硒酵母产物,制备硒酵母产物的方法以及所述产物在制备食品、膳食补充品或药品中的用途

摘要

提供了用于食品、膳食补充品或药品的硒酵母产物，其含有显著和均一数量的易被消化的有机结合硒，在该硒酵母产物中硒化合物的含量介于1000到1600ppm的范围，1－硒代甲硫氨酸的含量恒定地占硒总含量的至少55％，并且无机硒化合物中的硒含量不超过硒总含量的1％。除此以外，提供了一种制备用于食品、膳食补充品或药品的硒酵母产物的方法，其中该酵母在有氧条件下被培养于基本培养基中，在培养过程中，以与营养物在酵母中的消耗相应的程度将此营养物加入酵母；葡萄糖和/或麦芽糖是流加培养基中的唯一碳源。

说明书

技术领域

本发明涉及用于食品、膳食补充品或药品的硒酵母产物(seleniumyeast product)，该产物含有显著和均一数量的易被消化和耐受的有机结合硒(organically bound selenium)。本发明也涉及一种制备硒酵母产物的方法以及利用此硒酵母产物制备食品、膳食补充品或药品。

领域背景

硒是人所必需的营养元素。硒通过食物被摄取，但是食物中硒的含量参差不齐。在世界的大部分，栽种的农作物含有很低的硒水平，因为该元素在土壤中的含量有限。

硒对人的重要性已经通过大量的实验被证实。硒被整合到不同的有机分子，包括特殊的氨基酸。1-硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸和硒代乙硫氨酸是最重要的化合物。因此，硒是蛋白质的一部分，而蛋白质是对于身体而言重要的结构。此外，硒是一些影响代谢、再生、预防癌症、免疫防御和人精神的酶的重要成分。(即Rayman，M.，硒对人健康的重要性，Lancet 356：233-241(2000).)。

由于在普通食物中通常硒含量不足，因此以浓缩物、膳食补充品或药物的形式补充硒是有利的。这些可能包括无机硒，如亚硒酸盐，或它们可能包括有机来源，包括硒酵母。在吸收和毒性方面，无机和有机硒存在明显差异。无机化合物通常比硒的有机来源吸收显著更慢并且更具有毒性。通常使用的有机硒来源是含硒酵母。

在培养酵母时，可以以无机化合物的形式向营养培养基中加入硒，包括亚硒酸钠和硒酸钠。以这种方式加入到营养培养基中的硒被酵母大量吸收，并被整合到有机化合物中，包括1-硒代甲硫氨酸。

硒酵母可以利用一些酵母物种来制备，包括啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Saccharomyces boulardii sequela和Saccharomyces torula，并使用不同的培养条件。结果导致酵母中可能形成硒有机化合物的可变的选择。使用已知方法获得的重复性不太令人满意。低的重复性导致了权威人士、研究人员和消费者不愿意使用硒酵母。

食品科学委员会(the Scientific Committee on Foods)申明硒酵母中1-硒代甲硫氨酸的含量介于20～50％，见EuropeanCommission，Scientific Committee on Food，Opinion on substancesfor nutritional purpose which have been proposed for use in themanufacture of foods for particular nutritional purposes，和“PARNUTS”，12 May 1999，page 5.Scienfific Committee on Food onthe Tolerable Upper Intake leVel of Selenium，11 October 2000，page2.使用的膳食补充品或药物中必要的硒化合物(即种类)具有均一的浓度是至关重要的。

这一点允许对于硒的重要性进行长期的研究，其中从产品到产品的重复性对于解释和使用这些研究结果具有重要性。

作为一商业产品，硒酵母通常通过使用具有不定组分的糖蜜培养制备。从文献已知，不同类型的硒酵母导致变化的吸收水平，因此产生不同的反应(即Clausen，J.等人，十种硒补充产品的比较，Selenium inMedicine and Biology，Walter de Gruyter&Co 305-14(1988))。一些专利描述了培养含有不同浓度的硒的硒酵母。因此，美国专利4,530,849公开具有1000ppm硒的硒酵母的培养。但是此专利并没有公开硒如何被酵母结合，或此方法能在多大程度上被重复。

专利申请WO 98/37172也涉及硒酵母的培养和利用。培养方法包括将水溶性硒盐和营养培养基混合，然后加入用水悬浮的酵母。产生的硒酵母含有的硒成分并没有被分成衡定的、均一的化合物。获得硒化合物的均一得率和组成的可能性仍然没有描述。

事实上已知酵母和其它微生物能够在含有最低水平营养物的培养基(所谓基本培养基)上被培养。然而，这一方法在工业上通常并不使用，因为它将导致低的得率和不希望的微生物组分。因此，依照本发明使用基本培养基进行培养可能获得良好的得率和最适用于人营养的可重复的硒酵母组分是令人吃惊的。

因此，本发明涉及制备含有显著和均一数量的可消化的有机结合硒的酵母产物的方法。

产生的酵母是一种粉末，可以直接使用也可以通过传统技术被压缩成片剂。这些片剂可以作为食品、膳食补充品或药品上市。

发明简述

在第一方面，本发明因此涉及用于食品、膳食补充品或药品的硒酵母产品，该产品具有的特征是：有机硒化合物的含量相应于介于1000到1600ppm，优选介于1100ppm到1500ppm，最优选介于1200ppm到1400ppm的硒，1-硒代甲硫氨酸的含量恒定地占硒总含量的至少55％，并且无机硒化合物的硒含量不超过硒总含量的1％。

此结果产物进一步的特征是人的吸收超过85％。

在第二方面，本发明涉及用于食品、膳食补充品或药品的硒酵母产物的制备方法，其中酵母被培养在有氧条件下，该方法具有以下特征：1、在培养过程中，以与营养物在酵母中的消耗相应的程度将此营养物加入酵母；2、在流加培养基(feeding medium)中，葡萄糖和/或麦芽糖是唯一的碳源；3、在培养过程中乙醇的浓度不超过1％，优选不超过0.5％，最优选不超过0.2％；4、培养过程中pH值保持在4.0到6.0之间，优选4.4到5.7之间，最优选4.7到5.4之间，例如5.0；5、流加培养基被混入水溶性硒盐，所述硒盐的数量以酵母干物质计算相当于介于1000到1500ppm的硒。

在第三方面，本发明涉及通过本发明的方法制备的硒酵母产物。

在第四方面，本发明涉及食品、膳食补充品或药品，其包括根据本发明的硒酵母产物。

在第五方面，本发明涉及根据本发明的硒酵母产物在制备食品、膳食补充品或药品中的应用。

发明详述

在详细描述本发明的不同实施方案之前，一些特异于本发明主要方面的相关定义提供如下：

定义

基本培养基：含有酵母生长必需的最小数量营养物的培养基。

药物质量：描写在国家药典上的产品特性。

起始培养基：接种有酵母的水和附加营养物的混合物。

流加培养基：在接种酵母之后加入到起始培养基/培养物中的营养物。

Zak-方法：培养酵母的方法，其中所述酵母被加入起始培养基之后，接着营养物通过流加培养基在有氧条件下被加入。营养物在有氧条件下被加入的速率与该营养物在酵母中的吸收速率相一致。正确的控制导致只有少量的醇形成。形成的醇在培养的最后阶段被酵母所消耗。此方法是传统的，并称为Z-方法。它主要被Sren Sak先生所发展并被描述于丹麦专利No 28507(1921)。

人的吸收：摄取的同位素的量与排泄在粪便中的同位素的量的差异。人的吸收以摄取的同位素量的百分数计算。

如上所提及的，迄今已知的制备硒酵母产物的方法主要使用糖蜜作碳源，当WO 98/37172使用以葡萄糖为基础的培养基时，此法因为不能保证连续加入相应于细胞生长的营养物和硒而与本发明的方法不同。另外，在相对短的时期内加入硒混合物使对人的营养具有特殊重要性的硒有机化合物的形成复杂化。

根据本发明，用于培养酵母的营养物包括碳源和氮源，以及维生素和矿物质形式的微量营养物。

碳必须是在培养过程中能被立即吸收的形式，因此它必须高度溶于水并且具有能被酵母中存在的酶消耗的组分。这些碳源包括葡萄糖和能被纯化成葡萄糖浆的麦芽糖，并且它们应该能够被用作产生食品、膳食补充品或药品的微生物的营养物。作为氮源，可以使用无机化合物，包括具有足够高纯度水平的氨，以避免毒性或不希望的化合物的形成。酵母的代谢还没有被彻底了解，因此有必要加入酵母提取物形式的微量营养物，这被描述在药典中。

因此，根据本发明酵母能够在具有药物质量的原材料的基础上被制备，并且原材料的组成使酵母具有最低水平的能被用于生长的营养物。典型的培养酵母的方法包括如下步骤：1)处理营养培养基；2)加入酵母接种；3)培养；4)收获；5)洗涤；6)热处理；7)干燥。营养培养基是通过在加入酵母之前将糖物质、维生素和矿物质溶于水而产生的，其中水被加热到24到37℃，优选26到34℃，最好是28到32℃。

向完全的、加热的营养培养基中加入酵母进行接种，酵母细胞被悬浮于以1到2Hz频率搅拌的培养基中。硒酵母可以通过使用一些物种，包括啤酒糖酵母，Saccharomyces boulardii sequela和Saccharomyces torula来制备。在所述物种中，啤酒糖酵母通常被认为适合人的摄取，并被广泛用于制备面包和醇。根据本发明，利用生产菌株来制备硒酵母产物是有利的，所述生产菌株在遗传上是稳定的，因此不易产生变异。根据本发明，在一实施方案中ATCC No 74366菌株被使用，然而本发明并没有被限制于此。

培养在营养培养基的基础上进行，此培养基作为特殊的基本培养基而被制成，并被以上的接种酵母(pitching yeast)接种。除此以外，额外的碳水化合物以葡萄糖和/或麦芽糖的形式被加入。混入氨水溶液作为氮源。为了确保最大可能的生长并阻止醇的形成，大量空气被引入，优选含有充足氧的空气。在大规模制备中实际上很难确保完全的氧化，这会轻微改变酵母的营养需求。在酵母浓度接近营养培养基总成分加酵母重量的4％时，培养被终止。营养物在有氧条件下被加入的速率与该营养物在酵母中的吸收速率相一致。结果，通过正确的控制只有少量的醇形成。在培养的最后阶段形成的醇被酵母所消耗。

实际上，通过连续测量生长过程中形成的乙醇形式的醇数量来控制营养物加入的正确数量。

如果营养物加入得太慢，没有醇形成，如果加入醇太快，则形成大量的醇。因此，在任何时候存在的醇量都不应该超过1％，优选不超过0.5％，最优选不超过0.2％。此外，生长培养基的pH可以被用作保持营养物的消耗和加入之间正确平衡的指示剂。因此在生长过程中pH受到控制和调节，以便pH保持在4.0到6.0之间，优选4.4到5.7之间，最优选4.7到5.4之间，例如5.0。

收获涉及从营养培养基中分离培养的酵母。这一分离最好通过离心来完成，由此产生的浓缩酵母膏含有约20％重量的酵母。

洗涤的目的是除去酵母膏中过量的营养物。

最有利的洗涤是加入水，接着离心，从而产生酵母膏。用这种方法将酵母洗涤2到6次，优选4次，由此基本上所有的胞外营养物都从酵母膏中被除去。

热处理的目的是杀死酵母细胞，以便其中存在的硒变成人可消化利用的。热处理也导致酵母细胞的高度瓦解。有利的热处理可以如巴氏灭菌法那样，在一温度为87℃的平板热交换器上持续30秒。

酵母可以通过传统的干燥有机材料的方法被干燥，包括冻干、转鼓式干燥、板式干燥(tray drying)或喷雾干燥，优选喷雾干燥。

喷雾干燥除去水分，输入的空气温度介于160到240℃之间，优选180到220℃，最好大约是200℃。这一环节的输出温度可以从70到90℃，优选80到90℃，最好大约是86℃。产生的粉末的含水量介于4到9％，优选介于6到9％，最好是约8％。粉末可以随后用水进行润湿处理，再干燥，以改善以后的吸水能力。

根据本发明的硒酵母可以被用于制备食品、膳食补充品或药品，其中既可以作为唯一的硒来源，也可以与其它的含硒成分联合。

因此，本发明也涉及食品、膳食补充品或药品，它们利用本发明的硒酵母作为硒来源。

在本发明的一实施方案中，所述使用包括包含崩解剂、流动剂和硒酵母的产品。这些混合物被压缩成每片含有25到800μg硒的片剂，特别是每片介于40到300μg硒，尤其是50到200μg硒。

然而，除了以上描述的应用范围，本发明也可用于其它类型的富含硒的食物，如面粉、其它粉状食物和饮料。

参考以下的实施例，本发明在下面被详细解释。

实施例

实施例1

1a)

在此实施例中使用了一体积为0.014m³的发酵罐。

在培养的开始，用以下具有药物质量的原料组分制备营养培养基：

水                        Ph.Eur.         5,400g

葡萄糖浆                  Ph.Eur.         31.8g

KH₂PO₄                 Ph.Eur.         25g

2.5％的氨水               Ph.Eur.         114g

生物素(0.01％)            Ph.Eur.         2.1ml

盐酸硫胺素(1.0％)         Ph.Eur.         2.5ml

泛酸钙                    Ph.Eur.         0.08g

酵母提取物                USP             75g

硫酸铁                    Ph.Eur.         0.10g

硫酸镁                    Ph.Eur.         5.0g

硫酸锰                    Ph.Eur.         0.033g

硫酸锌                    Ph.Eur.         0.033g

在将温度调节到30℃之后，混入5g接种酵母。被接种的营养培养基以每分钟20升的量被吹入无菌空气。使用一根旋转轴以17Hz的频率进行搅拌。使用硫酸调节pH，以保持pH介于4.7到5.4之间。乙醇被控制在不超过0.2％，另外乙醇的浓度保持在尽可能接近于0。

在培养过程中，营养物按以下数量随流加培养基加入：

葡萄糖浆                  Ph.Eur.         1,060.5g

2.5％的氨水               Ph.Eur.          1,451g

另外，亚硒酸盐被混入2.5％的氨水，如下：

亚硒酸纳                  Ph.Eur.          1.2758g

葡萄糖浆、氨水和亚硒酸钠被加入的速率与该物质在酵母中的消耗速率相一致。这一点是通过连续地测量醇的形成而控制的。醇的浓度保持在接近于0。在18小时后停止氨水(2.5％)的加入。在19小时后停止培养。

酵母的收获是通过将培养基和酵母转移到离心机来实现的，在此，5分钟之内酵母膏与多余的培养基相分离。产生的具有约20％干物质含量的酵母膏被混入5000g水。随后酵母混合物被再次离心。除去洗涤水，产生的酵母膏被混入5000g水，这一过程被重复四次以从培养基中分离酵母细胞。

洗过的酵母膏被转移至平板巴氏灭菌器中，在此它受到于87℃持续30秒的热处理。热处理之后，平板巴氏灭菌器中的酵母膏被立即冷却到4℃。酵母膏的量是1897.5g。

酵母膏被转移到冻干机中。在-40℃被冷冻24小时之后，在18小时之内水发生升华。由此产生380g含水量为0.2％的干燥硒酵母，具有干物质中硒为1,380ppm的浓度。制备产生的硒酵母产物的食用特征和重复性被以下在实施例2、4、5中描述的方式所测定。

1b)

酵母根据以上实施例1a制备。然而使用了具有150m³体积的发酵罐。营养培养基由相应的成分以相同的相互比例组成，总重量为56848kg。葡萄糖浆和2.5％的氨水以与实施例1a同样的方式被加入。为这一目的使用了13500kg葡萄糖浆和1410.5kg 2.5％的氨水。15kg亚硒酸钠形式的硒被混入。在18小时后终止氨水的加入，在19小时后终止培养。

酵母的洗涤和热处理根据实施例1所描述的原则进行。

酵母的干燥是在一具有旋转喷雾器轮的干燥塔中通过喷雾干燥进行。喷雾器轮的频率设定在167Hz。用于干燥的空气温度设定在200℃。产生的起始温度是86℃。

含水量为7％的粉末总量为5035kg。基于干物质，硒的浓度为1355ppm。制备产生的硒酵母产物的食用特征和重复性被以下在实施例2、4、5中描述的方式所测定。

实施例2

硒酵母的消化性和吸收

2a)硒的体外消化性

作为确定硒酵母体外消化性的基础，使用了The Danish PlantDirectorate 1994 11月15日的9.1方法(猪中酶消化有机物质的测定，即EFOS猪)的进一步发展。此方法被更改了，以便符合人的消化条件。因此，能降解纤维素的酶没有被包括在体外研究中。

原则是先用胃蛋白酶处理，再用胰酶制剂处理。不溶的样品材料被滤出并干燥。通过比较测定的原始样品中的硒和滤液及残留物中的硒含量，从而计算出硒的可消化性。

因此，硒酵母与胃蛋白酶在pH 2.0相混合，在40℃孵育75分钟，然后用胰酶制剂在pH 6.8、40℃处理3小时30分钟。随后用真空的方式过滤，并分别测定滤液和残留物的硒含量。滤液中硒含量占样品总硒含量的百分数表示了硒酵母的体外可消化性。

获得的硒酵母具有以下特征：可消化的硒占99％。

2b)硒的体内吸收和滞留

作为确定体内可消化性的基础，使用了根据本发明的硒酵母，其中将硒-77含量为99.3％的稳定同位素用于培养。因为天然产生的硒只含7.8％的Se-77，同时含有49.82％的Se-80，因此，加入这些同位素后，可以通过使用ICP-MS(即Inductively Coupled Plasma-MassSpectrometry)测量这些同位素，从而测定人材料中的比例。

体内的吸收、滞留和生物可获得性还被进一步测定如下：12位年龄为20到55的男性参加者被给予了相当于300μg硒-77的单一剂量的硒酵母。在5天内收集参加者的粪便和尿液，同一时期收集了11个血样。为了给收集的粪便和尿液设置对照，PABA(即对氨基苯甲酸)和塑料管被分别施用，它们都能作为收集样品的对照而从粪便和尿液中回收。通过比较摄取的和从粪便中提取的硒-77，而确定硒-77的吸收量。

滞留量(即残留的量)是通过摄入的痕量减去与摄入痕量相比通过粪便和尿液排出的量来测定的。血样被用来描述药效动力学。

本发明的硒酵母获得了以下吸收和滞留特征：吸收为89％，滞留为74％。

2c)长期摄取的体内剂量/反应

一空白实验在持续两年的时期内进行，一组49人每天服用一片含量分别为0、100、200或300μg硒的本发明的硒酵母。除此以外，参加者通过他们的食物摄取天然存在于饮食中的硒，其量为大约每天50μg。两年之后已经获得了吸收和排泄的平衡，全血中的硒含量被测定了。

得到了以下结果

 每天的吸收量    (μg) 受试者数目 全血中硒的平 均值(μg/l) 每微克中硒的吸收量    (μg/1/μg) 相对于安慰剂 的增加值(％)     0    17    95.6        -      0     100    11    177.2        0.816      85     200    8    307.6        1.06      222     300    13    440.8        1.15      361

基于以上结果，摄入的硒酵母剂量和全血中的硒含量之间的线性关系可以被确定，并可以用以下的方式表示：全血中的硒(μg/l)＝1.12×摄入量(μg/天)+38

发现的对于本发明硒酵母的反应超过现有技术描述的硒酵母(即Schrauzer，G.N.，Selenium in human nutrition，BioinorganicChemistry，8：303-318(1978))。

2d)长期摄入的副作用测试

在1-2.5年的时期，本发明的硒酵母以100、200或300μg的剂量或安慰剂被提供给806人(平均分成4组)服用。这一时期覆盖了接近1400人-年。在这一时期测试了所有人的耐受和副作用，2.6％即806人中有21人反应有副作用。在随机化终止之前，副作用被划分为：轻微17人，中度4人或严重0人。

随后分析此随机化，副作用随机分布在各组中，8人涉及安慰剂，8人涉及200μg硒，6人涉及300μg硒。结论是副作用并不显著，并且与本发明的硒酵母没有关系。

实施例3

片剂

本发明硒酵母片剂由以下成分制备：

本发明硒酵母

片剂辅料：                微晶纤维素

                          二氧化硅

                          脂肪酸镁盐

流动剂                    磷酸二钙

表面处理剂                羟基丙基甲基纤维素

                          滑石

着色剂                    二氧化钛

这些成分用传统的方式混合，并被压缩成片剂，以便每片含有100μg来自硒酵母的硒。

实施例4

硒酵母的物质形成

以传统方式用糖蜜培养的硒酵母和两批本发明的硒酵母被用来检测各种硒化合物的含量。样品在无氧环境中进行酸水解，并用巯基乙酸作为稳定剂。随后结合实验室参考，通过HPLC测定硒代甲硫氨酸和亚硒酸钠的含量。

糖密培养的硒酵母，在可抽提的及HPLC可接近的部分中硒代甲硫氨酸的含量为49％，而本发明两个独立生产批次的硒酵母在可抽提的及HPLC可接近的部分中硒代甲硫氨酸的含量分别为72.8和72.9％。

总硒的可抽提部分占95到101％，其中约有80％可以通过HPLC的方式被测试。总硒中1-硒代甲硫氨酸的最小真实量因此为72.8％×95％×80％＝55.3％。最大可能的真实量接近90％。测得的亚硒酸钠的量低于1％。可以使用Erik.H.Larsen等人描述的方法(即Larsen，E.H.等人，J.Anal.At.Spectrom，16，1403-1408，2000)测定硒的种类。

在该实施例中，可重复性的重要性胜于实际的真实量。

实施例5

硒酵母和无机硒的体内吸收

与实施例2b)应用的方法一样，本发明的硒酵母与无机硒-77被提供给相同的12个测试者服用。人对两种硒来源的吸收分别为89％(本发明硒酵母)和23％(无机硒)。