ALBSIN/IL－18MAT杂交细胞因子

摘要

ALBSIN是人血清白蛋白的信号肽，IL－18MAT为人IL－18的成熟肽。本发明采用基因重建方法，获得ALBSIN与IL－18MAT的嵌合分子。从人基因组DNA扩增ALBSIN序列；由人IL－18原核表达质粒获得IL－18MAT序列。以非对称PCR技术得到ALBSIN编码区的反义链和IL－18MAT正链。采用重叠延伸PGR(SOE－PCR)产生具有ALBSIN与IL－18MAT的杂交编码序列。定向插入pcDNA3，构建杂交IL－18的真核表达质粒。测序显示重组质粒的表达框由两个设计的靶序列构成，且无移码。该表达质粒转染293、Vero和7721细胞，表达具有生物活性的人IL－18。

说明书

技术领域：

本发明属于生物领域，特别是涉及一种IL-18基因的重组及生产方法。

背景技术：

IL-18是单核因子，有两种存在形式：即前体(ProIL-18)和成熟肽，ProIL-18的1-35氨基酸残基为先导序列。在其分泌细胞中，caspase-1酶识别35位天冬氨酸残基，酶切该氨基酸残基构成的肽键，形成成熟IL-18并分泌出胞，发挥生物学作用。文献报道IL-18可作为肿瘤疫苗的免疫佐剂，可能应用于癌症的生物治疗。由于肿瘤细胞中大多缺乏caspas-1，因此，转染IL-18的肿瘤瘤苗难以起到预期作用。

技术内容：

在IL-18_MAT序列前加上ALB_SIN序列，IL-18_MAT直接通过信号肽途径分泌到胞外，即分泌诱导针对肿瘤免疫应答的IL-18_MAT杂交细胞因子。

本发明重组的核苷酸/氨基酸片段序列是：

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本发明ALB_SIN/IL-18_MAT杂交细胞因子的制备方法是从人的基因组DNA扩增ALB_SIN序列；再从人IL-18真核表达质粒中获得IL-18_MAT序列，然后，通过非对称PCR技术得到ALB_SIN编码区的反义链和IL-18_MAT肽正链，最后，采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)产生具有ALB_SIN与IL-18_MAT的杂交编码序列，产物双酶切后与质粒pCDNA₃连接构建杂交IL-18的表达质粒并测序。

本发明的特点和积极效果在于在IL-18_MAT序列前加上ALB_SIN序列，可以使细胞IL-18的分泌不受caspas-1的限制，而是通过信号肽的分泌途径出胞，使得IL-18在发挥抗肿瘤的免疫佐剂作用时，不再拘泥与能表达caspas-1的细胞，同时也提高了IL-18的分泌量。ELISA分析证明重组质粒转染肿瘤细胞系，可测出高水平人IL-18表达。

具体实施方式：

一、IL-18的重组

1、PCR引物设计与合成：共设计2对引物。

克隆引物对：①5’-CCCGCAAGCTTATGAAGTGGGTAACCTT-3’

              (含HindIII酶切位点及起始密码子)

            ②5’-ATTGGGCCCCTAGTCTTCGTTTTGAACA-3’

              (含ApaI酶切位点及终止密码子)

杂交引物对：用于两个靶序列拼接

            ③5’-CTTATTCCTACTTTGGCAAGCTTGAA-3’

            ④5’-TGCCAAAGTAGGAATAAGCCGAGCTAAAGA-3’。

下划线为两种引物5’端互补序列。

2、基因组DNA的提取

按常规由人外周血单个核细胞提取基因组DNA。纯度和浓度采用分光光度计法测量。DNA浓度为328.5μg/ml。

3、PCR扩增

(1)对称PCR：

以基因DNA为模板，加入引物①④，扩增ALB_SIN序列；上述反应体系中再加入dNTP2l、Tag聚合酶2.5U、10×Tag酶反应缓冲液5l、Mg²⁺(25mM/L)9μl、加双蒸水至50l。循环扩增程序为：变性94℃45s、复性57℃15s、延伸72℃20s，共30个循环，充分延伸72℃5min。琼脂糖凝胶，电泳鉴定PCR产物后用DNA纯化试剂盒回收。

以人IL-18重组表达质粒为模板，加入引物②③，扩增IL-18_MAT序列，上述反应体系中再加入dNTP3l、Tag聚合酶2.5U、10×Tag酶反应缓冲液5l、Mg²⁺(25mM/L)5.5μl、加双蒸水至50l。循环扩增程序为：变性94℃45s、复性57℃15s、延伸72℃45s，共30个循环，充分延伸72℃5min。琼脂糖凝胶，电泳鉴定PCR产物后用DNA纯化试剂盒回收。

(2)非对称PCR(Asymmetric PCR)：

模板系2μl对称PCR产物，并使用单一引物①或④进行非对称PCR。循环扩增程序为：变性94℃45s、复性57℃15s、延伸72℃60s，共20个循环，充分延伸72℃5min。产物鉴定采用非变性连续聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度8％。

(3)SOE-PCR：

ALB_SIN的对称PCR产物与IL-18_MAT的非对称PCR产物以1∶100比例混合，作为SOE-PCR的模板，加入引物①②。上述反应体系中再加入10×PCR buffer(无Mg²⁺)5μl，d NTP 3μl，Mg²⁺(25mM/L)10μl，TaqEx酶0.5μl。首次循环的条件为：变性94℃45s；退火37℃10min；延伸72℃2min以便重叠延伸。继而变性94℃45s；退火57℃15s；延伸72℃60s的条件下作30个循环。

二、构建真核表达质粒pcDNA₃-IL-18^hyb

1、双酶切反应：

用HindIII和ApaI分别制备有粘性末端的IL-18重组基因和线性载体pcDNA₃。

2、DNA片段的连接：

反应体系中IL-18重组基因和线性载体pcDNA₃的体积比为1∶15。16℃，连接12-16小时。

3、杂交IL-18的鉴定

(1)PCR鉴定：

以pcDNA₃-IL-18^hyb为模板，分别用引物①④、引物②③、引物①②做三组PCR。并设立两个对照，分别以基因组DNA和人IL-18重组表达质粒为模板，相应引物为①④和②③。琼脂糖电泳鉴定。

(2)重组质粒测序，(ABI PRISM^TM377XL DNA sequencer)。鉴定结果显示：pcDNA₃-IL-18^hyb的插入序列为548bp。含有ALB_SIN与IL-18_MAT序列，并且无移码。图谱如下：

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三、真核表达质粒的活性鉴定

1、真核表达质粒的转染

(1)5×10⁵的293、Vero或7721细胞分别接种于35cm培养皿，37℃，5％CO₂的条件下24小时，使细胞贴壁生长。次日转染前重悬在2ml无血清1640。

(2)10μg重组质粒DNA加于2μl lipofectamine中，加无血清1640 200μl，室温45分，加19％血清1640800μl后注入细胞培养，转染24hrs。

2、人IL-18检测：100μl培养上清加于IL-18 ELISA试剂盒，常规操作，OD₄₉₀表示培养上清的IL-18含量，此杂交IL-18克隆的转染细胞目的基因表达和分泌量明显高于野生型IL-18克隆。

本发明的意义在于：(1)IL-18在诱导特异性T细胞免疫应答的过程中起重要的免疫佐剂作用；肿瘤瘤苗转染杂交IL-18克隆，通过产生高水平IL-18而激活针对肿瘤的杀伤性T细胞。(2)构建肿瘤抗原特异性的基因疫苗，插入本发明建立的杂交IL-18序列做共表达，可能促进抗原特异性辅助T细胞增殖，从而促进肿瘤排斥。