明但在这些实例和方法中未举例说明的化合物可通过购得的或此项技术中习知的起始材料的适当替换而容易地制得。

用于制备本发明化合物的其它程序和反应条件将在以下述实例中加以阐述。另外，可用于制备在本发明某些方面中有用的化合物的其它程序揭示于美国专利第6,492,372号中；该专利案的揭示内容以引用的方式并入本文中。

医药调配物

当作为药物使用时，本发明的化合物通常以医药组合物的形式投与。这些组合物可通过包括经口、经直肠、经皮肤、经皮下、经静脉内、经肌内及经鼻内在内的多种途径投与。这些组合物通过注射和口服二者均有效。该类组合物可用制药技术中熟知的一种方法制备且其包含至少一种活性化合物。

本发明亦涵盖含有一或多种与医药上可接受载剂联合的上述式I-VII化合物作为活性成分的医药组合物。在制备本发明组合物时，通常将该活性成分与一赋形剂混合，用一赋形剂稀释或将入一可为胶囊、小袋、纸或其它容器形式的载剂中。所用赋形剂通常是一适合投予人类受试者或其它哺乳动物的赋形剂。当该赋形剂用做一稀释剂时，其可为一固体、半固体或液体材料，对活性成分起媒剂、载剂或媒介的作用。因此，这些组合物可呈片剂、九剂、散剂、含片、小袋、药丸、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、气溶胶(作为固体或在液体媒介中)、软膏(包含例如多达10重量％的活性化合物)、软质明胶及硬质明胶胶囊、栓剂、无菌可注射溶液、无菌包装的粉末的形式。

在制备一调配物时，该活性化合物在与其它成分混合之前可能需磨细以提供适合的粒径。如果该活性化合物实质不溶，则通常将其磨细至粒径小于200网目。如果该活性化合物实质可溶于水，则一般通过磨细将粒径调节至使得其在调配物中可实质均匀分布，例如约40网目。

适宜赋形剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、磺蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆及甲基纤维素。这些调配物可另外包括：润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸镁及矿物油；润湿剂；乳化及悬浮剂；防腐剂，例如羟基苯甲酸甲酯及羟基苯甲酸丙酯；增甜剂；及调味剂。本发明的组合物可采用此项技术中熟知的方法调配成在投予患者后能实现活性成分的快速、持久或延迟释放。

较佳将这些组合物调配成单位剂量形式，每一剂量含约5至约100mg且更通常约10至约30mg的活性成分。术语“单位剂量形式”指适宜作为单一剂量用于人类受试者或其它哺乳动物的物理分立单位，每一单位含一经计算与一适宜医药赋形剂联合可产生期望治疗效果的预定量的活性材料。

该活性化合物的有效剂量范围甚广，并且通常以一在医药上有效的量投与。然而，应了解，该化合物的实际投与量将由医生根据包括下列的相关情况决定：欲治疗的病症、所选投药途径、实际投与的化合物、个体患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度等。

对于制备例如片剂等固体组合物，可将主要活性成分与一医药赋形剂混合以形成一包含本发明一化合物的均匀混合物的固态预调配组合物。当将这些预调配组合物称为均匀时，是指该活性成分均匀地扩散至该组合物各处，使得该组合物可容易地细分成等效单位剂型，例如，片剂、丸剂及胶囊。然后，将此固态预调配物细分成上述类型的单位剂型，其包含(例如)0.1至约500mg的本发明活性成分。

本发明的片剂或丸剂可经包覆或以另外的方式配制，以提供一具有持久作用的优点的剂型。例如，该片剂或丸剂可包含一内部剂量组份及一外部剂量组份，后者呈一包膜形式包覆于前者的表面上。这两种组份可通过一肠溶性层分开，该肠溶性层用以抵抗胃内的分解作用，从而允许内部组份完整地进入十二指肠或延迟释放。该类肠溶性层或包衣可使用多种材料，包括大量聚合酸及聚合酸与虫胶、十六烷醇及乙酸纤维素等材料的混合物。

本发明新颖组合物可掺配成液体形式供经口或注射投与，其形式包括水溶液、经适当调味的糖浆、水性或油性悬浮液及具有可食用油(例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)的经调味乳剂以及酏剂及类似的医药媒剂。

供吸入或喷入用的组合物包括在医药上可接受的水性或有机溶剂中的溶液和悬浮液或其混合物及粉末。这些液体或固体组合物可包含如上文所述的在医药上可接受的适当赋形剂。这些组合物较佳通过口或鼻呼吸的途径投与以获得局部或全身效果。在较佳医药上可接受的溶剂中的组合物可通过使用惰性气体雾化。经雾化的溶液可从雾化装置直接吸入或可将该雾化装置附装至一面罩帷罩或间歇式正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可较佳从以恰当方式递送调配物的装置以经口或经鼻方式投与。

以下调配物实例可说明本发明的医药组合物。

                     调配物实例1

制备包含以下成分的硬质明胶胶囊：

                                   数量

成分                             (mg/胶囊)

活性成分                           30.0

淀粉                               305.0

硬脂酸镁                           5.0

将以上成分混合并按照340mg的量充入硬质明胶胶囊。

                     调配物实例2

用以下成分制备一片剂调配物：

                                   数量

成分                             (mg/片)

活性成分                           25.0

微晶纤维素                         200.0

胶状二氧化硅                       10.0

硬脂酸                             5.0

将该些组份混合并压制成片剂，每片重240mg。

                     调配物实例3

制备一包含以下组份的干燥粉末吸入器调配物：

成分                            重量％

活性成分                           5

乳糖                               95

将活性混合物与乳糖混合并添加入一干燥粉末吸入器具。

                     调配物实例4

按下述制备每片含30mg活性成分的片剂：

                                   数量

成分                             (mg/片)

活性成分                           30.0mg

淀粉                               45.0mg

微晶纤维素                         35.0mg

聚乙烯吡咯烷酮

(10％水溶液)                       4.0mg

羧甲基淀粉钠                       4.5mg

硬脂酸镁                           0.5mg

滑石粉                             1.0mg

合计                               120mg

使活性成分、淀粉及纤维素通过20号网目美国筛并充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与所得粉末混合，然后使其通过16网目美国筛。将这样制得的颗粒在50℃至60℃下干燥并使其通过16网目美国筛。将预先通过30网目美国筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁及滑石粉添加至该些颗粒中，混合后，在一制片机上将其压制，得到每片重120mg的片剂。

                     调配物实例5

按下述制成每粒含40mg药物的胶囊：

成分                             数量(mg/胶囊)

活性成分                           40.0mg

淀粉                               109.0mg

硬脂酸镁                           1.0mg

合计                               150.0mg

将活性成分、淀粉及硬脂酸镁混合，使其通过一20号网目美国筛，再以150mg的量充入硬质明胶胶囊中。

                     调配物实例6

按下述制成每支包含25mg活性成分的栓剂：

成分                             数量

活性成分                           25mg

饱和脂肪酸甘油酯                   2,000mg

使活性成分通过一60网目美国筛，并悬浮于预先用最少所需热量熔化的饱和脂肪酸甘油脂中。然后将该混合物注入一标称容量为2.0g的栓剂模具中并使其冷却。

                     调配物实例7

按下述制成每5.0mL剂量包含50mg药物的悬浮液

成分                             数量

活性成分                           50.0mg

黄原胶                             4.0mg

羧甲基纤维素钠(11％)

微晶纤维素(89％)                   50.0mg

蔗糖                               1.75g

苯甲酸钠                           10.0mg

调味剂及颜料                       适量

纯水至                             5.0ml

将药物、蔗糖及黄原胶混合，使其通过一10号网目美国筛，然后与一预先配制的微晶纤维素与羧甲基纤维素钠的水溶液混合。将苯甲酸钠、调味剂及染色剂用一些水稀释，边添加边搅拌。然后添加足量的水以得到所需体积。

                     调配物实例8

                                   数量

成分                             (mg/胶囊)

活性成分                           15.0mg

淀粉                               407.0mg

硬脂酸镁                           3.0mg

合计                               425.0mg

将活性成分、淀粉及硬脂酸镁混合，使其通过一20号网目美国筛，再以425mg的量充入硬质明胶胶囊中。

                     调配物实例9

按下述可制备一静脉内调配物

成分                             数量

活性成分                           250.0mg

等渗盐水                           1000mL

                     调配物实例10

按下述可制备一局部用调配物：

成分                             数量

活性成分                           1至10g

乳化蜡                             30g

液体石蜡                           20g

白色软石蜡                         2至100g

将白色软石蜡加热至熔化。纳入液状石蜡及乳化蜡并搅拌至溶解。向其中添加活性成分并继续搅拌至散开。然后将该混合物冷却成固体。

本发明方法中采用的另一较佳调配物使用经皮递药装置(“贴片”)。该类经皮贴片可用来以经控制数量连续或不连续输注本发明化合物。递送药剂用的经皮贴片的制造及使用方法在此项技术中为人熟知。参见(例如)1991年6月11日颁布的美国专利第5,023,252号，其以引用的方式并入本文中。该类贴片可制造成用于持续地、间断地或按需要递送药剂。

当期望或需要将医药组合物导入大脑时，可使用直接或间接放置技术。直接技术通常涉及将一药物递送管置于受试者的脑室系统中来绕过血脑屏障。美国专利第5,011,472号揭示一用来将生物学因子输送至身体的特定解剖学区域的此类可植入递药系统，该专利案以引用的方式并入本文中。

通常较佳的间接技术一般涉及通过将亲水性药物转变成脂溶性药物而将该组合物调配成可提供药物潜伏化作用。潜伏化作用通常通过阻断药物中的羟基、羰基、硫酸根及伯氨基基团来实现以使药物更易溶于脂质中且更易穿过血脑屏障。或者，亲水性药物的递送可通过静脉内输注能迅速打开血脑屏障的高渗溶液来增强。

功用

本发明化合物可通过竞争性地结合α₄整合素(较佳VLA-4)来抑制活体内至少部分由α₄整合素(其中该α₄整合素较佳为VLA-4)介导的白细胞对内皮细胞的粘附。因此，本发明化合物可用于治疗哺乳动物由α₄整合素(其中该α₄整合素较佳为VLA-4)或白细胞粘附介导的疾病。这些疾病包括哺乳动物患者的炎症性疾病，(例如)哮喘病、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、AIDS痴呆症、糖尿病(包括急性青少年糖尿病)、炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎及克隆氏病)、多发性硬化症、类风湿性关节炎、组织移植、肿瘤转移、脑膜炎、脑炎、中风和其它大脑创伤、肾炎、视网膜炎、异位性皮肤炎、干癣、心肌局部缺血及急性白细胞介导的肺部损伤(例如在成人呼吸窘迫症候群中发生的损伤)。

投予哺乳动物患者的药量将视所投与药物、投药目的(例如预防或治疗)、患者状况、投与方式等而有所不同。在治疗应用中，将组合物以一足以治愈或至少部分阻止该疾病及其并发症的症状的量投予一已患病患者。一足以达成此目的的量定义为“治疗有效剂量”。对此用途有效的药量将取决于所治疗疾病以及临床主治医师依照(例如)炎症的严重程度、患者的年龄、体重及综合情况等作出的判断。

投予患者的组合物呈上述医药组合物的形式。这些组合物可通过常规的灭菌技术灭菌或可过滤灭菌。所得水性溶液可于包装后按原样使用或冻干，投药前再将此冻干制剂与一无菌水性载剂组合。该化合物制剂的pH值通常介于3与11之间，较佳为5至9且最佳为7至8。应了解，使用某些上述赋形剂、载剂或稳定剂将会导致形成医药盐。

本发明化合物的治疗剂量将视(例如)所进行的治疗的特定用途、该化合物的投药方式、患者的健康状况和状态及处方医师的判断而不同。例如，对于静脉内投药，该剂量通常介于约20μg至约500μg/千克体重之间，较佳为约100μg至约300μg/千克体重。鼻内投药之适宜剂量范围通常为约0.1pg至1mg/千克体重。有效剂量可从得自活体内或动物模型测试系统的剂量反应曲线推知。

以下合成及生物学实例意欲举例说明本发明，而无论如何不能将其理解为限制本发明的范围。除非另有说明，否则所有温度都是以摄氏温度表示。

                       实例

在下面实例中，下列缩写具有以下涵义。如果有的缩写未加以定义，则其具有公认的涵义。

AUC＝曲线下面积

BSA＝牛血清白蛋白

DMAP＝4-N，N-二甲氨基吡啶

DMSO＝二甲基亚砜

EDC＝1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚氨盐酸盐

EDTA＝乙二胺四乙酸

EtOAc＝乙酸乙酯

EtOH＝乙醇

bd＝宽双峰

bs＝宽单峰

d＝双峰

m＝多峰

t＝三峰

s＝单峰

eq or eq.＝当量的

FACS＝荧光激活细胞分选仪

FITC＝异硫氰酸荧光素

Fmoc＝N-(9-芴甲氧羰基)

FmocONSu＝N-(-9-芴甲氧羰基)-琥珀酰亚胺

g＝克

i.p.＝腹膜内的

h＝小时

HBSS＝翰克司平衡盐溶液(Hank′s Balanced Saline Solution)

HEPES＝4-(2-羟乙基)-1-哌嗪-乙磺酸

HOBT＝1-羟基苯并三唑水合物

hr＝小时

IgG Fc＝免疫球蛋白的一结合域

kg＝千克

LCMS＝液相色谱质谱法

L＝升

m＝米

M＝摩尔(Molar)

Hct＝细胞比容或一定容积的血样中通过离心获得的迭集红细胞的量度

HB＝血红蛋白

MCH＝平均红细胞血红蛋白含量；Hb/RBC

MCHC＝以百分数表示的平均红细胞血红蛋白计数；Hb/Hct.

MCV＝平均红细胞体积；红细胞的平均体积，通常每个红细胞的立方微米数表示

RBC＝红细胞计数

MeOH＝甲醇

mg＝毫克

mL＝毫升

mm＝毫米

mM＝毫摩尔(millimolar)

mol＝摩尔

mmol＝毫摩尔

mp＝熔点

mpk＝毫克/千克

N＝当量

NaOEt＝乙醇钠

NMM＝N-甲基吗啉

OtBu＝叔丁氧基

PBS++＝磷酸盐缓冲盐水

Phe＝L-苯丙氨酸

Pro＝L-脯氨酸

psi＝磅/平方英寸

q.s.＝补足体积

Rf＝保持系数

rpm＝每分钟转数

rt＝室温

sat＝饱和的

t-BuOH＝叔丁醇

TFA＝三氟乙酸

THF＝四氢呋喃

TLC或tlc＝薄层色谱法

TYR＝酪氨酸

μL＝微升

μM＝微摩尔(micromolar)

μg＝微克

V_t＝总体积

WBC＝白细胞

w/w＝重量/重量

w/v＝重量/体积

v/v＝体积/体积

                       实例1

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

概要：用一Biotage Flash 75L和800克KP-Sil二氧化硅管柱(32-63μM，60埃，500-550m²/g)进行快速色谱法。记录分析性薄层色谱的R_f，正向用EM Science SilicaGel F(254)250μM厚板，反相用Watman MKC18F 200μM厚板。

步骤1：制备2，4-二氯-5-硝基嘧啶。

依照Whittaker(J.Chem.Soc.1951，1565)的程序将5-硝基尿嘧啶用磷酰氯和N，N-二甲基苯胺处理，得到标题化合物，其亦可从City Chemical(West Haven，CT)获得。

步骤2：制备2-(2-二乙氨基-5-硝基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸叔-丁基酯。在-10℃下向2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸(30.6g，0.129mol)溶于THF(250mL)之溶液内添加2，4-二氯-5-硝基嘧啶(25g，0.129mol)，在添加期间保持温度低于5℃。添加结束后，随即滴加N，N-二异丙基乙氨(33.7mL，0.194mol)。在-10℃下搅拌1小时后，缓慢添加入二乙氨(66.73mL，0.645mol)，然后将反应混合物加热至室温过夜。将反应混合物用二乙基醚(500mL)稀释，并用0.2N柠檬酸(3×150mL)、水(1×150mL)及10％K₂CO₃(3×150mL)洗涤有机层。对有机层进行干燥(Na₂SO₄)、过滤及真空浓缩，得到一黄色残余物。将该残余物通过快速色谱法(在硅胶上用20％EtOAc/己烷)纯化生成37.39g(67％)黄色泡沫状的标题化合物。R_f＝0.21(在硅胶上用25％EtOAc/己烷)。

步骤3：制备2-(2-二乙氨基-5-硝基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯。

向2-(2-二乙氨基-5-硝基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸叔-丁基酯(31.80g，0.074mol)溶于CH₂Cl₂(600mL)的溶液中添加DMAP(9.00g，0.074mol)。5分钟后，滴加三乙氨(10.23mL，0.074mol)。滴加N，N-二甲基氨甲酰氯(13.83mL，0.110mol)并将反应物回流加热过夜。对反应混合物进行真空浓缩并用EtOAc(1L)吸收。将有机相用0.5M柠檬酸(3×250ml)、饱和NaHCO₃(3×250mL)、盐水(1×250mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，过滤并真空浓缩后生成37.0g(99％)的白色固体状标题化合物。

步骤4：制备2-(2-二乙氨基-5-氨基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯。

将2-(2-二乙氨基-5-硝基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯(37.0g，0.073mol)和10％Pd/C(3.8g，10重量％Pd)溶于EtOH(250mL)中的混合物在60psi氢气下摇动，直到TLC(在硅胶上用50％EtOAc/己烷)显示100％转化成产物(48小时)。然后将反应混合物滤过一硅藻土塞并真空浓缩，生成32.0g(92％)紫色泡沫状标题化合物。

步骤5：制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯。用干冰/CH₃CN浴将2-(2-二乙氨基-5-氨基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯(32.0g，0.067mol)的吡啶(120mL)溶液冷却至-20℃。将混合物搅拌30分钟，然后缓慢添加p-氟苯磺酰氯(13.18g，0.067mol)。在-20℃下将反应物搅拌4.5小时后，然后添加3-二甲基氨基丙氨(8.52mL，0.067mol)，然后将混合物加热至室温过夜。对反应物进行真空浓缩。将残余物用EtOAc(1L)吸收，并用0.5M柠檬酸(3×900mL)、水(1×900mL)、饱和NaHCO₃(3×900mL)、盐水(1×900mL)洗涤，干燥(MgSO₄)、过滤并真空浓缩后，生成一褐色残余物。将该残余物通过快速色谱法(在硅胶上用50％EtOAc/己烷)纯化生成33.04g(77％)黄色泡沫状的标题化合物。R_f＝0.54(在硅胶上用3∶2EtOAc/己烷)。

步骤6：制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯。向2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基-氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯(33.04g，0.052mol)溶于丙酮(510mL)的溶液中添加K₂CO₃(8.69g，0.063mol)，并在室温下搅拌该混合物10分钟。缓慢添加硫酸二甲酯(5.95mL，0.063mol)，并在室温下搅拌反应混合物过夜。对反应混合物进行真空浓缩，残余物用EtOAc(600mL)吸收。将有机相用水(2×400mL)、盐水(2×400mL)洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。通过快速色谱法(在硅胶上使用2∶1己烷/EtOAc)纯化残余物，生成28.69g(85％)白色固体状标题化合物。

步骤7：制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸盐酸盐。将2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)-甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯(28.69g，0.044mol)的甲酸(500mL)溶液加热至70℃两小时，然后进行真空浓缩。将残余物再次溶解至甲酸(500mL)中，然后再在70℃下加热2小时，随后再真空浓缩。将残余物再次溶解于甲酸(500mL)中，并再在70℃下加热1小时。混合物的体积减少90％，然后将其用1.0M盐酸(44mL，0.044mol)及蒸馏水(490mL)处理。将所得均质溶液在真空下浓缩，然后添加入蒸馏水(100mL)，将此均质溶液低压冻干14天以上后生成26.76g(96％)白色固体状标题化合物。

¹H NMR(CD₃OD)δ7.96-7.92(m，2H)，7.45-7.25(m，4H)，7.06-6.95(m，3H)，5.00-4.93(m，1H)，3.55-3.40(m，5H)，3.34-3.20(m，，2H)，3.15-3.05(m，5H)，3.07-3.00(m，3H)，1.22(bs，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ171.6，168.3，154.5，144.4，137.9，135.1，135.0，134.1，125.5，120.6，120.3，39.6，39.2，39.1，15.2

MS m/z 589(MH⁺)

                       实例2

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用4-氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ7.88-7.85(m，2H)，7.72-7.69(m，2H)，7.39-7.25(m，2H)，7.14-6.92(m，3H)，5.00-4.85(m，1H)，3.60-3.50(m，1H)，3.37-3.28(m，6H)，3.15-3.07(m，6H)，3.01(bs，3H)，1.22(bs，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)d 208.6，145.3，134.9，128.8，124.9，124.5，124.4，116.3，50.2，30.4，30.0，6.0 MS m/z 605(MH⁺)

                       实例3

制备2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用3，4-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ7.84-7.77(m，1H)，7.67(bs，1H)，7.58-7.53(m，1H)，7.37-7.34(m，1H)，7.22-7.18(m，1H)，7.08-7.02(m，3H)，4.83-4.76(m，1H)，3.55-3.54(m，4H)，3.35-3.33(m，1H)，3.23-3.12(m，6H)，3.03-2.99(m，3H)，1.19(bs，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ178.3，177.8，163.2，162.6，159.3，159.1，155.9，155.7，154.3，153.0，152.5，152.4，138.4，138.1，134.0，129.5，125.3，122.4，122.2，121.7，121.4，115.3，59.3，46.0，42.4，41.9，40.4，39.9，39.2，39.1，15.76

MS m/z 607.2(MH⁺)

                       实例4

制备2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氯苯磺酰基)甲氨基]嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用3，4-二氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.00-7.98(m，1H)，7.83-7.74(m，2H)，7.37-7.34(m，1H)，7.21-7.20(m，1H)，7.10-7.02(m，3H)，4.85-4.83(m，1H)，3.55-3.53(m，2H)，3.35-3.33(m，1H)，3.21-3.12(m，6H)，3.04-2.99(m，6H)，1.19(bs，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ176.4，166.2，161.7，161.2，158.0，157.8，152.8，151.5，150.5，140.2，139.8，139.5，136.8，135.8，133.9，132.6，132.0，129.8，123.8，113.7，113.4，57.8，44.6，40.8，40.4，38.7，38.3，37.7，37.5，14.1

MS m/z 639.1(MH⁺)

                       实例5

制备2-{2-二乙氨基-5-[(苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.14(bs，1H)，(7.85-7.84(m，1H)，7.8-7.78(m，1H)，7.69-7.66(m，2H)，7.40-7.37(m，1H)，7.21-7.195(m，1H)，7.04-7.03(m，2H)，7.95-7.90(m，1H)，5.52(bs，1H)，3.54-3.53(m，2H)，3.36-3.33(m，6H)，3.13-3.12(m，3H)，3.01-3.00(m，3H)，1.20-1.17(m，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ165.9，152.8，136.7，135.8，132.6，131.6，130.2，123.8，44.7，37.5，14.0

MS m/z 571.2(MH⁺)

                       实例6

制备2-{2-二乙氨基-5-[(2-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用2-氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.31(bs，1H)，7.94-7.85(m，2H)，7.57-7.44(m，3H)，7.34-7.30(m，1H)，7.15-7.12(m，2H)，5.00-4.85(1H)，3.63-3.62(m，4H)，3.50-3.42(m，1H)，3.34-3.30(m，4H)，3.29-3.22(m，4H)，3.11-3.10(m，2H)，1.28(bs，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ176.5，166.4，163.1，160.4，159.7，157.7，152.8，151.5，150.7，138.5，138.3，136.7，133.7，132.5，132.2，127.1，123.7，119.9，119.6，113.4，57.8，44.6，40.6，39.0，38.4，37.7，37.5，14.1

                       实例7

制备2-{2-二乙氨基-5-[(3-氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用3-氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.15-8.12(bs，1H)，7.72-7.68(m，1H)，7.63-7.60(m，1H)，7.53-7.52(m，1H)，7.38-7.35(m，1H)，7.21-7.20(m，1H)，7.10-6.99(m，3H)，4.87-4.86(m，1H)，3.54-3.53(m，4H)，3.35-3.34(m，3H)，3.15-3.12(m，4H)，3.05-3.00(m，4H)，1.20(bs，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ166.1，153.1，136.9，134.1，132.8，126.5，124.1，123.2，122.9，117.7，117.4，103.4，45.0，38.0，14.3

MS m/z 589.2(MH⁺)

                       实例8

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)异丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2及3按照实例1实施。随后按照以下程序在单罐内完成步骤4及6。然后，按实例1实施步骤5及7。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.20-8.16(m，1H)，7.95-7.84(m，2H)，7.36-7.25(m，3H)，7.24-7.15(m，3H)，7.07-6.98(m，3H)，5.07-5.05(m，1H)，4.90-4.86(m，1H)，4.65-4.62(m，1H)，4.49-4.41(m，1H)，3.63-3.56(m，3H)，3.38-3.31(m，2H)，3.27-3.11(m，2H)，3.00-2.99(m，3H)，1.27-1.21(m，6H)，1.05-0.99(m，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ175.8，175.5，169.6，166.3，165.9，163.5，163.4，157.7，153.0，152.9，152.3，138.1，136.4，136.1，133.1，133.0，133.0，132.9，132.7，132.3，123.8，118.8，118.7，118.5，118.4，107.5，57.6，57.2，54.7，44.7，38.7，38.1，37.6，37.5，23.0，22.9，22.2，22.0，14.1，14.0

制备2-(2-二乙氨基-5-异丙基氨基嘧啶-4-基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯的另一单罐程序。将2-(2-二乙氨基-5-硝基嘧啶-4-基氨基)-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸叔丁基酯(5.0g，0.010mol)、冰醋酸(10滴)、丙酮(2.19mL，0.030mol)及铂氧化物(0.250g，5wt％)溶于EtOH(15mL)的混合物在45psi氢气下氢化，直到TLC(50％EtOAc/己烷)显示100％转化成产物(20小时)。然后使反应混合物滤过一硅藻土塞并真空浓缩，生成一灰色残余物。通过快速色谱法(4∶1EtOAc/己烷)纯化残余物，生成3.54g(70％)紫红色泡沫状9。

                       实例9

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例1实施。步骤6用碘乙烷代替硫酸二甲酯实施。

¹H NMR(CDCl₃)δ0.89(t，J＝7.2，1.8H)，1.06(t，J＝7.1，1.2H)，1.10-1.30(m，6H)，2.97(s，3H)，3.05(s，3H)，3.10-3.90(m，8H)，4.82(q，J＝5.4，0.6H)，4.91(q，J＝6.1，0.4H)，6.80-7.45(m，8H)，7.77(m，2H)，12.44(bs，1H)

MS m/z 603.3(MH⁺)

                       实例10

制备2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺酰基)异丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

步骤1、2、3、4、6及7按照实例8实施。步骤5用3，4-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.20-8.19(m，1H)，7.84-7.78(m，1H)，7.70-7.64(m，1H)，7.54-7.48(m，1H)，7.39-7.31(m，1H)，7.20-7.17(m，1H)，7.05-6.96(m，2H)，4.91-4.89(m，1H)，4.70-4.68(m，1H)，4.48-4.41(m，2H)，3.60-3.58(m，3H)，3.34-3.33(m，1H)，3.27-3.20(m，1H)，3.09-3.08(m，2H)，2.98-2.97(m，2H)，1.28-1.19(m，6H)，1.06-0.98(m，6H)，0.83-0.81(m，1H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ177.6，177.2，167.9，164.9，164.8，159.2，159.1，155.7，154.5，154.4，152.4，152.3，140.4，140.3，137.8，134.3，133.9，129.3，129.2，125.4，122.6，122.5，122.4，122.2，121.5，121.2，109.1，59.5，59.1，56.7，56.6，46.4，46.3，39.6，39.3，39.2，24.7，24.5，23.9，23.6，15.7，15.6

                       实例11

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺酰基)异丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例8实施。步骤5用4-氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.18-8.17(m，1H)，7.85-7.78(m，1H)，7.62-7.58(m，1H)，7.38-7.35(m，1H)，7.34-7.24(m，1H)，7.17-7.16(m，1H)，7.10-7.05(m，2H)，7.04-6.98(m，2H)，4.98-4.87(m，1H)，4.73-4.68(m，1H)，4.55-4.38(m，2H)，3.70-3.52(m，3H)，3.40-3.30(m，1H)，3.28-3.18(m，1H)，3.17-3.08(m，2H)，3.05-2.98(m，2H)，1.25-1.20(m，6H)，1.04-0.96(m，6H)，0.80-0.77(m，1H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ175.7，175.5，166.2，165.8，169.6，163.5，163.4，157.6，152.9，152.8，138.0，136.3，136.1，133.1，133.0，132.9，132.7，132.2，123.8，118.8，118.6，118.5，118.5，118.3，107.5，57.6，57.2，54.7，44.6，38.6，38.1，37.6，37.5，22.9，22.8，22.2，21.9，14.1，13.9

                       实例12

制备2-{2-二乙氨基-5-[(3，4-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例9实施。步骤5用3，4-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.15-8.14(m，1H)，7.80-7.75(m，1H)，7.73-7.62(m，1H)，7.60-7.49(m，1H)，7.30-7.18(m，1H)，7.16-7.00(in，2H)，5.58-5.50(m，1H)，4.90-4.83(m，1H)，5.78-5.70(m，1H)，3.85-3.75(m，1H)，3.65-3.54(m，3H)，3.40-3.23(m，5H)，3.18-3.10(m，3H)，3.05-2.98(m，3H)，1.25-1.15(m，3H)，1.18-1.05(t，1.5H)，1.02-1.00(t，1.5H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ165.8，152.7，145.7，136.4，136.3，132.5，132.2，127.5，123.6，120.7，120.4，81.4，57.0，44.3，38.5，38.1，37.4，14.9，14.6，14.1，14.0

MS m/z 621.5(MH⁺)

                       实例13

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氯苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例9实施。步骤5用4-氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.15-8.14(m，1H)，7.84-7.79(m，1H)，7.67-7.61(m，1H)，7.37-7.33(m，1H)，7.22-7.18(m，1H)，7.14-7.13(m，1H)，7.06-7.00(m，3H)，4.80-4.75(m，1H)，4.18-4.10(m，1H)，3.65-3.30(m，3H)，3.28-3.20(m，3H)，3.18-3.08(m，2H)，3.03-2.98(m，2H)，2.05-2.04(m，1H)，1.30-1.16(m，9H)，1.10-1.08(t，1.5H)，0.99-0.95(t，1.5H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ176.2，176.1，166.7，162.7，162.3，157.6，152.9，142.0，138.8，136.5，132.8，132.5，132.0，131.8，123.8，111.7，111.4，57.9，57.8，44.9，38.9，38.3，37.8，37.7，15.1，14.9，14.3，14.2

MS m/z 619.4(MH⁺)

                       实例14

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)环丙基甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例1实施。步骤6用溴甲基环丙烷及碳酸铯代替硫酸二甲酯及碳酸钾实施。

¹H NMR(CDCl₃)δ-0.2-0.2(m，2.4H)，0.2-0.45(m，1.6H)，0.54(m，0.6H)，0.85(m，0.4H)，1.00-1.40(m，6H)，2.80-3.80(m，14H)，4.79(q，J＝5.5，0.6H)，4.91(q，J＝6.3，0.4H)，6.70-7.40(m，8H)，7.77(m，2H)，10.26(bs，1H)

MS m/z 629.2(MH⁺)

                       实例15

制备2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用3，5-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ7.68-7.67(m，1H)，7.67-7.56(m，2H)，7.42-7.40(m，2H)，7.31-7.30(m，1H)，7.26-7.23(m，2H)，5.20-4.90(m，1H)，4.35-4.33(m，1H)，3.78-3.74(m，4H)，3.57-3.54(2H)，3.38-3.33(m，2H)，3.26-3.21(m，2H)，2.41-2.39(m，2H)，2.26-2.25(m，2H)，1.50-1.38(m，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)d 162.5，162.3，159.2，159.0，148.0，146.1，132.2，127.8，127.7，127.6，118.9，109.1，109.0，108.7，108.6，106.2，105.8，52.5，39.6，34.1，32.9，9.5

                       实例16

制备2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例15实施。步骤6用碘乙烷代替硫酸二甲酯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ7.45-7.43(m，1H)，7.42-7.18(m，2H)，7.21-7.16(m，2H)，7.07-7.06(m，1H)，7.04-6.97(m，2H)，5.51(bs，1H)，4.86-4.82(m，1H)，4.72-4.66(m，1H)，3.84-3.77(m，1H)，3.59-3.50(m，3H)，3.34-3.31(m，2H)，3.12-3.10(m，3H)，2.99-2.96(m，3H)，1.22-1.14(m，9H)，1.10-1.05(t，1.5H)，0.97-0.95(t，1.5H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ159.9，150.9，150.1，134.0，130.0，129.7，121.2，107.9，86.7，42.0，41.9，36.3，35.2，35.1，12.8，12.5，11.9，11.8，

                       实例17

制备2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用2，4-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.16-8.11(m，1H)，7.59-7.56(m，2H)，7.48-7.45(m，2H)，7.26-7.24(m，3H)，5.21-5.16(m，1H)，3.79-3.77(m，4H)，3.57-3.54(m，3H)，3.48-3.46(m，2H)，3.44-3.34(m，3H)，3.22-3.21(m，3H)，1.45-1.44(m，6H)

¹³C NMR(CDCl)δ180.2，170.3，166.6，150.3，129.0，128.9，128.7，125.9，125.4，117.5，117.4，116.5，114.8，107.7，107.4，95.5，90.8，68.0，65.1，55.7，50.8，37.6，36.4，31.9，31.7，31.6，13.2，9.4，8.3，7.8

                       实例18

制备2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例17实施。步骤6用碘乙烷代替硫酸二甲酯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.15(bs，1H)，7.91-7.76(m，1H)，7.32-7.30(m，2H)，7.20-7.19(m，2H)，7.04-7.00(m，2H)，4.84-4.83(m，1H)，4.74-4.67(m，1H)，4.14-4.07(m，1H)，3.92-3.82(m，1H)，3.51-3.49(m，3H)，3.34-3.31(m，3H)，3.12-2.99(m，2H)，2.98-2.97(m，2H)，2.03-2.02(m，1H)，1.26-1.17(m，6H)，1.10-1.06(t，1.5H)，1.03-0.98(t，1.5H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ173.6，173.3，171.4，167.7，164.3，161.2，159.9，159.3，157.1，156.7，155.2，152.4，151.0，150.3，134.0，133.3，133.1，132.9，130.0，123.2，122.9，122.8，121.3，121.2，112.0，111.8，111.6，111.5，107.7，107.2，106.0，105.9，105.6，105.2，60.0，54.8，42.0，36.5，35.9，35.3，35.1，19.3，13.0，12.9，12.7，11.9，11.8

                       实例19

制备2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氯苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用3，5-二氯苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ7.84-7.82(m，1H)，7.76-7.75(m，3H)，7.34-7.32(m，1H)，7.19-7.10(m，1H)，7.03-7.00(m，2H)，5.50(bs，1H)，4.83-4.82(m，1H)，4.74-7.73(m，1H)，3.55-3.38(m，4H)，3.34-3.32(m，2H)，3.15-3.11(m，4H)，3.02-2.99(m，3H)，1.18-1.15(m，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ157.1，155.2，150.1，149.7，140.1，135.9，134.3，132.9，130.0，129.9，126.0，121.2，110.7，55.2，54.8，42.0，38.5，38.1，36.5，35.9，35.2，35.1，11.9

MS m/z 639.1(MH⁺)

                       实例20

制备2-{2-二乙氨基-5-[(3，5-二氯苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例19实施。步骤6用碘乙烷代替硫酸二甲酯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.15(bs，1H)，7.84-7.84-7.79(m，1H)，7.76-7.74(m，2H)，7.33-7.30(m，1H)，7.22-7.11(m，2H)，7.04-6.98(m，1H)，5.51(bs，1H)，4.86-4.82(m，1H)，4.72-4.67(m，1H)，3.77-3.75(m，1H)，3.60-3.50(m，3H)，3.34-3.29(m，2H)，3.27-3.22(m，2H)，3.12-3.11(m，2H)，2.99-2.98(m，2H)，1.23-1.14(m，6H)，1.10-1.05(t，1.5H)，0.99-0.94(t，1.5H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ173.6，173.4，163.7，159.9，159.3，157.3，156.8，155.2，155.1，152.1，150.8，150.2，141.4，141.2，135.9，134.0，132.7，130.0，129.7，125.8，125.7，121.3，121.2，107.9，107.4，54.8，54.7，42.0，36.4，35.8，35.3，35.1，12.8，12.5，11.9，11.8

MS m/z 653.2(MH⁺)

                       实例21

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)-正丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例1实施。步骤6用1-碘丙烷代替硫酸二甲酯实施。

¹H NMR(CDCl₃)δ0.75(m，3H)，1.00-1.50(m，8H)，3.00(s，3H)，3.08(s，3H)，3.20-3.70(m，8H)，4.79(q，J＝6.3，0.6H)，4.91(q，J＝6.6，0.4H)，5.73(bs，0.6H)，5.92(bs，0.4H)，6.90-7.45(m，7H)，7.76(m，2H)

MS m/z 617.2(MH⁺)

                       实例22

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)烯丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例1实施。步骤6用烯丙基溴代替硫酸二甲酯实施。

¹H NMR(CDCl₃)δ1.20(m，6H)，2.98(s，3H)，3.06(s，3H)，3.10-4.30(m，8H)，4.75-4.95(m，1H)，5.07(m，2H)，5.48(m，0.6H)，5.67(m，0.4H)，6.90-7.45(m，8H)，7.76(m，2H)，11.07(bs，1H)

MS m/z 615.2(MH⁺)

                       实例23

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)异丁氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例1实施。步骤6用异丁基碘代替硫酸二甲酯实施。

MS m/z 631.2(MH⁺)

                       实例24

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)-正丁氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例1实施。步骤6用1-碘丁烷代替硫酸二甲酯实施。

¹H NMR(CDCl₃)δ0.82(q，J＝7.1，3H)，1.05-1.40(m，10H)，3.01(s，3H)，3.10(s，3H)，3.15-3.80(m，8H)，4.75(q，J＝6.3，0.6H)，4.91(q，J＝5.9，0.4H)，5.79(d，J＝5.4，0.6H)，5.91(d，J＝6.6，0.4H)，7.00-7.40(m，7H)，7.77(m，2H)

                       实例25

制备2-{2-二乙氨基-5-[(2，5-二氟苯磺酰基)甲氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用2，6-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.38-8.37(m，1H)，7.99-7.95(m，1H)，7.55-7.54(m，2H)，7.50-7.42(m，2H)，7.27-7.22(m，2H)，5.08-5.06(m，1H)，3.76-3.74(m，4H)，3.59-3.54(m，3H)，3.49-3.42(m，4H)，3.36-3.34(m，2H)，3.23-3.21(m，2H)，1.40(bs，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ161.4，159.2，155.8，153.1，148.1，147.1，133.6，132.0，127.8，119.0，111.1，110.8，110.7，108.5，105.8，94.8，86.4，66.7，54.0，52.8，39.7，35.8，34.2，33.7，32..9，32.8，9.4

                       实例26

制备2-{2-二乙氨基-5-[(2，3-二氟苯磺酰基)乙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、6及7按照实例1实施。步骤5用2，3-二氟苯磺酰氯代替4-氟苯磺酰氯实施。用以下程序制备2，3-二氟苯磺酰氯。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.32(bs，1H)，7.90-7.80(m，2H)，7.59-7.48(m，3H)，7.27-7.23(m，2H)，5.09-5.08(m，1H)，3.77-3.70(m，4H)，3.60-3.51(m，3H)，3.50-3.42(m，2H)，3.39-3.31n(m，3H)，3.32-3.18(m，2H)，1.43-1.41(m，6H)

¹³C NMR(CD₃OD)δ170.4，160.8，158.1，156.1，153.0，151.6，150.5，148.9，148.2，147.3，147.2，143.9，143.5，142.6，141.1，140.9，131.8，127.7，125.1，123.8，120.8，120.6，119.2，40.5，35.7，33.4，32.9，32.7，9.0

制备2，3-二氟苯磺酰氯。用两烧瓶实施以下程序。在第一烧瓶中，将2，3-二氟苯胺(2.0g，0.015mol)溶解于浓缩的HCl(15.9mL中)，用一冰/NaCl浴将所得溶液冷却至-5℃。边搅拌边添加亚硝酸钠(1.18g，0.017mol)溶于蒸馏水(13.6mL)中的溶液，同时保持温度低于0℃，并搅拌混合物10分钟。在第二烧瓶中，将亚硫酰氯(5.08mL，0.069mol)滴加至预先用冰/NaCl浴冷却至-5℃的蒸馏水(30.6mL)中。将所得溶液加热至室温，然后添加Cu(I)Cl(0.08g，0.77mmol)，再将反应混合物重新冷却至-5℃。在持续冷却搅拌的情况下，将第一烧瓶的内容物以每次2mL分份添加至第二烧瓶的内容物中，并搅拌混合物30分钟，期间形成一沉淀物。用过滤法分离出沉淀物，用冷水冲洗，并储存在真空下以得到3.25g(98％)白色固体10。

                       实例27

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)炔丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例1实施。步骤6用炔丙基溴代替硫酸二甲酯实施。

¹H NMR(CDCl₃)4δ1.15(m，6H)，2.27(d，J＝2.1，1H)，2.97(s，3H)，3.06(s，3H)，3.10-3.70(m，6H)，3.75(dd，J＝17.7，2.0，0.6H)，3.95(dd，J＝18.1，2.0，0.4H)，4.51(dd，J＝19.5，2.2，0.6H)，4.54(dd，J＝18.1，2.2，0.4H)，4.79(q，J＝5.9，0.6H)，4.88(q，J＝6.6，0.4H)，6.42(bd，0.4H)，6.65(bs，0.6H)，6.85-7.30(m，6H)，7.52(s，0.6H)，7.56(s，0.4H)，7.85(m，2H)，8.20(bs，1H)

MS m/z 613.2(MH⁺)

                       实例28

制备2-{2-二乙氨基-5-[(2，4-二氟苯磺酰基)炔丙氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸

步骤1、2、3、4、5及7按照实例17实施。步骤6用炔丙基溴代替硫酸二甲酯实施。

¹H NMR(CDCl₃)δ1.16(q，J＝7.5，6H)，2.27(m，1H)，2.99(s，3H)，3.09(s，3H)，3.10-3.70(m，6H)，4.04(dd，J＝17.7，2.4，0.6H)，4.24(dd，J＝17.9，2.2，0.4H)，4.47(m，1H)，4.81(q，J＝5.9，0.6H)，4.89(q，J＝6.3，0.4H)，6.27(d，J＝7.5，0.4H)，6.41(d，J＝5.7，0.6H)，6.90-7.10(m，4H)，7.16(d，J＝8.3，1H)，7.28(d，J＝8.3，1H)，7.55(bs，1H)，7.66(s，0.6H)，7.67(s，0.4H)，7.81(m，1H)

                       实例29

制备2-{2-二乙氨基-5-[(4-氟苯磺酰基)-(2，2，2-三氟乙基)氨基]-嘧啶-4-基氨基}-3-(4-二甲基氨甲酰氧基苯基)丙酸；

步骤1、2、3、4、5及7按照实例1实施。步骤6用三氟甲磺酸2，2，2-三氟乙基酯及碳酸铯代替硫酸二甲酯及碳酸钾实施。

¹H NMR(CDCl₃)δ1.14(m，6H)，2.98(s，3H)，3.06(s，3H)，3.10-4.20(m，8H)，4.80(q，J＝5.9，0.6H)，4.87(q，J＝6.2，0.4H)，6.09(d，J＝5.9，0.4H)，6.18(bd，0.6H)，6.80-7.50(m，7H)，7.55(bs，1H)，7.77(m，2H)；

MS m/z 657.2(MH⁺)

                       实例A

α⁴β¹整合素粘附性分析：Jurkat^TM细胞对人血浆纤维连接蛋白的粘附性

在4℃下将96孔板(Costar 3590 EIA板)用浓度为10μg/mL的人类纤维连接蛋白(Gibco/BRL，cat#33016-023)涂覆并过夜。  然后将板用牛血清白蛋白(BSA，0.3％)溶于盐水的溶液封阻。按照生产商的说明书用Calcein AM对Jurkat^TM细胞(保持在对数生长期)进行标记，并使其以2×10⁶细胞/mL的浓度悬浮于Hepes/盐水/BSA中。然后，在室温下使细胞经受测试化合物及对照化合物作用30分钟，再转移至经纤维连接蛋白涂覆的板的单个加样孔中。在37℃下使粘附进行35分钟。然后使用新鲜盐水通过轻缓的抽吸和移液来洗涤这些加样孔。用一荧光板读数器在EX 485/EM 530处定量与剩余粘附细胞相关的荧光。

细胞培养物可通过以下方法来制备：首先在第1天以1∶10、在第2天以1∶2对处于静止期的Jurkat^TM细胞进行分样，并在第3天进行分析。在第3天以1∶4对第1天以1∶10分样的细胞进行分样以供第4天分析之用。

分析板可通过以下制备：首先配制10μg/mL的Gibco/BRL人类纤维连接蛋白(cat#33016-023)溶于PBS++的工作溶液。

然后在室温下以50μL/加样孔将一Costar 3590 EIA板浸渍2小时(认为其亦可在4℃下过夜)。最后，在室温下用Hepes/盐水缓冲液以100μL/加样孔的量对该板进行抽吸并封阻1小时，随后用150μL的PBS++洗涤3次。化合物的稀释可通过以如下方式制备化合物1∶3的连续稀释液来完成。对于每一板(4种化合物/板)，将600μL添加至位于一滴定架上的4个Bio-Rad滴定管中。用此项技术中熟知的方法将足量化合物添加至每一适合的管内，以得到2X浓度。用Falcon Flexiplate，将100μLHepes/盐水缓冲液或人类血清添加至B至G排。使用一设定至180μL且具有四个间隔均匀的吸头的多道移液管。将每组四个管混合5次，并将180μL 2X化合物转移至B行第1列的每一化合物稀释液中，A行保持空白。将180μL添加至A行的其它加样孔中。通过转移50μL至下一稀释液并混合5次来沿该板连续地进行稀释，每次混合后都更换吸头。在F行处停止稀释。G行不含有化合物。

20μg/mL的21/6抗体溶于Hepes/盐水缓冲液或人类血清的溶液作为阳性对照，其搁置于一试剂槽中以添加至细胞悬浮板。

细胞染色可通过以下方法实现：首先通过在50mL试管内离心(1100rpm，5分钟)来获得对数期的Jurkat^TM细胞。将细胞重新悬浮于50mL PBS++中，旋转并再次悬浮于20mL PBS++中。添加入20μL Calcein AM对细胞染色30分钟。用Hepes/盐水缓冲液将容积补足至50mL并对细胞进行计数，旋转并再次以2×10⁶细胞/mL悬浮于Hepes/盐水缓冲液或人类血清中。

将化合物使用以下程序培养。在一新的挠性板中，将65μL已染色的细胞添加至B至H行。然后，按照板的布置将65μL 2X化合物添加至适宜的行中，并混合3次。将65μL 2X-21/6抗体添加至H行中并混合3次。最后将板在室温下培养30分钟。

纤维连接蛋白粘附性在以下加工程序后用一荧光板读数器在EX 485/EM 530处测得。将培养后的细胞混合3次并将100μL转移至经纤维连接蛋白涂覆的板上，在37℃下培养35分钟。通过沿加样孔的侧边轻轻地吸取100μL室温的PBS++并将板翻转90度抽吸来逐行洗涤每一块板。重复此程序，共洗涤3次。洗涤后通过沿加样孔的侧面移液将用100μL充填各加样孔。

在含人类血清和不含人类血清两种情况下计算每一化合物的IC₅₀值。IC₅₀为生长或活性受到的抑制程度为50％时的浓度。数据列于下表中：

细胞对人类血浆纤维连接蛋白的粘附性

      (不含人类血清)

    实例编号    IC₅₀(ug/mL)    1.    0.002    2.    0.002    3.    0.002    4.    0.004    5.    0.001414    6.    0.000511    7.    0.000821    8.    0.003002    9.    0.001    10.    0.00465    11.    0.002436    12.    0.003    13.    0.004    14.    0.001    15.    0.000915    16.    0.001035    17.    0.001    实例编号    IC₅₀(ug/mL)    18.    0.002    19.    0.003393    20.    0.005114    21.    0.003138    22.    0.001506    23.    0.004    24.    0.003    25.    0.006    26.    0.001    27.    0.001    28.    0.004    29.    0.0022

细胞对人类血浆纤维连接蛋白的粘附性

       (含有人类血清)

    实例编号    IC₅₀(ug/mL)    1.    0.318    2.    0.317    3.    0.152    4.    0.4    5.    1.851378    6.    0.313768    7.    0.586901    8.    0.16269    9.    0.106    10.    0.256177    11.    0.22931    12.    0.06    13.    0.075    14.    0.04    15.    0.124287    16.    0.067069    17.    0.024    18.    0.025    实例编号    IC₅₀(ug/mL)    19.    0.085347    20.    0.077505    21.    0.39998    22.    0.025293    23.    0.074    24.    0.027    25.    6.72    26.    0.018482    27.    0.065    28.    0.046    29.    0.034782

                          实例B

      用于测定候选化合物与α₄β₁的结合的活体外饱和分析

下文阐述一活体外分析，该分析用来测定一化合物要在下一实例所阐述的实验性自体免疫性脑脊髓炎(“EAE”)模型中或在其它活体内模型中具有活性所需的血浆浓度。

将对数生长的Jurkat细胞洗涤并重新悬浮于含20μg/mL 15/7抗体的标准动物血浆内(Yednock，等人，J.Biol.Chem.，(1995)270(48)：28740)。

将Jurkat细胞在含66μM至0.01μM不同浓度的已知候选化合物的标准血浆试样中稀释两倍(使用一标准的12点连续稀释，以得到一标准曲线)或在从候选化合物处理过的动物外周血液得到的血浆试样中稀释两倍。

然后在室温下将细胞培养30分钟，用含2％胎牛血清及皆1mM的氯化钙和氯化镁的磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)(分析介质)洗涤两次以除去未结合的15/7抗体。

然后使细胞接触与藻红蛋白偶联的1∶200山羊F(ab′)₂抗小鼠IgG Fc(Immunotech，Westbrook，ME)(其已经通过与5％所研究动物物种的血清共同培养而被吸附用于提供任何非特异性交叉反应性)，并于4℃下在黑暗中培养30分钟。

用分析介质将细胞洗涤两次并重新悬浮于相同溶液中。然后用如Yednock等人在J.Biol.Chem(1995，270：28740)所述的标准荧光激活细胞分选仪(“FACS”)分析对这些细胞进行分析。

然后将数据绘制成荧光-剂量曲线图，例如以一标准的剂量反应形式。形成曲线上部平稳段的剂量代表在活体内模型中获得功效所需的量。

此分析亦可用于确定使其它整合素(例如α₉β₁整合素，其为与α₄β₁整合素关系最密切的整合素)的结合位点饱和的血浆浓度(Palmer等人，1993，J.Cell Bio.，123：1289)。此结合预示对于由整合素介导的炎症疾病具有活体内效用，这些疾病包括(例如)伴随慢性哮喘病发生的阻塞及呼吸道过度反应、动脉粥样硬化中的平滑肌细胞增生、血管成形术后的血管阻塞、肾病导致的纤维化症及肾小球瘢痕化、主动脉狭窄、类风湿性关节炎中的滑液膜肥大、溃疡性结肠炎及克隆氏病发展中发生的炎症及瘢痕化。

因此，上述分析可用一转染有编码α₉整合素的cDNA的人类结肠癌细胞系即SW480(ATTC#CCL228)(Yokosaki等人，1994，J.Biol.Chem.，269：26691)代替Jurkat细胞，来测量α₉β₁整合素的结合性。作为一对照，亦可使用表达其它α及β₁亚单位的SW480细胞。

因此，本发明另一方面关于一种用来治疗一哺乳动物患者由α₉β₁介导的疾病的方法，该方法包括将一治疗有效量的本发明化合物投予一该病人。该些化合物较佳以本文上述医药组合物的形式投与。有效日剂量将视患者的年龄、体重、状态而定，这些因素可由主治临床医师容易查明。然而，在一较佳实施例中，该些化合物以每天约20到500μg/kg的量投与。

                      实例C

        用于测定生物利用率的卡匣式投药及血清分析

通过用一卡匣(即，每一投药溶液中6种化合物的混合物)给大鼠服药来筛选口服生物利用率。此卡匣包含5种测试对象及一标准化合物，总剂量为10mg/kg。用等摩尔的1N NaOH将每一化合物/测试对象转换为钠盐并以2mg/mL溶于水中。通过等体积混合此六种溶液制成该卡匣药。将此卡匣药溶液充分混合，然后将pH值调节至7.5至9。该药溶液在研究的前一天制备并在室温下搅拌过夜。

该筛选中使用Charles River Laboratories的6至8周龄的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠。将大鼠隔离至少1天并允许持续进食及饮水。晚上在投与该卡匣药之前，使大鼠禁食约16小时。

每一卡匣内指配4只SD大鼠。将一单次剂量的投药溶液经口投予每一只大鼠。记录投药量(5mL/kg)及投药时间并在投药两小时后给予大鼠食物。

在以下时间点通过心脏穿刺采集血样：4小时、8小时及12小时。将大鼠用CO₂气体在10至20秒内麻醉以后立即采集血液。在采集完12小时的血样后，通过CO₂窒息法及随后的颈部错位法将大鼠无痛致死。

在处理血样之前将其在低温(4℃)下保存于经肝素化的微量采血管中。将血样离心(10000rpm，5分钟)，取出血浆并储存于-20℃的冷藏箱中直至进行药物浓度分析。使用以下直接沉淀血浆的方案来分析血浆中的药物浓度。

通过以下在一1.5mL 96孔板中制备活体内血浆试样：按顺序添加100μL的测试血浆、150μL的甲醇，随后旋转10至20秒。添加150μL 0.05ng/μL的一溶于乙腈中的内部标准，并旋转30秒钟。

通过以下在一1.5mL 96孔板中制备标准曲线试样：按顺序添加100μL的对照小鼠血浆、150μL的甲醇，并旋转10至20秒。添加150μL 0.05ng/μL的一溶于乙腈中的内部标准，并旋转30秒钟。将0至200ng(10种浓度)溶于50％甲醇中的相关化合物搀入试样以获得一0.5ng/mL至2,000ng/mL的标准曲线范围。再次将试样涡旋30秒。

然后将试样在Eppendorf微量离心机中以3000rpm离心20至30分钟，再将80至90％的上清液转移至一干净的96孔板中。然后将有机溶剂蒸发直至试样干燥(在40℃及氮气下，30至60分钟(ZymarkTurbovap))。

然后将残余物溶解于200至600L流动相(50％CH₃OH/0.1％TFA)中。继而使用一PE-Sciex API-3000三级四极质谱仪，Perkin-Elmer，Series200自动采样器及shimadzu 10A泵，进行LC/MS/MS。用PE-Sciex Analyst(vl.1)进行采集并用PE-SciexAnalyst(vl.1)完成数据分析及定量。用25％CH₃OH、0.1％TFA-100％CH₃OH、0.1％TFA的流动相将5至50μL量的试样注射至一反相ThermoHypersil DASH-18柱上(Keystone 2.0×20mm，5μm，PN：8823025-701)。以约300μL/分钟的流速进行约8分钟。

用线性梯形法则计算t＝0至最后取样时间tx的曲线下面积(AUC)(参见Handbookof Basic Pharmacokinetics，Wolfgang A.Ritschel and Gregory L.Kearns，5^thed，1999)。

AUC^0-tx＝S((C_n+C_n+1)/2))·(t_n+1-t_n)[(μg/mL)h]

在卡匣投药图中，在血管外投药后第4、8及12小时采样，计算t＝0至t＝12h的AUC。

计算每一个体动物的AUC^0-12h值，在下表中报告平均AUC^0-12h。

    实例编号    AUC    1.    2.3308    2.    1.8689    3.    1.5483    4.    0.5965    5.    0.9577    6.    0.6538    7.    0.717    8.    0.5088    9.    1.564    10.    0.1215    11.    0.4251    12.    0.8447    13.    1.5806    14.    0.7164    15.    0.2098    实例编号    AUC    16.    0.1721    17.    1.0075    18.    0.2578    19.    0.0697    20.    0.0536    21.    0.6321    22.    0.6297    23.    0.413    24.    0.4983    25.    0.4559    26.    0.3392    27.    1.6258    28.    0.7968    29.    0.2941

                       实例D

                     哮喘病模型

由α₄β₁整合素介导的炎症性症状包括(例如)伴随慢性哮喘病发生的阻塞、嗜酸性粒细胞汇聚、呼吸道过度反应。以下内容阐述用于研究本发明化合物治疗哮喘的活体内效应的哮喘病动物模型。

大鼠哮喘病模型

此模型采用Chapman等人在Am J.Resp.Crit Care Med(1534，A219(1996))中及Chapman等人在Am.J.Resp.Crit Care Med(155：4，A881(1997))中(两者的全部内容均以引用的方式并入本文中)阐述的方案。在第7天及第14天再次注射OA及佐剂。在第21天，将已致敏的动物箝制于塑料试管内并使其在一仅鼻孔可暴露的装置中暴露(60分钟)于OA气雾剂(10mg/kg)下。72小时后用戊巴比妥(pentobarbtial)(250mg/kg，i.p.)将动物处死。通过一气管插管用3等份(4mL)翰克司溶液(HBSS×10,100mL；EDTA 100mM，100mL；HEPES 1M，25mL；用水补足至1L)灌洗大鼠的肺；收集所获得的细胞并通过添加翰克司溶液将所得液体的总体积调节至12mL。对全部细胞进行计数(Sysmex微细胞计数器F-500，TOA Medical Electronics Otd.，Japan)，通过稀释所得液体(至约10⁶细胞/mL)并将1等份(100μL)用移液器转移至一离心机(Cytospin，Shandon，U.K.)内来制作涂片。将涂片风干，用一溶于甲醇中的固绿溶液(2mg/mL)固定5秒钟，并用伊红G染色5秒钟，用噻嗪染色5秒钟(Diff-Quick，Browne有限公司U.K.)，以区分嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞。使用油浸(×100)光学显微镜检查法每涂片共计数500个细胞。将本发明化合物用一0.5％羧甲基纤维素及2％土温80(Tween 80)悬浮液调配并经口投予已经对过敏原即卵清蛋白过敏的大鼠。在该模型中，认为可在被有效致敏的Brown Norway大鼠呼吸道中抑制由过敏原诱导的白细胞积聚的化合物具有活性。

小鼠哮喘病模型

亦在一急性肺部炎症的小鼠模型中对这些化合物进行评价，该评价按照Kung等人在Am J.Respir.Cell Mol.Biol.13：360-365，(1995)中及Schneider等人在Am J.Respir.Cell Mol.Biol.20：448-457，(1999)中(两者的全部内容均以引用的方式并入本文中)所述的程序进行。在第1天通过注射(i.p.)0.2mL含20μg卵清蛋白(4级，Sigma)及2mg注射明矾(Pierce)的卵清蛋白/明矾混合物将6只雌性黑色小鼠(8至12周龄)致敏。在第14天时给予一强化注射。在第28天及第29天用雾化的1％卵清蛋白(溶于0.9％的盐水中)对小鼠进行20分钟的免疫激发。在第30天，即首次激发后48小时，将小鼠无痛致死并收集支气管肺泡灌洗试样(3mL)。用FACs/FITC染色法定量嗜酸性粒细胞。将本发明化合物用一0.5％羧甲基纤维素及2％土温80悬浮液调配并经口投予已经对过敏原即卵清蛋白过敏的小鼠。在该模型中，认为可在被有效致敏的C57BL/6小鼠呼吸道中抑制由过敏原诱导的白细胞积聚的化合物具有活性。

绵羊哮喘病模型

该模型采用Abraham等人在J.Clin，Invest，93：776-787(1994)中及Abraham等人在Am J.Respir Crit Care Med 156：696-703(1997)中阐述的程序，两者的全部内容均以引用的方式并入本文中。通过静脉注射(盐水溶液)、经口(2％吐温80，0.5％羧甲基纤维素)及气雾剂形式投与至对猪蛔虫(Ascaris suum)抗原过敏的绵羊来对本发明化合物进行评价。在该模型中，如化合物可减少早期抗原诱导的支气管反应及/或阻断晚期呼吸道反应，例如，具有一抗抗原诱导的晚期反应及呼吸道过度反应(“AHR”)的保护性效应，则认为其具有活性。

使用对吸入的猪蛔虫抗原显现出早期和晚期支气管反应两者的过敏性绵羊来研究候选化合物的呼吸道效应。用2％的利多卡因(lidocaine)对鼻孔进行局部麻醉后，将一气球导管从一鼻孔插入至下食道中。然后以一挠性纤维光学支气管镜引导，经由另一鼻孔用一有囊气管内管来培养这些动物。

按Abraham(1994)所述来估测胸膜压力。用一次性医药雾化器产生气雾剂(见下面的调配物)，该雾化器可提供一质量中位气动粒径为3.2μm(用Andersen级联冲击器测得)的气雾剂。将此雾化器连接至一剂量计系统上，该系统由一电磁阀与一压缩空气源(20psi)组成。雾化器的出口导入一塑性T形部件，该部件的一端连接至一活塞呼吸机的吸气孔。在雾化器的吸气循环开始时将电磁阀启动1秒钟。以500mL的VT递送气体，速率为每分钟呼吸20次。仅用0.5％的碳酸氢钠溶液作为对照。

根据Abraham(1994)所述产生对卡巴胆碱的累积浓度反应曲线，来评价支气管反应性。在处理开始之前及抗原激发后24小时均进行支气管活组织检查，该检查按照Abraham(1994)所述实施。

亦按Abraham(1994)所述实施肺泡巨噬细胞的一活体外粘附研究，并计算粘附细胞的百分比。

气雾剂调配物

用以下程序制备一候选化合物以30.0mg/mL的浓度溶于0.5％碳酸氢钠/盐水(w/v)中的溶液：

A.制备0.5％碳酸氢钠/盐水储备溶液：100.0mL

成分克/100.0μL最终浓度碳酸氢钠0.5g0.5％盐水补足至100.0mL补足至100％

程序：

1.向一容积为100mL的烧瓶内添加0.5g碳酸氢钠。

2.添加约90.0mL盐水并经声波处理直至溶解。

3.用盐水补足至100.0mL并充分混合。

B.制备30.0mg/L的候选化合物：10.0mL

    成分    克/10.0mL  最终浓度    候选化合物    0.300g  30.0mg/mL    0.5％碳酸氢钠/盐水储备溶液    补足至10.0mL  补足至100％

程序：

1.向一容积为10.0mL的烧瓶内添加0.300g待测化合物。

2.再添加约9.7mL 0.5％的碳酸氢钠/盐水储备溶液。

3.进行声波处理直至候选化合物完全溶解。

4.用0.5％的碳酸氢钠/盐水储备溶液补足至10.0mL并充分混合。

                       实例E

            对C57B6小鼠进行为期10天的毒性研究

进行一为期10天的研究来评价本发明化合物对雌性C57B6小鼠的毒性。以5种剂量水平(0(媒剂对照)、10、30、100、300及1000mg/kg(mpk))通过管饲法投与该化合物，每一剂量水平投予5只小鼠。所有水平的剂量均为10mL/kg。剂量溶液在2％吐温80溶于0.5％羧甲基纤维素(CMC)中的溶液中制备，并且每2至3天制备新的剂量溶液或悬浮液。处死前的观察包括体重(第1、2、3、5、7、8及11天实施)，每日笼边临床观察(1-2次/天)及周期性(第-1、2及9天实施)系列机能观察。

在结束时，通过心脏穿刺采集血液试样供临床病理学(血液学及临床化学)及药物水平研究艇。分析这些EDTA血样的总白细胞数目、红细胞数目、血红蛋白、血细胞比容、红细胞指数(MCV、MCH、MCHC)、血小板及WBC五部分的差异(嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)。分析经肝素化的血浆试样的丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、白蛋白、蛋白质、钙、葡萄糖、尿素氮、肌酸酐、胆固醇及甘油三酯。

采集完血液后，对小鼠尸体进行剖检并称重器官(肝、脾、肾、心脏及胸腺)。采集脑、涎腺、胸腺、心脏、肺、肝、肾、肾上腺、脾、胃、十二指肠、回肠、结肠及子宫/卵巢这些组织的试样并用福尔马林稳定。处理从媒剂对照、300及400mpk组的动物得到的组织并置于经H&E染色的玻璃载玻片上，对组织病理学损伤进行评价。

使用Prism软件通过Dunnet′s多重比较测试对体重变化、绝对及相对器官体重及临床病理学结果进行分析，找出与载剂对照组相比的统计学显着差异。用Dunnet′s、Fisher′s精确检验法对这些机能观察系列结果进行差别分析并通过Cochran-Mantel-Haenszel相关性检验用SAS软件进行剂量变化趋势效应分析。

使用一常规的口服调配物，本发明化合物在此模型中将具有活性。

                       实例F

               大鼠中由佐剂引发的关节炎

佐剂引发的关节炎(“AIA”)是一用于类风湿性关节炎(RA)研究的动物模型，其通过在Lewis大鼠的尾根部注射结核杆菌引发。在注射后的第10天及第15天之间，动物会患上严重的渐进性关节炎。

通常，对化合物改变大鼠由佐剂引发的浮肿造成的后爪肿胀及骨损伤的能力进行测试。为了定量对AIA所导致的后爪肿胀的抑制程度，已定义两种炎症期：(1)原发性及继发性注射后爪炎症期，及(2)继发性未注射后爪炎症期，其通常在注射爪中引发炎症后约11天开始显现。如果后一类型炎症减轻，则表明测试化合物具有免疫抑制活性。Cf.Chang，Arth.Rheum.，20，1135-1141(1977)。

使用一RA动物模型(例如AIA)可研究与该疾病初期阶段有关的细胞事件。在佐剂关节炎的早期，CD44在巨噬细胞及淋巴细胞上的表达上调，然而在该疾病的后期，LFA-1的表达上调。了解在佐剂关节炎的最早期粘附分子与内皮组织之间的相互作用可在RA治疗方法方面获得显着进展。