制备(3R,5S)－(E)－7－2－环丙基－4－(4－氟苯基)－喹啉－3－基－3,5－二羟基庚－6－烯酸酯的方法

摘要

一种制备式(IV)的化合物的方法，式(IV)中R表示氢原子、烷基或芳基，该方法的特征在于用能立体选择性还原酮基的微生物细胞和/或其细胞制品还原选自下列的化合物：其中R与式(IV)中定义相同的式(I)所示化合物、其中R与式(IV)中定义相同的式(II)所示化合物、其中R与式(IV)中定义相同的式(III)所示化合物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备(3R，5S)-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯的新方法。这种化合物可用作在JP 1-279866 A中公开的“3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂”的一种合成中间体，而这种抑制剂可用于降低血胆固醇。

此外，本发明还涉及一种制备β-二酮羧酸酯衍生物的新方法，上述(3R，5S)-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯的合成需要这种衍生物。

背景技术

作为化学制备(3R，5S)-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯的方法来说，例子有公开于JP 1-279866 A和Journal of Chromatography A，832(1999)p55-65中的下面制备方法。

然而在这些方法中，反应产物为旋光异构体和旋光物的混合物，因此应在其各自的最终步骤通过层析分离和纯化获得所需的旋光化合物。而在工业规模的生产中在最终步骤进行异构体的分离要达到经济和有效是相当困难的。

此外，JP 8-92271 A公开了使用一种旋光席夫碱的另一种制备方法。

还有，JP 8-127585 A公开了一种在非常低温度下使用(R)-3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-6-二甲氧基氧膦基-5-甲基氧代己酸甲酯的制备方法。

另一方面，作为一种使用微生物细胞和/或其细胞制品通过立体选择性还原具有酮基的化合物制备旋光醇产物的方法来说，在Appl.Microbiol.Biotechnol.(1998)49：p.709-717中描述了使用Microbacterium campoquemadoensis strain MB5614进行下面的化学反应。

此外，在Bioorg.Med.Chem.Lett.，8卷p1403-(1998)中描述了使用发面酵母进行下面的反应。

但是，就在羰基的α位存在烯且分子中还持续存在羰基的化合物如(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二氧代庚-6-烯酸酯来说，在本领域还没有为人们所知的使用微生物以立体选择性方式还原这种化合物的例子。

发明的公开

因此，需要开发一种能经济地以工业规模制备(3R，5S)-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯的方法。

为了解决上述问题，本发明人进行了一次次广泛深入地研究，发现当以下面的式(I)到(III)和(II′)及(III′)表示的化合物作为原料时可获得高光学纯度的所需产物，该发现导致了本发明的完成。所以，本发明的要旨是制备下式(IV)表示的化合物的方法：

(其中R表示氢原子、烷基或芳基)，该方法包括用能立体选择性还原酮基的微生物细胞和/或其细胞制品反应还原选自下面的一种化合物：

由下面式(I)代表的化合物：

(其中R与式(IV)中的定义相同)、

由下面式(II)代表的化合物：

(其中R与式(IV)中的定义相同)、

由下面式(III)代表的化合物：

(其中R与式(IV)中的定义相同)。

此外，本发明的另一要旨是一种制备化合物(I)的方法，包括使下面式(A)代表的2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-醛

与下面式(B)代表的化合物

(式中R代表氢原子、烷基、芳烷基或芳基)进行缩合反应。

实施本发明的最佳方式

下文将详细描述本发明。

本发明提供了一种制备(3R，5S)-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯的方法，该方法包括用能立体选择性还原酮基的微生物细胞和/或其细胞制品反应还原选自下面的一种化合物：

由下面式(I)代表的化合物：

(其中R代表氢原子、烷基或芳基)；

由下面式(II)代表的化合物：

(其中R与式(I)中的定义相同)；和

由下面式(III)代表的化合物：

(其中R与式(I)中的定义相同)。

在上式(I)-(III)所代表的用作本发明制备方法原料的化合物中，R代表氢原子、烷基或芳基。

所述烷基可以是例如甲基、乙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环己基、苯甲基或苯乙基等烷基或可被芳基取代的直链、支链或环状烷基。

所述芳基可以是可被一个烷基取代的苯基或萘基如苯基、2，4，6-三甲苯基或萘基。

上面的R优选为C₁-C₄烷基、苄基或苯基，更优选为C₁-C₄烷基，特别优选甲基或乙基。

按照本发明的制备方法，式(II)和(III)代表的化合物可分别是由下面式(II′)

(式中R与前述定义相同)和下面的式(III′)

(式中R与前述定义相同)表示的旋光物。

由式(I)-(III)和(II′)和(III′)代表的化合物可任选用在JP 1-279866A、JP 8-127585 A、JP 5-178841 A等中公开的方法和本领域人们熟悉的方法的组合来制备。

此外，作为制备式(I)化合物的一种优选方法，本发明人提供了下面的方法，其中所述化合物可通过使式(A)的2-环戊基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-醛：

与式(B)的化合物：

(其中R代表氢原子、烷基、芳烷基或芳基)缩合反应获得。通过使用这种方法，可容易和有效地制备上面式(I)的化合物。

化合物(A)和化合物(B)间的缩合反应可通过与所谓的醛醇缩合反应相同的操作来进行。一般来说，优选实施在含化合物(B)的溶液中加入碱然后在氮气或惰性气氛下滴入含化合物(A)的溶液的方法。

用于上述缩合反应的碱包括：碱金属或碱土金属的氢化物如氢化钠、氢化钾和氢化钙；烷基锂试剂诸如正丁基锂和叔丁基锂；格利雅试剂诸如叔丁基氯化镁；碱金属烷氧化物诸如乙氧钠；和NaNH₂。此外，可包括碱土金属氧化物如氧化镁等的固体碱。其中，优选碱金属或碱土金属的氢化物和NaNH₂，更优选碱金属氢化物，特别优选氢化钠。

一般相对于化合物(B)来说，碱的用量为1.5当量或以上，优选2当量或以上。如果过量使用，就可能发生副反应而导致收率的下降。所以，一般的用量为10当量或以下的范围。在上述范围内，优选在2到3当量的范围，特别优选2到2.7当量的范围。

所述反应通常使用溶剂来进行。所用的溶剂包括：芳烃溶剂如甲苯、苯和二甲苯；醚溶剂诸如甲基叔丁基醚、二甲氧基乙烷和四氢呋喃；卤代烃溶剂诸如二氯甲烷；和非质子性溶剂诸如N，N-二甲基甲酰胺。其中优选的溶剂是在20℃具有2.5或以上介电常数、更优选具有5或以上介电常数的溶剂。上述优选溶剂的具体例子包括四氢呋喃、二甲氧基乙烷、N，N-二甲基甲酰胺和N，N-二甲基咪唑啉酮，特别优选四氢呋喃。

溶剂的用量通常约为反应物料体积的0.5到100倍。从工业观点来看，优选采用20倍体积或以下的范围。

作为反应操作来说，化合物(A)可在碱和化合物(B)混合后加入，可将碱和化合物(B)的混合物加入到化合物(A)中，可将化合物(A)和(B)的混合物可加入到碱中，或者可将碱加入到化合物(A)和(B)的混合物中。在任何一种操作中，均可进行所述反应。但是，优选的方法是先混合碱和化合物(B)，然后将化合物(A)加入到混合物中。

所述反应可在-50℃到100℃下进行，优选在-20℃到40℃下进行，通常进行30分钟或以上，优选1小时或以上。如果需要，也可升高温度。

在反应结束后，可向反应体系中加入水、乙酸、氯化铵等使反应停止，可通过常规分离和纯化操作诸如用水洗和分液萃取获得化合物(I)。

在化合物(A)和化合物(B)间的缩合反应中，通过选择所用的碱和溶剂，化合物(I)也可在形成作为中间体的下面通式(C)的化合物[下文称为化合物(C)]或其盐：

(式中R如前述定义，R²为羟基、卤基、甲硅烷氧基、磺酰氧基、酸基、烷氧基羰氧基、烷硫羰氧基、烷氧硫基羰氧基或烷硫硫基羰氧基)后形成。

在上述化合物(C)中，R可使用与前面所述相同的基团。此外，R²是指：羟基；卤素原子如氯原子和溴原子；甲硅烷氧基诸如三甲基甲硅烷氧基和叔丁基二甲基甲硅烷氧基；磺酸基诸如甲烷磺酸基和对甲苯磺酸基；酸基诸如乙酸基和丙酸基；烷氧基羰氧基诸如甲氧基羰氧基和乙烯氧基羰氧基；烷硫基羰氧基诸如甲硫基羰氧基；烷氧基硫代羰氧基诸如甲氧基硫代羰氧基；或烷硫基硫代羰氧基诸如甲硫基硫代羰氧基。在这些基团中，优选羟基、磺酸基或酸基，更优选酸基并特别优选乙酸基。

提供作为上述化合物(C)的取代基的优选组合可以是优选的R和R²的组合，其已在上面取代基的说明中述及。

下面描述将上述化合物(C)用作中间体时的一个具体反应步骤。例如在化合物(A)和化合物(B)间的缩合反应中通过使用NaH和正丁基锂的组合作为碱，获得了在化合物(C)中R²为羟基的中间体。然后，通过进行该中间体的脱水反应来获得化合物(I)。或者，化合物(I)可通过将中间体的羟基转变成另一官能团如卤素等消去官能团来获得。这里，上面NaH的用量约为与化合物(A)等摩尔，正丁基锂的用量约为1.5-2.5当量。此外，上述的脱水反应和官能基的消去反应可使用常规人们熟悉的方法适当地进行。

在分离通过上述方法制备的化合物(I)的时候，当上述化合物(I)以盐的形式提供时，分离可更容易地进行。因此，所述化合物可以盐的形式获得。化合物(I)的盐可通过加酸于有机相中以酸加成盐形式获得，该有机相在制备反应终止后用水洗涤并分离萃取，同时根据需要浓缩和/或冷却并接着搅拌而获得。使用氨和胺替代酸，可获得铵盐和胺加成盐。当化合物(I)以盐的形式获得时，优选在将化合物(I)进行还原反应时使用下述的微生物细胞和/或其细胞制品消去盐而获得化合物(I)。

本发明的特征在于在上式(I)-(III)的化合物中，酮基通过使用微生物细胞和/或其细胞制品被立体选择性还原。

只要能立体选择性还原酮基，用于本发明的微生物可以是任选微生物。

更具体地说，可使用下列微生物：梅奇酵母属微生物如美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、二尖梅奇酵母(Metschnikowiabicuspidate)、鲁考弗梅奇酵母(Metschnikowia reukaufii)和Metschnikowia lunata；隐球菌属微生物如Cryptococcus curvatus、黄隐球菌(Cryptococcus flavus)、Cryptococcus humicolus和罗伦隐球菌(Cryptococcus laurentii)；假丝酵母属微生物如白假丝酵母(Candidaalbicans)、Candida azyma、间型假丝酵母(Candida intermedia)、马铃薯假丝酵母(Candida solani)、法氏假丝酵母(Candida famata)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和Candida molischiana；网孢菌属(Filobasidium)微生物如Filobasidium capsuligenum；Ogataea属微生物如Ogataea glucozyma和Ogataea minuta；固囊酵母属的微生物如固囊酵母(Citeromycesmatritensis)；西洋蓍霉属(Yarrowia)微生物如Yarrowia lipolytica；红酵母属微生物如红酵母(Rhodotorula glutinis)；橙黄红酵母(Rhodotorulaaurantiaca)和胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)；外瓶霉属微生物如皮炎外瓶霉(Exophiala dermatitidis)；三角酵母属微生物如三角酵母(Trigonopsis variabilis)；Shizosaccharomyces属微生物如Shizosaccharomyces pombe；拟威克酵母属微生物如拟威克酵母(Wickerhamiella domercqii)；毕赤酵母属如Pichia petersonii和Pichiaanomala；复膜孢酵母属如Saccharomycopsis fibuligera和Saccharomycopsis crataegensis；Saitoella属微生物如Saitoellacomplicata；酵母属微生物如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；红冬孢酵母属微生物如红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)；不动杆菌属微生物如乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)；短杆菌属微生物如扩展短杆菌(Brevibacterium linens)和解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)；纤维单胞菌属微生物如凝胶纤维单胞菌(Cellulomonas gelida)、产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)和潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)；棒状杆菌属微生物如产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、Corynebacterium vitaeruminis和变异棒杆菌(Corynebacteriumvariabile)；和短小杆菌属微生物如萎蔫短小杆菌(Curtobacteruimflaccumfaciens)。

作为上述微生物的具体例子来说，优选美极梅奇酵母IFO0863菌株、美极梅奇酵母IAM12196菌株、美极梅奇酵母IAM12197菌株、美极梅奇酵母IFO1407菌株、美极梅奇酵母IFO10796菌株、二尖梅奇酵母IFO1408菌株、鲁考弗梅奇酵母IFO10798菌株和Metschnikowia lunata IFO1605菌株；Cryptococcus curvatus IFO1159菌株、Cryptococcus humicolus IFO10250菌株、黄隐球菌IFO0407菌株、和罗伦隐球菌IFO0609菌株、罗伦隐球菌IFO1376菌株、罗伦隐球菌罗伦变种(Cryptococcus laurentii var laurentii)CBS5539菌株、罗伦隐球菌罗伦变种CBS2174菌株、罗伦隐球菌罗伦变种CBS5746菌株、罗伦隐球菌罗伦变种CBS7140菌株和罗伦隐球菌罗伦变种CBS7235菌株；白假丝酵母IFO1594菌株、Candida azyma JCM1691菌株、间型假丝酵母IFO0761菌株、马铃薯假丝酵母IFO0762菌株、法氏假丝酵母RIFY7455菌株(也可以是IFO0856菌株)、季也蒙假丝酵母IFO0566菌株、近平滑假丝酵母CBS0604菌株、皱落假丝酵母IFO0591菌株、热带假丝酵母IFO0618菌株、热带假丝酵母IFO1404菌株、热带假丝酵母IFO1647菌株和Candida molischiana IFO10296菌株；Filobasidium capsuligenum IFO1119菌株和Filobasidiumcapsuligenum IFO1185菌株；Ogataea glucozyma IFO1472菌株和Ogataea munuta var nonfermentans IFO1473菌株；固囊酵母IFO0651菌株和固囊酵母IFO0954菌株；Yarrowia lipolytica IFO1209菌株；红酵母dairenensis变种(Rhodotorula glutinis var dairenensis)IFO0415菌株、红酵母glutinis变种(Rhodotorula glutinis var glutinis)IFO0395菌株；橙黄红酵母IFO0754菌株、Rhodoforula mucilaginosa IFO0003菌株；胶红酵母IFO0003菌株；皮炎外瓶霉IFO6421菌株和皮炎外瓶霉IFO8193菌株；三角酵母CBS1040菌株和三角酵母IFO0671菌株；Shizosaccharomyces pombe IFO0344菌株和Shizosaccharomycespombe IFO1628菌株；拟威克酵母IFO1857菌株；Pichia petersoniiIFO1372菌株和Pichia anomala IFO0118菌株；Saccharomycopsisfibuligera IFO0105菌株和Saccharomycopsis crataegensis IFO1708菌株；Saitoella complicata IAM12963菌株；酿酒酵母JCM1818菌株、酿酒酵母IFO0565菌株和酿酒酵母IFO0305菌株；红冬孢酵母IFO0559菌株；乙酸钙不动杆菌IFO12552菌株；扩展短杆菌JCM1328菌株和解糖短杆菌ATCC14066菌株；凝胶纤维单胞菌JCM1489菌株、产黄纤维单胞菌JCM1490菌株和潮湿纤维单胞菌JCM1492菌株；产氨棒杆菌JCM1305菌株、谷氨酸棒杆菌JCM1307菌株、谷氨酸棒杆菌ATCC12813菌株、谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株、谷氨酸棒杆菌ATCC13826菌株、谷氨酸棒杆菌ATCC14067菌株、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870菌株、Corynebacteruim vitaeruminis JCM1323菌株和变异棒杆菌JCM2154菌株；和萎蔫短小杆菌ATCC12813菌株。

上述微生物优选属于梅奇酵母属、隐球菌属、假丝酵母属、网孢菌属、Ogataea属、固囊酵母属、红酵母属、外瓶霉属、Shizosaccharomyces属、拟威克酵母属、毕赤酵母属、复膜孢酵母属、Saitoella属、酵母属、红冬孢酵母属、短杆菌属或产氨杆菌属。

此外，对于梅奇酵母属微生物来说，优选美极梅奇酵母和鲁考弗梅奇酵母。

对于隐球菌属微生物来说，优选黄隐球菌、Cryptococcus humicolus和罗伦隐球菌。

对于假丝酵母属微生物来说，优选间型假丝酵母、马铃薯假丝酵母、法氏假丝酵母和Candida molischiana。

对于网孢菌属微生物来说，优选Filobasidium capsuligenum。

对于属于Ogataea属的微生物来说，优选Ogataea glucozyma和Ogataea minuta。

对于固囊酵母属的微生物来说，优选固囊酵母。

对于红酵母属微生物来说，优选红酵母、橙黄红酵母和胶红酵母。

对于外瓶霉属微生物来说，优选皮炎外瓶霉。

对于Shizosaccharomyces属微生物来说，优选Shizosaccharomycespombe。

对于拟威克酵母属微生物来说，优选拟威克酵母。

对于毕赤酵母属微生物来说，优选Pichia petersonii和Pichiaanomala。

对于复膜孢酵母属微生物来说，优选Saccharomycopsisfibuligera。

对于Saitoella属微生物来说，优选Saitoella complicata。

对于酵母属微生物来说，优选酿酒酵母。

对于红冬孢酵母属微生物来说，优选红冬孢酵母。

对于短杆菌属微生物来说，优选解糖短杆菌。

对于棒状杆菌属微生物来说，优选产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌和Corynebacteruim vitaeruminis。

此外，当使用式(I)化合物作为原料生产式(IV)化合物时，可通过式(II’)化合物或式(III’)化合物制备中间体。

在这种情况下，式(II’)化合物和式(III’)化合物预先由式(I)化合物制备。然后它们被分离和导入到式(IV)化合物中。或者，可在没有分离式(II’)化合物和式(III’)化合物条件下直接制备式(IV)化合物。

还有，在使用式(I)化合物作为原料的情况下，式(IV)化合物可使用一种微生物生产，或者可一起使用两种或多种微生物生产。

当使用式(I)化合物时，特别优选的作为原料的微生物是：属于隐球菌属、假丝酵母属、网孢菌属、Ogataea属、西洋蓍霉属、红酵母属、外瓶霉属、三角酵母属的微生物，更优选属于隐球菌属、假丝酵母属、网孢菌属、Ogataea属和红酵母属的微生物，最优选属于Ogataea属的微生物。

当使用式(II)化合物时，特别优选的作为原料的微生物是：属于梅奇酵母属、隐球菌属、假丝酵母属、网孢菌属、Ogataea属、固囊酵母属、西洋蓍霉属、红酵母属、外瓶霉属、三角酵母属、Shizosaccharomyces属、拟威克酵母属、复膜孢酵母属、Saitoella属、毕赤酵母属、酵母属、红冬孢酵母属、不动杆菌属、短杆菌属、纤维单胞菌属、棒状杆菌属和短小杆菌属。

更优选上述微生物属于梅奇酵母属、隐球菌属、假丝酵母属、网孢菌属、Ogataea属、固囊酵母属、红酵母属、Shizosaccharomyces属、拟威克酵母属、复膜孢酵母属、Saitoella属、毕赤酵母属、酵母属、红冬孢酵母属、短杆菌属和棒状杆菌属；再更优选属于梅奇酵母属、假丝酵母属、Ogataea属、红酵母属、Shizosaccharomyces属、拟威克酵母属、复膜孢酵母属、Saitoella属、红冬孢酵母属、短杆菌属和棒状杆菌属；最优选上述微生物属于梅奇酵母属、假丝酵母属、Ogataea属、Shizosaccharomyces属、Saitoella属、红冬孢酵母属、短杆菌属和棒状杆菌属。

当使用式(III)化合物时，特别优选的作为原料的微生物是：属于隐球菌属、假丝酵母属、网孢菌属、红酵母属和毕赤酵母属的微生物；更优选属于隐球菌属、假丝酵母属和红酵母属的微生物。

注意在上述的微生物中，IFO编号的微生物描述于Institute forFermentation，Osaka(IFO)发布的互联网目录表(http：//www.ifo.or.jp)中，它们可从IFO获得。

CBS编号的微生物描述于The Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)的互联网目录表(http：//www.cbs.knaw.nl)中，它们可从CBS获得。

ATCC编号的微生物描述于The American Type Culture Collection(ATCC)中的互联网目录(http：//www.atcc.org)中，它们可从ATCC获得。

IAM编号的微生物描述于IAMCulture Collection(IAM)的互联网目录(http：//www.iam.u-tokyo.ac.jp/misyst/ColleBox/IAMcollection.html)中，它们可从IAM获得。

JCM编号的微生物描述于the Japan Collection ofMicroorganism(JCM)的互联网目录(http：//www.jcm.riken.go.jp)中，它们可从JCM获得。

各RIFY编号微生物描述于the Research Institute of Fermentation，Yamanashi Univ.Kofu Japan(RIFY)的目录中并且可从RIFY获得。

作为上述的微生物来说，可使用野生株和通过常规的诱变处理如紫外线辐照或NTG处理获得的突变株。或者，也可以使用任何株诸如通过基因技术如细胞融合或基因重组诱导的重组株。

此外，作为重组株的表达株，可使用细菌诸如非原始株的大肠杆菌或酵母，其重组株也包括在上述微生物的概念中。

在本发明的制备过程中，可将一种或两种或多种上述微生物作为微生物细胞和/或其细胞制品供应到反应物中。

具体而言，可不经任何处理使用通过培养上述微生物获得的微生物细胞。或者可使用人们熟悉的技术诸如丙酮处理、冷冻干燥处理、微生物细胞或其处理产物的机械或酶碎裂等处理经培养获得的微生物细胞而得到的细胞制品。此外，也可从这些微生物细胞或其细胞制品提取粗产物形式或纯化产物形式的具有还原能力的酶成分。还有，也可能使用用常规固定技术固定在载体如聚丙烯酰胺或角叉菜胶上的如上述获得的微生物细胞、微生物细胞加工产物、酶成分等。因此，在本专利说明书中，术语“微生物细胞和/或其细胞制品”作为包括所有上述的微生物细胞、微生物细胞处理产物、酶成分和其固定产物的概念使用。

接着，将具体描述本发明的制备方法。

在本发明的制备方法中，微生物通常在培养后使用。这种培养可通过常规技术进行。用于培养本发明微生物的培养基包括可被微生物同化的碳源、氮源、无机离子等。就碳源而言，适合使用碳水化合物诸如葡萄糖、果糖和蔗糖，多元醇诸如二甘醇、甘露糖醇和木糖醇，有机酸等。就氮源而言，适合使用有机氮源如NZ胺、triptose、酵母提取物、聚胨、肉提取物和大豆提取物，或使用无机氮源诸如硫酸铵和硝酸铵。就无机离子而言，如果需要，则适合使用磷酸根离子、镁离子、铁离子、锰离子、钼离子等。此外，按需要加入肌醇、泛酸、烟酰胺和其它维生素。

只要碳源、氮源、无机离子和维生素在培养基中的含量在各自常用于菌株培养的范围内，则对其无特别限制。碳源和氮源通常分别以0.001-50％(重量)、优选0.1-5％(重量)的量加入。无机离子通常以0.0001-5％(重量)、优选0.001-1％(重量)的量加入。维生素通常以0.00001-10％(重量)、更优选0.001-1％(重量)的量加入。

所述培养在需氧条件下进行1到100小时，同时将pH调节到约3到11的合适范围内，将温度调节到4℃到50℃的合适范围内。

作为反应方法来说，可适当地使用下面方法：培养本发明的微生物，将式(I)-(III)的各种化合物或其混合物加入到含有所得到的微生物细胞和/或其细胞制品的含水培养基中而获得式(IV)的目标化合物的方法；将式(I)-(III)的各种化合物或其混合物加入到正在培养微生物的培养基中进行反应的方法；停止培养后将式(I)-(III)的各种化合物或其混合物加入到未处理的培养基中并使反应持续进行的方法；将式(I)化合物进行上述任何一种方法处理，反应进行到一定程度后，根据式(I)-(III)化合物的含量，将另外培养的微生物加入到体系中的方法等。

对于上述的含水培养基来说，提供了使用磷酸钠、磷酸钾等的缓冲液，并且在这种缓冲液中，适当地加入了有机溶剂、表面活性剂等。

所述有机溶剂包括水溶性溶剂诸如二甲基亚砜(DMSO)和四氢呋喃(THF)和水不溶性有机溶剂诸如乙酸丁酯和己烷。所述表面活性剂包括吐温80、糖酯等。

缓冲剂的使用浓度可以为1M或更低浓度，优选0.2M或更低浓度。

所述反应可在4-70℃、优选15-50℃的温度和2-9并优选4-8的pH下进行。

式(I)-(III)所示化合物或其混合物的浓度相对于反应溶液来说在0.0001-10％(重量)、优选在0.001-5％(重量)的范围。如果需要，式(I)-(III)的化合物或其混合物可在反应期间补充加入。

此外，为了加速反应，可适当地加入辅酶、辅酶和其再生系统两者或碳源。

所述辅酶一般包括还原形式的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(下文缩写为NADH)或还原形式的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文缩写为NADPH)。其加入量可以为反应物料的1000000分之一当量到10当量，优选10000分之一当量到10当量。

辅酶的再生系统可以是甲酸脱氢酶等能将β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(下文缩写为NAD)还原成NADH的酶和酶底物(甲酸)的组合，葡萄糖脱氢酶等能将β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(下文缩写成NADP)还原成NADPH的酶和酶底物(葡萄糖等)的组合。再生辅酶的这些酶可以是市场购置的产品，或者可以是具有辅酶再生能力的微生物细胞和/或其细胞制品。这些系统的加入量适合于根据反应物的量确定。

用于加速上述反应的碳源可以是任何可用于反应中所用的微生物细胞和/或其细胞制品进行辅酶再生的碳源。例如，所述碳源包括碳水化合物诸如葡萄糖、果糖和蔗糖，以及多元醇如二甘醇、甘露糖醇和木糖醇及有机酸等，其加入量为0.0001-50％(重量)，优选0.01-10％(重量)。

正如上面所述，所述反应使用水介质来进行。然而，式(I)-(III)的化合物具有低的水溶性，因此优选在将化合物加入前事先将化合物通过溶解或悬浮于有机溶剂、表面活性剂等中而均匀分散于反应系统中。

对于通过上述制备方法获得的式(IV)化合物来说，其杂质通常通过常规的纯化方法即在用有机溶剂从反应溶液萃取后用层析和结晶技术去除而获得纯化的式(IV)化合物。具体而言，将式(IV)化合物用有机溶剂溶解后，通过用于离心、压滤、超滤等的常规分离器去除包括微生物在内的固体成分而获得含式(IV)化合物的液体。杂质则使用常规的方法如层析法或结晶技术从得到的液体中去除。这样可获得纯的式(IV)化合物。

下文中将参照实施例更详细地说明本发明的情况。但是，在没有背离本发明的要旨情况下可在本发明的技术领域内进行常规的修改。

同时，除了目标的(3R，5S)异构体外，所述(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯(下文简写为“DOLE”)具有异构体：(3S，5R)-异构体、(3R，5R)-异构体和(3S，5S)-异构体。其结构式如下。

3S，5R-DOLE和3R，5S-DOLE是DOLE的顺式异构体，3S，5S-DOLE和3R，5R-DOLE是DOLE的反式异构体。

在实施例中，目标产物(3R，5S)-异构体的纯度由非对映体过剩率和对映体过剩率来表示。在本专利说明书中，非对映体过剩率由(顺-DOLE-反-DOLE)/(顺-DOLE+反-DOLE)表示，对映体过剩率由(3R，5S异构体-3S，5R异构体)/(3R，5S异构体+3S，5R异构体)表示。

顺-DOLE

反-DOLE

制备实施例1

(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(下文简称为DOXE)的合成

在一个配有搅拌器、滴液漏斗和温度计的500ml四颈烧瓶中加入5.02g(11.22mmol)(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羟基-3-氧庚-6-烯酸乙酯(下文简称为5-MOLE)和420mL丙酮并搅拌。然后在0℃用20分钟滴加10.5mL制备的Jones氧化剂(即混合3mL浓硫酸和3.35g氧化铬并用水稀释到25mL获得的试剂)，然后在冰冷却下搅拌2小时，接着小心加入10mL甲醇终止反应。随后减压蒸馏反应混合溶液以除去丙酮，接着加入250mL乙酸乙酯。得到的溶液用60mL饱和碳酸氢钠水溶液萃取和分离两次，然后用60mL饱和盐水溶液萃取和分离两次，接着用无水硫酸镁脱除乙酸乙酯溶液的水分。随后蒸馏掉溶剂，用硅胶柱层析(洗脱溶剂：2∶1己烷∶乙酸乙酯)纯化而得到3.03g标题化合物(收率60.6％)。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃，δppm)：7.79-7.19(8H，m)，7.71(1H，d)，6.03(1H，d)，5.51(1H，s)，4.21(2H，q)，3.40(2H，s)，2.35-2.40(1H，m)，1.39-1.41(2H，m)，1.28(3H，t)，1.07-1.09(2H，m).

制备实施例2

5S-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羟基-3-氧庚-6-烯酸乙酯(下文简称为5S-MOLE)的合成

向减压下加热干燥后导入氮气的Schlenk试管中加入0.87g(3.3mmol)(S)-2-[N-(3，5-二叔丁基亚水杨基)氨基]-3-甲基-1-丁醇、5mL二氯甲烷和0.63mL(6.0mmol)四乙氧钛并在室温下搅拌混合1小时。将Schlenk试管冷却到-50℃后，将0.95g(3.0mmol)(E)-3-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-丙-2-烯-1-醛溶解于2mL二氯甲烷后滴加。搅拌5分钟后，再加入0.51g(6mmol)双烯酮，在将温度保持在-50℃的同时搅拌22小时进行反应。将得到的反应混合溶液加入到25mL二氯甲烷和25mL 0.24M碳酸氢钠水溶液的混合物中，在室温下剧烈搅拌2小时获得两层溶液。将两层溶液分离。水层用10mL二氯甲烷萃取两次。合并二氯甲烷层和萃取液得到二氯甲烷溶液。将合并的二氯甲烷溶液用无水硫酸镁干燥并将溶剂蒸除，用硅胶柱层析(洗脱溶剂为3∶2己烷∶乙酸乙酯)纯化得到0.75g 5S-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羟基-3-氧庚-6-烯酸乙酯(光学纯度：73％ee，对(E)-3-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-丙-2-烯-1-醛的收率：56％)。

制备实施例3

7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羟基-3，5-二氧庚酸乙酯的合成

在2.40g油状60％氢化钠和200mL四氢呋喃的混合溶液中，在将内部温度保持在2℃或以下的情况下用20分钟滴加10.3g 3，5-二氧己酸乙酯和40mL四氢呋喃的混合溶液。在-10℃下反应50分钟后，在内部温度保持在-20℃到-15℃间的情况下，用40分钟滴加75mL1.6M正丁基锂的己烷溶液，让反应在2℃或以下内部温度下进行40分钟。这时，再将内部温度保持在-15℃或以下，用40分钟滴加11.7g2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-醛和80mL四氢呋喃的混合物，然后在10℃或以下的温度下反应1小时。再将内部温度保持在5℃或以下，将14.4mL乙酸和40mL甲苯加入到反应体系中，接着用100mL水和100mL饱和盐水顺序洗涤。蒸发掉溶剂后，向残渣加入100mL己烷和5mL乙酸乙酯进行结晶，经过滤和干燥获得16.6g(收率：89％)7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羟基-3，5-二氧庚酸乙酯。

该化合物的NMR如下：

¹H-NMR(CDCl₃)：1.11(2H，m)，1.13(1H，m)，1.27(3H，t，J＝10)，1.76(1H，m)，2.40(1H，m)，2.48(2H，ABq，J＝66,14)，2.69(2H，ABq，J＝52,16)，2.78(1H，m)，3.30(1H，m)，4.18(2H，m)，5.25(1H，d，J＝3)，5.58(1H，dd，J＝12,4)，7.16-7.26(5H，m)，7.33(1H，dd，J＝7,7)，7.61(1H，dd，J＝7,7)，7.93(1H，d，J＝7)

制备实施例4

DOXE的合成

将20.0g制备实施例3获得的7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羟基-3，5-二氧庚酸乙酯溶解于120mL甲苯中。此外加入10g硅胶和8g无水硫酸镁在95℃反应16小时。从反应体系除去硅胶和无机盐后，将溶剂蒸除，得到的残渣通过柱层析(展开剂：2∶1己烷∶乙酸乙酯)得到8.4g(收率44％)(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。

该化合物的NMR如下：

¹H-NMR(CDCl₃)：1.09(2H，m)，1.28(3H，t，J＝7)，1.40(2H，m)，2.38(1H，m)，3.40(2H，s)，4.20(2H，q，J＝7)，5.51(1H，s)，6.02(1H，d，J＝16)，7.16-7.26(4H，m)，7.30-7.40(2H，m)，7.70(1H，d，J＝16)，7.63(1H，m)，7.97(1H，m)

制备实施例5

DOXE的合成

将5.0g制备实施例3获得的7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羟基-3，5-二氧庚酸乙酯、10mL甲苯和0.37g对甲苯磺酸酐的混合溶液在110℃反应3小时。用碳酸氢钠水溶液洗涤反应体系，接着将得到的有机层浓缩。然后，将得到的残渣通过柱层析(展开剂：己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化而得到3.0g(收率63％)(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。

制备实施例6

DOXE的合成

将0.50g制备实施例3获得的7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羟基-3，5-二氧庚酸乙酯、20mL甲苯和0.037g对甲苯磺酸酐的混合溶液在105℃的内部温度下减压反应1小时，同时通过与甲苯共沸移除反应产生的水。恢复到常压后，将0.097g水加入到反应体系中，让反应在90℃进行10分钟，接着让反应在减压、105℃的内部温度下进行1小时并同时蒸除水。使用高效液相色谱分析反应体系。证实产生了0.37g(收率78％)的(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。

制备实施例7

DOXE的合成

将0.01g硫酸加入到0.2g制备实施例3获得的7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉3-基]-7-羟基-3，5-二氧庚酸乙酯和2mL乙酸乙烯酯的混合溶液中，让反应在加热回流下进行5小时。用乙酸乙酯稀释反应体系，然后用碳酸氢钠水溶液洗涤。将得到的有机层浓缩，残渣通过柱层析(展开剂：己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化而得到0.14g(收率73％)(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。

制备实施例8

DOXE的合成

让2.0g制备实施例3获得的7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羟基-3，5-二氧庚酸乙酯、10mL乙酸、0.66g乙酸酐和0.01g N，N-二甲基-4-氨基吡啶的混合溶液在90℃反应4小时。用乙酸乙酯稀释该反应体系，然后依次用水和碳酸氢钠水溶液洗涤。然后，浓缩得到的有机层，残渣用己烷结晶而获得1.55g(收率80％)(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。

制备实施例9

DOXE的合成

将0.250g制备实施例3获得的7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-7-羟基-3，5-二氧庚酸乙酯溶解于5mL 4mol/L盐酸/乙酸乙酯溶液中，在20℃持续搅拌12小时。使用高效液相色谱分析反应体系。证实产生了0.198g(收率82％)(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)。

制备实施例10

DOXE盐酸盐的合成

在1.37g油状60％氢化钠和10mL四氢呋喃的混合溶液中，在保持20℃的内部温度下用5分钟滴加2.36g 3，5-二氧己酸乙酯和10mL四氢呋喃的混合溶液。在该温度搅拌混合物1小时后，用20分钟滴加2.01g 2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-醛和20mL四氢呋喃的混合物。搅拌混合物4小时后，向反应溶液加入3.09g乙酸和20mL水终止反应。有机相用40mL乙酸乙酯萃取，然后用20mL饱和盐水溶液洗涤，接着用2g无水硫酸钠干燥。有机相分析结果表明获得了2.52g目标产物(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯(DOXE)(收率82％)。

蒸馏掉溶剂后，在室温下将1.7mL 4mol/L盐酸/乙酸乙酯溶液加入到残渣中。形成结晶后，将温度降低到5℃。然后通过过滤和干燥获得结晶，得到2.49g(E)-7-[2-环丙基4-(4-氟苯基)喹啉-3-基]-3，5-二氧庚-6-烯酸乙酯盐酸盐(收率75％)。

实施例1

由DOXE制备DOLE

将表1所列的各种菌株在液体培养基(2.5mL)中接种，所述液体培养基包含5g/L的酵母提取物(由Difco Co.，Ltd.生产)、5g/L聚胨(由Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)、3g/L麦芽汁(由Difco Co.，Ltd.生产)和20g/L葡萄糖(由Nihon Shokuhinkako Co.，Ltd.生产)，然后在需氧条件下在30℃培养21小时。将得到的培养基以一次1 mL的量离心而收集微生物细胞。然后将0.25mL含化合物(I)(其中R为乙基的式I化合物：DOXE)的反应溶液加入到该微生物细胞中，在30℃和需氧条件下反应20小时。

上述反应溶液的组成包括0.3g/L DOXE、20g/L葡萄糖(由NihonShokuhinkako Co.，Ltd.生产)、20mL/L二甲基亚砜(DMSO)(由KishidaChemical Co.，Ltd.生产)和100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)。

终止反应后，将0.5mL乙酸乙酯加入到反应溶液中并与其剧烈混合，接着通过离心分离成有机层和水层。将有机层转移到另一容器中。用浓缩离心机蒸除溶剂。然后将干燥的固体产物溶解于0.01mL乙酸乙酯中，然后进行薄层层析(TLC)。所述TLC使用硅胶板(由Merck&Co.生产的硅胶60 F₂₅₄)，所用的展开剂为1/1的己烷/乙酸乙酯。

展开停止后，用紫外灯验证产物。对于化合物(I)来说，Rf＝0.76到0.86。对于化合物(II)和(III)来说，Rf＝0.54到0.61。对于化合物(IV)(其中R为乙基的式IV化合物：DOLE)来说，Rf＝0.33。刮下TLC上DOLE斑点并用0.25mL异丙醇洗脱。离心后，取上清液进行高效液相色谱(HPLC)分析其光学纯度和TLC-刮除样品的浓度。

下面是HPCL的条件。

柱：CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生产)

洗脱液：9/1己烷/乙醇

流速：0.5mL/min

检测：UV 254nm

温度：室温

其结果列于表1。

表1

所用微生物TLC刮取样品的浓度(非对映体过剩率，对映体过剩率)法氏假丝酵母法氏变种RIFY74557.1mg/L(97.1％d.e.，100.0％e.e.)罗伦隐球菌IFO06090.4mg/L(100.0％d.e.，100.0％e.e.)Filobasidium capsuligenumIFO11852.7mg/L(100.0％d.e.，100.0％e.e.)Ogataea minuta varnonfermentans IFO14737.4mg/L(92.0％d.e.，100.0％e.e.)

实施例2

用DOXE制备DOLE

将Ogataea minuta var nonfermentans IFO 1473在2.5mL与实施例1培养基组成相同的液体培养基中接种，然后在需氧条件下、27℃分别培养24小时和48小时。以一次1mL的量将获得的培养溶液离心来收集微生物细胞。然后将0.2mL 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)加入到微生物细胞中将其完全悬浮，接着向悬浮液加入20μl 50％(w/v)葡萄糖溶液和50μl 5g/L DOXE(DMSO溶液)，然后充分搅拌混合物，在27℃反应20小时。

停止反应后，如实施例1那样用乙酸乙酯萃取和进行TLC，刮下TLC上的DOLE斑点并用200μl异丙醇洗脱。离心后，将上清液进行高效液相色谱(HPLC)分析其光学纯度和产生的DOLE的量。

下面是HPCL的条件。

柱：CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生产)

洗脱液：95/5己烷/乙醇

流速：1mL/min

检测：UV 254nm

温度：室温

其结果列于表2。

表2

培养时间TLC刮取样品的浓度(非对映体过剩率，对映体过剩率)24小时113.3mg/L(97.4％d.e.，100.0％e.e.)48小时72.8mg/L(100.0％d.e.，100.0％e.e.)

此外，在进行上述的TLC时，具有相应于5-MOLE或3-MOLE的Rf斑点。这里，只刮除了24小时培养的斑点并使用高效液相色谱(HPLC)分析了其产生量。

下面是其HPLC条件。

柱：MCIGEL CHP2MGM(4.6×150mm)(由Mitsubishi ChemicalCorporation生产)

洗脱液：甲醇/乙腈/水/磷酸＝800/100/100/0.5

流速：0.6mL/min

检测：UV 254nm

温度：60℃。

在上述HPLC条件下，当5-MOLE具有4.73的保留时间，3-MOLE具有5.47的保留时间时，5-MOLE的TLC刮取样品浓度为25.2mg/L，3-MOLE浓度为2.2mg/L。

顺便提及，在上述分析条件下DOLE具有4.02的保留时间，DOXE具有8.02的保留时间。

实施例3

用DOXE制备MOLE

将橙黄红酵母IFO0754和红酵母dairenensis变种IFO0415分别在2.5mL组成与实施例1培养基相同的液体培养基中接种。在27℃需氧条件下，分别将橙黄红酵母培养24小时，将红酵母dairenensis变种培养48小时。以一次1mL的量将获得的培养溶液离心来收集微生物细胞。然后，将0.2mL 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)加入到微生物细胞中将其完全悬浮，接着向悬浮液加入20μl 50％(w/v)葡萄糖溶液、20μl 2g/L NADP和NAD的混合溶液和30μl 10g/L DOXE(DMSO溶液)，然后充分搅拌混合物，使反应在需氧条件下、27℃进行12小时。

停止反应后，与实施例1中一样用乙酸乙酯萃取和进行TLC。分别刮除相应于5-MOLE或3-MOLE的Rf斑点部分和相应于DOLE的Rf斑点部分。

然后，在下面条件下使用高效液相色谱(HPLC)分析DOLE和MOLE。

下面是分析DOLE的条件：

柱：CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生产)

洗脱液：95/5己烷/乙醇

流速：1mL/min

检测：UV 254nm

温度：室温；

另外，下面是分析MOLE的条件：

柱：MCIGEL CHP2MGM(4.6×150mm)(由Mitsubishi ChemicalCorporation生产)

洗脱溶液：甲醇/乙腈/水/磷酸＝800/100/100/0.5

流速：0.6mL/min

检测：UV 254nm

温度：60℃

其结果列于表3。

表3

所用微生物     TLC刮取样品的浓度(各为mg/L)       

                5-MOLE      3-MOLE        DOLE

红酵母          44.9        2.2           2.9

dairenensis变                             (100％de，100％ee)

种IFO0415

橙黄红酵母      118.9       N.D.          15.3

IFO0754                                   (98.7％de，100％ee)

实施例4

用DOXE制备3-MOLE

将间型假丝酵母IFO0761在2.5mL组成与实施例1培养基相同的液体培养基中接种。在27℃培养24小时后，通过与实施例2相同的操作让其与DOXE反应。同样，反应后，用乙酸乙酯萃取和进行TLC。斑点样品的HPLC分析揭示3-MOLE的TLC刮取样品浓度为156.9mg/L。

实施例5

用DOXE制备3-MOLE

将Filobasidium capsuligenum IFO1185菌株在2L组成与实施例1培养基相同的液体培养基中接种，在30℃、需氧条件下培养21小时。离心获得培养溶液并收集微生物细胞。使用10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)制备10％(w/v)微生物细胞悬浮液。采集各12mL等份的悬浮液分别到六个具有30φ的试管中。然后向各个试管加入0.1mL10％(w/v)DOXE(DMSO溶液)和0.15mL 50％(w/v)葡萄糖溶液，在30℃需氧条件下进行反应20小时。

停止反应后，使用乙酸乙酯萃取反应混合物。在与实施例1相同的条件下将萃取物进行TLC。刮取含化合物(III)的部分。用乙酸乙酯提萃刮取的硅胶部分，样品用¹H-NMR分析。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃，δppm)：1.02(dt，J＝6.4，3.2Hz，2H)，1.21(t，J＝7.2Hz，3H)，1.33(dt，J＝6.4，3.2Hz，2H)，2.26(m，1H)，2.43(d，J＝6.4Hz，2H)，2.60-2.66(dd，J＝6.4，6.4Hz，2H)，3.37(m，1H)，4.11(q，J＝6.8Hz，2H)，4.34-4.41(m，1H)，6.27(d，J＝16.8Hz，1H)，7.06-7.36(m，6H)，7.52-7.62(m，1H)，7.60(d，J＝16.8Hz，1H)，7.90(d，J＝8.4Hz，1H)

上述结果证实了3-MOLE的产生。

还有，在下面条件下使用高效液相色谱(HPLC)分析光学纯度。结果，发现化合物(III′)的光学纯度为87.3％ee。

下面是本实施例中所用的HPLC条件。

柱：CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生产)

洗脱液：己烷/乙醇/三氟乙酸＝900/100/1

流速：1mL/min

检测：UV 254nm

温度：室温

实施例6

用DOXE制备DOLE和3R-MOLE

分别将各个装有50mL与实施例1培养基组成相同的培养基的500mL烧瓶在120℃灭菌20分钟。取8个烧瓶接种Ogataea minuta varnonfermentans IFO1473，在需氧条件下在28℃培养24小时。将8个烧瓶所得培养液在两个装有20L液体培养基的30L小型发酵罐中接种，每个发酵罐4个烧瓶，罐中所装液体培养基包含10g/L酵母提取物(由Difco Co.，Ltd.生产)、10g/L聚胨(由Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)、6g/L麦芽汁(由Difco Co.，Ltd.生产)和20g/L葡萄糖(由Nihon shokuhinkako Co.，Ltd.生产)，接着在28℃培养24小时。培养后，离心培养溶液收集微生物细胞。

将该微生物细胞加入9L 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中完全悬浮并分成三等份。然后，将各等份分别装入5L小型发酵罐中。在每个发酵罐中，加入53g葡萄糖(由Nihon Shokuninkako Co.，Ltd.生产)、2g NADPH(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)和1.66g DOXE溶解于130mL DMSO而形成的溶液并在需氧条件下在40℃反应6小时。然后在反应1小时后分别再加入2g NADPH。反应后，取一部分各发酵罐的反应液，用高效液相色谱(HPLC)分析产生量。结果，总共产生3.43g DOLE(收率71％)。

离心各反应溶液并收集沉淀物。在各沉淀物中加入600mL乙腈。充分搅拌混合物后，进行离心将混合物分离成上清液和沉淀物。向沉淀物中加入200mL乙腈再悬浮和离心。合并所有的上清液并用蒸发器浓缩。浓缩后，加入600mL乙酸乙酯，溶解后接着用50mL水洗涤两次。

将乙酸乙酯层浓缩并用硅胶柱层析纯化。将400mL硅胶置于柱中并预先用2∶1己烷∶乙酸乙酯溶液平衡。然后，加入浓缩样品和2L 2∶1己烷∶乙酸乙酯展开剂。随后，再变换成3∶2己烷∶乙酸乙酯展开剂，加入2L进行洗脱。

将洗脱溶液分成每份200mL的部分(总共20部分)。每个部分用TLC验证。收集检测到存在DOLE的部分并浓缩，得到3.4g油性DOLE。纯度换算其相当于2.5g DOLE。

在上面实施例2中所述的条件下进行HPLC分析来探查化合物的光学纯度。就峰面积比来说，3S，5R异构体∶3R，5R异构体∶3R，5S异构体∶3S，5S异构体＝0.3∶0.2∶98.9∶0.6(98.4％de，99.4％ee)。

另一方面，收集检测到作为主成分的3-MOLE部分的柱纯化部分，获得1.5g油性产物，将其再进行硅胶柱层析和纯化获得0.7g3R-MOLE。

进行与实施例2相同的分析，证实其光学纯度为98％ee。

实施例7

用5-MOLE制备DOLE

除了使用表4所示的各种菌株和含1∶1 R-5MOLE和S-5MOLE的5-MOLE替代DOXE作为反应底物外，使用与实施例1相同的操作进行反应。

在产物DOLE中，从5R-MOLE产生了3S，5R异构体和3R，5R异构体，从5S-MOLE产生了3R，5S异构体和3S，5S异构体。

停止反应后，如实施例1那样用乙酸乙酯萃取和进行TLC。随后，使用高效液相色谱(HPLC)分析产物光学纯度和产生量。

结果列于表4中。

表4

所用微生物TLC刮取样品的浓度(各mg/L)3s，5r 3r，5r 3r，5s 3s，5s来自5S-MOLE的3-位不对称还原选择率对映体过剩率(ee％)Saccharomycopsisfibuligera IFO01050.1，8.0，25.8，1.787.6％99.6％拟威克酵母IFO18570.2，16.7，16.0，1.483.9％97.3％罗伦隐球菌罗伦变种CBS55390.1，3.1，6.8，0.683.0％97.5％美极梅奇酵母IFO107960.7，6.6，15.3，1.978.3％91.3％美极梅奇酵母IFO14070.2，5.6，12.1，1.676.7％97.5％Ogataea minuta varnonfermentansIFO14730.2，10.1，15.9，2.176.4％98.1％皮炎外瓶霉IFO81931.5，8.0，16.4，3.068.9％83.4％FilobasidiumN.D.，12.2，15.3，3.562.6％100.0％capsuligenumIFO1185红酵母glutinis变种IFO0395 N.D.，7.0，7.9，1.9 61.2％100.0％法氏假丝酵母法氏变种IFO0856 N.D.，8.1，11.0，2.8 60.0％100.0％Pichia petersoniiIFO1372 0.1，1.0，3.3，0.8 59.2％92.3％酿酒酵母IFO0565 N.D.，1.0，2.0，0.6 55.5％100.0％

实施例8

用5-MOLE制备DOLE

将表5所列的各种菌株在2.5mL液体培养基中接种，所述液体培养基包含10g/L酵母提取物(由Difco Co.，Ltd.生产)、8g/L聚胨(由Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)、7g/L大豆提取物HINUTE SMS(由Fuji Oil Co.，Ltd.生产)、5g/L葡萄糖(由Nihon Shokuninkako Co.，Ltd.生产)、10g/L甘油(由Kishida Chemical Co.，Ltd.生产)、1g/L磷酸钾(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)、3g/L磷酸氢二钾(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产)、0.5g/L硫酸镁(由KishidaChemical Co.，Ltd.生产)和10mg/L氯化锰(由Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.生产)，然后在需氧条件下于30℃培养24小时。得到的培养溶液以一次1mL的量离心并收集微生物细胞。然后，加入0.2mL 100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)完全悬浮微生物细胞，接着与10μl50％(w/v)葡萄糖溶液、10μl 2g/L-NADP(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)和NAD(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)的混合物以及10μl 5-MOLE的5g/L-DMSO溶液(所含的R-5MOLE和S-5MOLE的比率为1∶1)混合。充分搅拌后，在需氧条件下于30℃反应20小时。

停止反应后，如实施例1那样用乙酸乙酯萃取和进行TLC，刮除TLC上的DOLE斑点并用200μl异丙醇洗脱。离心后，将上清液进行高效液相色谱(HPLC)分析DOLE的光学纯度和产生量。

下面是HPLC的条件。

柱：CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生产)

洗脱液：己烷/乙醇＝95/5

流速：1mL/min

检测：UV 254nm

温度：室温

结果列于表5。

表5

所用微生物TLC刮取样品的浓度(各mg/L)3s，5r 3r，5r 3r，5s 3s，5s来自5S-MOLE的3-位不对称还原选择率对映体过剩率(ee％)谷氨酸棒杆菌ATCC14067N.D.，95.7，54.1，N.D.100.0％100.0％谷氨酸棒杆菌ATCC13826N.D.，112.1，22.1，N.D.100.0％100.0％产氨棒杆菌JCM1305N.D.，119.9，72.8，N.D.100.0％100.0％谷氨酸棒杆菌JCM1307N.D.107.7，71.7，N.D.100.0％100.0％解糖短杆菌N.D.105.2，78.5，N.D.100.0％100.0％ATCC14066嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870  0.5，73.8，42.8，N.D.100.0％97.7％谷氨酸棒杆菌ATCC13032  N.D.，75.9，56.3，N.D.100.0％100.0％CorynebacteriumvitaeruminisJCM1323  0.4，140.4，132.0，N.D.100.0％99.4％

实施例9

用5-MOLE制备DOLE

将表6所列的各种菌株在2.5mL组成与实施例1所用的液体培养基相同的液体培养基中接种并在需氧条件下于27℃培养48小时。得到的培养溶液以每次1mL的量离心并收集微生物细胞。然后，加入0.2mL 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)将微生物细胞完全悬浮。随后，加入20μl 50％(w/v)葡萄糖溶液和50μl 5-MOLE的5g/L DMSO溶液(包含1∶1的R-5MOLE和S-5MOLE)并充分搅拌，接着在27℃反应20小时。

停止反应后，如实施例8那样用乙酸乙酯萃取并进行TLC。然后，使用高效液相色谱(HPLC)分析光学纯度和产生量。

结果列于表6。

表6

所用微生物TLC刮取样品的浓度(各mg/L)3s，5r 3r，5r 3r，5s 3s，5s来自5S-MOLE的3-位不对称还原选择率对映体过剩率(ee％)间型假丝酵母IFO0761N.D.，137.8，50.4，N.D.100.0％100.0％固囊酵母IFO0954N.D.，4.7，9.9，N.D.100.0％100.0％橙黄红酵母IFO0754N.D.，137.8，50.4，N.D.100.0％100.0％SaitoellacomplicataIAM129630.1，3.7，23.2，N.D.100.0％99.1％美极梅奇酵母IFO08631.4，47.9，100.6，N.D.100.0％97.3％美极梅奇酵母IFO107962.2，61.7，92.3，N.D.100.0％95.3％拟威克酵母IFO18571.2，83.7，47.6，N.D.100.0％95.1％鲁考弗梅奇酵母IFO10798N.D.，43.9，79.1，0.299.5％100.0％Saccharomycopsisfibuligera IFO01052.0，86.9，89.1，0.399.3％95.6％Ogataea glucozymaIFO14720.5，169.6，221.1，1.498.7％99.5％美极梅奇酵母IFO1407N.D.，37.4，75.3，0.598.7％100.0％Ogataea minuta varnonfermentansIFO1473N.D.，80.1，80.9，0.798.3％100.0％红酵母dairenensis变种IFO04150.3，157.3，50.7，2.0 92.4％98.8％Pichia petersoniiIFO1372N.D.，8.9，16.4，4.8 54.7％100.0％

实施例10

用5-MOLE制备DOLE

将表7中所列的菌株在2mL液体培养基中接种，所述液体培养基包含10g/L酵母提取物(由Difco Co.，Ltd.生产)、5g/L营养肉汤(由Difco Co.，Ltd.生产)、3g/L大豆提取物HINUTE SMS(由Fuji Oil Co.，Ltd.生产)和15g/L葡萄糖(由Nihon Shokuhinkako Co.，Ltd.生产)，然后在需氧条件下于30℃培养24小时。将得到的培养液以一次1mL的量离心并收集微生物细胞。除了使用含1∶1R-5MOLE和S-5MOLE的5-MOLE替代DOXE作为微生物细胞的反应底物外，进行与实施例1相同的操作。

停止反应后，如实施例1那样，用乙酸乙酯萃取和进行TLC，接着进行高效液相气谱(HPLC)分析光学纯度和产生量。结果列于表7。

表7

所用微生物TLC刮取样品的浓度(各mg/L)3s，5r 3r，5r 3r，5s 3s，5s来自5S-MOLE的3-位不对称还原选择率对映体过剩率(ee％)乙酸钙不动杆菌IFO125523.0，6.6，63.8，26.641.2％91.0％萎蔫短小杆菌ATCC128130.3，30.3，60.5，8.874.6％99.0％产黄纤维单胞菌JCM14890.2，46.2，43.2，10.461.2％99.1％凝胶纤维单胞菌JCM14900.2，51.1，38.2，10.556.9％99.0％潮湿纤维单胞菌JCM14921.0，37.1，53.1，8.871.6％96.3％

实施例11

用5S-MOLE制备DOLE

将表8中所列的各种菌株用与实施例1中相同的方式培养。以一次1mL的量离心得到的培养溶液并收集微生物细胞。然后，加入0.25mL 100mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)，其含5g/L葡萄糖(NihonShokuhinkako Co.，Ltd.)、60μg/L NADP(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)和20μg/L葡萄糖脱氢酶(由Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.生产：73单位/mg)，将微生物细胞充分悬浮。

在该悬浮液中，加入10μL含10g/L光学纯度为73.0％ee的按照制备实施例2获得的5S-MOLE的DMSO，接着在需氧条件下于30℃反应20小时。

停止反应后，如实施例1那样用乙酸乙酯萃取并进行TLC。然后，使用高效液相色谱(HPLC)分析光学纯度和产生量。

结果列于表8。

表8

所用微生物TLC刮取样品的浓度(非对映体过剩率，对映体过剩率)来自5S-MOLE的3-位不对称还原选择率SaitoellacomplicateIAM1296313.28mg/L(96.1％de，96.6％ee)100.0％马铃薯假丝酵母IFO076218.00mg/L(94.7％de，93.3％ee)100.0％美极梅奇酵母IAM1219738.53mg/L(90.5％de，97.8％ee)100.0％Shizosacchar-omyces pombeIFO034426.93mg/L(88.3％de，93.3％ee)96.6％美极梅奇酵母IFO1079612.62mg/L(87.6％de，97.2％ee)100.0％OgataeaglucozymaIFO147287.69mg/L(84.7％de，98.4％ee)100.0％Ogataeaminuta varnonfermentansIFO147377.02mg/L(79.4％de，98.2％ee)100.0％酿酒酵母1.67mg/L(81.8％de，78.4％ee)100.0％IFO0565酿酒酵母JCM18181.87mg/L(77.0％de，70.4％ee)    100.0％二尖梅奇酵母IFO140811.76mg/L(74.5％de，94.3％ee)    100.0％Shizosacchar-omyces pombeIFO162812.32mg/L(74.1％de，96.4％ee)    96.4％CandidamolischianaIFO1029636.72mg/L(73.3％de，94.7％ee)    93.4％红冬孢酵母IFO055920.27mg/L(67.7％de，95.7％ee)    100.0％法氏假丝酵母法氏变种IFO0856114.54mg/L(64.0％de，98.2％ee)    93.0％FilobasidiumcapsuligenumIFO1185116.20mg/L(61.2％de，98.6％ee)    94.4％固囊酵母IFO09546.02mg/L(59.0％de，82.0％ee)    82.6％CryptococcushumicolusIFO102505.02mg/L(58.9％de，97.8％ee)    100.0％YarrowialipolyticaIFO12090.90mg/L(50.9％de，56.6％ee)   100.0％间型假丝酵母IFO076184.19mg/L(49.4％de，98.4％ee)    89.7％三角酵母7.89mg/L(23.9％de，91.9％ee)    84.6％CBS1040

实施例12

用3R-MOLE制备DOLE

将表9中所列的各种菌株在2.5mL组成与实施例1中所用液体培养基相同的液体培养基中接种并在需氧条件下于27℃下培养48小时。以一次1mL的量离心得到的培养液并收集微生物细胞。然后加入0.2mL 100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)完全悬浮微生物细胞。随后，加入10μL 2g/L NADP(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)和NAD(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)、10μL 25单位/mL葡萄糖脱氢酶(由Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)、10μL 50％(w/v)葡萄糖溶液和20μL实施例6制备的3R-MOLE的5g/L-DMSO溶液并充分搅拌，接着在27℃反应20小时。

停止反应后，如实施例8那样用乙酸乙酯萃取和进行TLC。然后，使用高效液相色谱(HPLC)分析光学纯度和产生量。

结果列于表9。

表9

所用微生物TLC刮取样品的浓度(mg/L)(非对映体过剩率，对映体过剩率)法氏假丝酵母法氏变种IFO085659.9，(100％de，100.0％ee)Filobasidium capsuligenumIFO118524.0，(100.0％de，100.0％ee)Pichia anomala IFO01181.0，(100.0％de，100.0％ee)Pichia petersonii IFO13722.8，(78.6％de，100.0％ee)罗伦隐球菌罗伦变种CBS217423.8，(75.6％de，100％ee)罗伦隐球菌罗伦变种CBS574640.4，(73.3％de，100％ee)罗伦隐球菌罗伦变种CBS714032.4，(75.3％de，100％ee)罗伦隐球菌罗伦变种CBS723518.9，(75.7％de，100％ee)黄隐球菌IFO040736.7，(81.5％de，100％ee)胶红酵母IFO000381.5，(100％de，100％ee)红酵母dairenensis变种IFO041553.3，(83.9％de，100％ee)橙黄红酵母IFO0754108.6，(100％de，100％ee)

实施例13

用3R-MOLE制备DOLE

将表10中所列的各种菌株在2.5mL组成与实施例1中所用的液体培养基相同的液体培养基中接种并在需氧条件下在27℃培养48小时。以每次1mL的量离心得到的培养液并收集微生物细胞。然后，加入0.2mL 100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)完全悬浮微生物细胞。随后，加入10μL 2g/L NADP(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)和NAD(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)的混合溶液、20μL异丙醇和20μL实施例6中所得3R-MOLE的5g/L-DMSO溶液，充分搅拌，接着在27℃反应20小时。

停止反应后，如实施例8那样用乙酸乙酯萃取和进行TLC。然后，使用高效液相色谱(HPLC)分析光学纯度和产生量。

结果列于表10。

表10

所用微生物TLC刮取样品的浓度(mg/L)(非对映体过剩率，对映体过剩率)罗伦隐球菌罗伦变种CBS217451.3，(75.8％de，100.0％ee)罗伦隐球菌罗伦变种CBS574629.3，(74.7％de，98.4％ee)罗伦隐球菌罗伦变种CBS714079.8，(74.4％de，100.0％ee)罗伦隐球菌罗伦变种CBS723588.4，(73.5％de，99.2％ee)胶红酵母IFO000397.3，(100％de，100％ee)红酵母dairenensis变种IFO0415101.6，(83.9％de，100％ee)橙黄红酵母IFO075491.6，(100％de，100％ee)

实施例14

用DOXE制备DOLE

在2.5Mlxeg成与实施例1所用的液体培养基相同的液体培养基中接种红酵母dairenensis变种IFO0415，在需氧条件下在27℃培养48小时。以1mL的量离心得到的培养液，收集微生物细胞。

此外，在2.5mL组成与实施例8所用的液体培养基相同的液体培养基中接种谷氨酸棒杆菌ATCC13826，在需氧条件下在30℃培养24小时。以1mL的量离心获得的培养液，收集细胞。

将两者合并，加入0.2mL 100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)将其完全悬浮，混合10μL 2g/L NADP(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)和NAD(由Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)的混合溶液、10μL 50％(w/v)葡萄糖溶液和30μL 20g/L DOXE(DMSO溶液)并充分搅拌，接着在27℃反应18小时。

停止反应后，如实施例1那样用乙酸乙酯萃取并进行TLC。然后，在与实施例8相同的条件下，使用高效液相色谱(HPLC)分析光学纯度和产生量。结果，在该反应中只获得3R，5S-DOLE。这里，TLC-刮取样品的浓度为9.5mg/L。

实施例15

用DOXE制备DCOOH

以与实施例1相同的方式培养表11中所列的各种菌株和进行反应。刮除TLC上相应于化合物(IV)(其为R为氢的化合物，下文简称为DCOOH)的斑点(展开剂：己烷∶乙酸乙酯＝1∶1，Rf＝0)，然后用0.25mL异丙醇洗脱。离心后，使用高效液相色谱(HPLC)分析上清液。

下面是HPLC的条件。

柱：CHIRALCEL AD(由Daicel Chemical Industries，Ltd.生产)

洗脱液：己烷/乙醇/三氟乙酸＝900/100/1

流速：1ml/min

检测：UV 254nm

温度：室温

结果列于表11。

表11

所用微生物TLC刮取样品的浓度(mg/L)(非对映体过剩率，对映体过剩率)法氏假丝酵母RIFY74551.3，(94.0％d.e.，100.0％e.e.)近平滑假丝酵母CBS6040.3，(100.0％d.e.，100.0％e.e.)白假丝酵母IFO15940.7，(81.8％d.e.，100.0％e.e.)热带假丝酵母IFO06181.1，(89.6％d.e.，100.0％e.e.)热带假丝酵母IFO14040.6，(100.0％d.e.，100.0％e.e.)Filobasidium capsuligenumIFO11853.8，(94.7％d.e.，100.0％e.e.)Yarrowia lipolytica IFO12090.7，(92.5％d.e.，100.0％e.e.)三角酵母CBS10400.9，(79.2％d.e.，100.0％e.e.)Cryptococcus curvatus IFO115914.5，(87.3％d.e.，100.0％e.e.)Cryptococcus humicolusIFO102502.1，(100.0％d.e.，100.0％e.e.)

实施例16

用5-MOLE制备DCOOH

除了使用5-MOLE替代DOXE外，以与实施例1相同的方式培养表12中所示的各种菌株。刮除TLC上相应于化合物(IV)(其为R为氢的化合物，下文简称为DCOOH)的斑点(展开剂：己烷∶乙酸乙酯＝1∶1，Rf＝0)，然后用0.25mL异丙醇洗脱。离心后，在与实施例15相同的条件下使用高效液相色谱(HPLC)分析上清液，分析光学纯度。

结果列于表12。

表12

所用微生物TLC刮取样品的浓度(mg/L)(非对映体过剩率，对映体过剩率)皱落假丝酵母IFO05910.5，(85.6％d.e.，100.0％e.e.)Candida molischiana IFO102961.8，(71.9％d.e.，100.0％e.e.)近平滑假丝酵母CBS6042.8，(71.8％d.e.，100.0％e.e.)罗伦隐球菌IFO06090.1，(100.0％d.e.，100.0％e.e.)皮炎外瓶霉IFO64219.9，(71.4％d.e.，100.0％e.e.)皮炎外瓶霉IFO81935.2，(73.1％d.e.，100.0％e.e.)三角酵母IFO06710.5，(89.9％d.e.，100.0％e.e.)

工业适用性

按照本发明，可以高光学纯度有效生产3R，5S-(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-3，5-二羟基庚-6-烯酸酯。