可用于生产人重组白细胞介素－15的原核表达工程菌及纯化方法

摘要

本发明涉及一种可用于大规模生产人重组白细胞介素－15(recombinant human interleukin－15，rhIL－15)的原核系统表达及纯化技术。更具体地，本发明的技术包含一种工程菌和一项全新的表达、纯化工艺。该工程菌中含有一种全新的重组表达载体，其中有一全新合成的DNA片断。

说明书

技术领域

本发明涉及两种用于人重组白细胞介素-15(recombinant humaninterleukin-15，rhIL-15)的原核表达工程菌及其重组蛋白纯化技术。更具体地，本发明的工程菌中含有一种全新的重组表达载体，其中有一全新合成的DNA片断。本发明还涉及所述重组蛋白质的诱导表达和纯化技术。

背景技术

白细胞介素(IL)-15是Grabstein等人于1994年发现的一种约为12-14kD的细胞因子，随着对其研究的不断深入，人们对IL-15的结构、功能等有了更新的认识。与大多数细胞因子相似，IL-15可在机体正常的免疫应答中发挥作用，如促进T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞的发育等。IL-15还可对免疫系统外的多种组织和细胞发挥广泛而多效的作用。由于IL-15作用的多样性，可在天然免疫和获得性免疫反应中产生交叉的调节作用，因而可将其看作天然免疫和获得性免疫系统间的桥梁。

在IL-15的功能研究中，其抗肿瘤效应受到重视。已有实验证实，低剂量的外源性IL-15能在不产生明显毒性作用的前提下，诱导NK细胞、NK-T细胞及CD8⁺记忆T细胞的发育、增殖及活化。比较IL-15与IL-2对肺腺癌转移模型的疗效时，发现虽然IL-15体内诱导的特异性杀伤效应只有IL-2的1/3，但是它诱导的NK杀伤活性比IL-2诱导的高3-4倍。此外，6倍剂量的IL-15才能引起肺血管渗漏等毒副作用的出现。在大鼠的结肠癌模型中也发现，IL-15能显著降低化疗引起的胃肠道毒性，增强药物的最大耐受剂量，因而推测IL-15可能是治疗实体瘤，尤其是抑制对IL-2有抗性的广谱实体瘤生长的有效候选因子。

发明内容

为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供经本发明得到的新的工程菌。具体而言，本发明所述的工程菌为两株大肠杆菌。所述的大肠杆菌已于2003年11月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号(CGMCC)为：1049或者保藏号(CGMCC)为：1050。

本发明还提供纯化重组人白细胞介素-15的方法。

为了完成本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明涉及一种编码人白细胞介素-15的DNA序列，其序列号为2或者序列号为4。

本发明还涉及一种含有所述序列号为2或者序列号为4的DNA序列的重组载体，优选的是，该载体为质粒。

本发明还涉及含有序列号为2或者序列号为4的DNA序列载体的大肠杆菌。

另外，本发明涉及一种反相层析分离纯化重组人白细胞介素-15的方法，包括如下步骤：

(A)在反相柱中，使用缓冲液A平衡层析柱至少2个柱体积，其中所述的缓冲液A是含有0.005％～0.01％三氟乙酸∶0.5～2％乙腈的水溶液；

(B)重组人白细胞介素-15粗品进样；

(C)用缓冲液A和缓冲液B以线性流速2.5cm/min梯度洗脱，按目的蛋白吸收峰收集得一目的蛋白收集物，其中缓冲液B是含有三氟乙酸0.005％～0.01％∶乙腈85～95％的水溶液；

(D)将目的蛋白收集物冻干得一冻干物；

(E)冻干物于4-10℃溶于生理盐水，离心分离，得纯化重组人白细胞介素-15溶液。

本发明还涉及另一种层析分离、复性重组人白细胞介素-15的方法，包括如下步骤：

(I)用缓冲液A平衡凝胶过滤层析柱至少2个柱体积；其中所述的缓冲液A含有20～100mM Tris，1～5mM EDTA，50～100mMβ-巯基乙醇，30～80mM Glycine，GSSG-GSH 0.4～0.6：4～6mM，0～1M尿素，pH8.0；

(J)用缓冲液B逐渐增加尿素浓度，在层析柱上端0.6个柱体内形成8M至0～1M尿素的向下递减梯度，线性流速为0.5-1cm/min，此时，层析柱下端0.4倍柱床为0～1M的尿素缓冲液，上端0.6倍柱床为8M-0～1M的尿素缓冲液，其中所述的缓冲液B含有20～100mM Tris，1～5mM EDTA，30～80mMβ-巯基乙醇，30～80mM Glycine，GSSG-GSH 0.4～0.6：4～6mM，8M尿素，pH8.0；

(K)重组人白细胞介素-15粗品上样，体积不超过柱床的5％，浓度不超过10mg/ml；

(L)缓冲液B液洗脱0.5个柱体积，然后换成缓冲液A液洗脱，线性流速均为0.05～0.1cm/min，收集目的蛋白；

(M)在DEAE阴离子交换柱中，用缓冲液C平衡层析柱至少2个柱体积；其中所述的缓冲液C含有20～100mM Tris，1～5mMEDTA，20～80mMβ-巯基乙醇，pH6～8.0；

(N)上样步骤D得到的目的蛋白后，用缓冲液C洗涤层析柱至少2个柱体积；

(O)缓冲液D梯度洗脱，按吸收峰收集得重组人白细胞介素-15收集物，其中所述的缓冲液D含有20～100mM Tris，1～5mMEDTA，20～80mMβ-巯基乙醇，1～2M NaCl，pH6.0～8.0，；

(P)将步骤G的收集物经脱盐柱脱盐，得纯化的重组人白细胞介素-15。

由此可见，根据本发明的一个方面，本发明提供了两种新的工程菌，该工程菌含有编码人白细胞介素-15的DNA序列(序列15)或其衍生物(序列28)，也含有与该重组DNA分子有效连接的并能够在大肠杆菌中稳定高效表达的重组载体。

本发明的另一个方面也提供了两种诱导该工程菌表达人白细胞介素-15的工艺方法，以及两种纯化人白细胞介素-15的工艺方法。

附序列说明

序列1-14表示PCR法拼接全长人白细胞介素-15成熟基因DNA序列I时用到的4对引物，同时还列出了3对在拼接中可能用到的短小引物。引物L1s、L2s、L3s、L4s的3’端分别与引物L1a、L2a、L3a、L4a的3’端互补配对，引物L2s、L3s、L4s的5’端分别与引物L1a、L2a、L3a的5’端互补配对。小引物用于第二轮和第三轮PCR扩增，起辅助引物作用。在第一轮PCR反应中，L1s与L1a配对、L2s与L2a配对、L3s与L3a配对、L4s与L4a配对。第二轮PCR反应中，第一轮的PCR产物L1与L2配对、L3与L4配对。第三轮PCR反应中，第二轮的PCR产物L1-2与L3-4配对，即合成全长的人白细胞介素-15的成熟基因序列。

序列15表示序列1-14的引物通过PCR法拼接得到的全合成的人白细胞介素-15DNA序列I。

序列16-27表示序列1-14的引物的衍生物(部分碱基不同于图2)，此引物通过搭桥PCR可以得到序列28所示的人白细胞介素-15成熟基因DNA序列II。

序列28表示序列16-27的引物通过PCR法拼接得到的全合成的人白细胞介素-15DNA序列II。

序列29表示由全合成的人白细胞介素-15DNA序列I或DNA序列II得到的人白细胞介素-15的氨基酸顺序。

序列30表示重组表达载体pBV₂₂₀-hIL-15插入目的基因部分的DNA序列测定结果，表明全合成人白细胞介素-15成熟基因序列正确、插入载体位置正确。方框内即为全合成的人白细胞介素-15DNA序列I，其两端为酶切位点和载体pBV₂₂₀序列。

附图说明

图1表示PCR法全合成人白细胞介素-15成熟基因的原理。这4对引物可两两部分互补配对，彼此以对方为模板，在Taq酶作用下合成DNA片断。同样，合成的DNA片断间也可以彼此部分互补配对合成更长一点的DNA片断。因此，通过逐步搭桥拼接可以合成出短片断、次全长和全长人白细胞介素-15成熟基因DNA。根据hIL-15氨基酸序列和大肠杆菌对密码子的偏好，设计合成4对寡核苷酸片断，相邻两个片断之间重叠约18bp。

图2表示原核表达人白细胞介素-15的表达载体pBV₂₂₀-hIL-15的构建过程。

图3表示原核表达人白细胞介素-15的表达载体pET₄₂-hIL-15的构建过程。

图4表示PCR法拼接全长人白细胞介素-15成熟基因的新DNA序列1-14或新DNA序列15的不同阶段得到的DNA片断2％琼脂糖电泳结果，1和2是第一轮PCR拼接结果，3和4是第二轮PCR拼接结果，5和6是第三轮PCR拼接结果，M为大连宝生物公司的DNA分子量标准(DL2000)。

图5表示构建好的重组表达载体pBV₂₂₀-hIL-15双酶切鉴定阳性，表示人白细胞介素-15成熟基因插入正确。1为pBV₂₂₀-hIL-15载体，3和4是没有插入目的基因的pBV₂₂₀空载体，M为大连宝生物公司的DNA分子量标准(DL2000)。

图6表示重组表达载体pBV₂₂₀-hIL-15插入目的基因部分的测序图谱。

图7表示工程菌BL₂₁ Star^TM(DE3)PlysS/pBV₂₂₀-hIL-15诱导表达前后菌体蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳结果。M为低分子量蛋白质标准，1和3为工程菌诱导后的菌体总蛋白，2为工程菌诱导前的菌体总蛋白。箭头所指为表达的目的蛋白。

图8表示目的蛋白占菌体总蛋白的百分含量。16为目的蛋白吸收峰，箭头所指数值为目的蛋白表达量，即15.2％。

图9表示用人白细胞介素-15单克隆抗体的Western Blot法检测目的蛋白质在菌体中的存在形式。1和3为包涵体沉淀，2为上清。箭头所指为表达的目的蛋白。

图10表示初步纯化的重组蛋白质的氨基酸序列测定，初步纯化的蛋白质N末端6个氨基酸依次为M-N-W-V-N-V，结果表明为人白细胞介素-15。

图11表示包涵体经不同洗涤过程后杂质去除情况，1，2为包涵体经洗涤液A洗涤后上清；3为2％ TritonX-100洗涤后上清；4，5为2M尿素洗涤后上清；6，7为洗涤后包涵体沉淀；M为低分子量蛋白质标准；8为诱导后的菌体蛋白；9为诱导前的菌体蛋白。

图12表示重组人白细胞介素-15粗品反相层析分离的洗脱梯度和吸收曲线，箭头所指的吸收峰即是重组人白细胞介素-15的吸收峰。

图13表示重组人白细胞介素-15粗品反相层析分离各收集峰的SDS-PAGE凝胶电泳结果，5、6、7分别是目的蛋白质吸收峰的前、中、后部分，1、2、3和4是目的蛋白质吸收峰以外的其他吸收峰，M是低分子量蛋白质标准，8和9为重组人白细胞介素-15粗品。箭头所指即为重组人白细胞介素-15。

图14表示重组人白细胞介素-15粗品反相层析分离后收集的目的蛋白质冻干后溶解得到的纯化蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳结果。1为冻干物溶于水后上清，2为冻干物溶于生理盐水后的上清，4为冻干物溶于水后沉淀，5为冻干物，9和11为重组人白细胞介素-15粗品，10为低分子量蛋白质标准。

图15表示用光密度法测定纯化的重组人白细胞介素-15的纯度，1为杂质吸收峰，2为重组人白细胞介素-15吸收峰，其他为噪音。其中：

吸收峰#        峰面积        峰高        百分数％

   1           36.38         4.82          7.9

   2           421.927       78.988        92.1

图16表示重组人白细胞介素-15粗品经Amersham Sephacryl S100凝胶过虑层析分离、复性后收集的各部分的SDS-PAGE结果。M为低分子量蛋白质标准，1至10分别是目的蛋白质吸收峰的前、中、后各部分。箭头所指位置是重组人白细胞介素-15。

图17表示经Amersham Sephacryl S100凝胶过虑层析分离、复性后收集的目的蛋白质用HiTrap DEAE FF阴离子交换层析纯化的人白细胞介素-15的SDS-PAGE凝胶电泳结果。1为粗品，3和5是HiTrapDEAE FF阴离子交换层析纯化蛋白，M为低分子量蛋白质标准。

具体实施方案

本发明的工程菌、诱导表达方法和纯化工艺可以用于生产重组人白细胞介素-15。

本发明中，所使用的术语定义如下：

术语“原核表达”是指转染了重组表达载体pBV₂₂₀-hIL-15质粒的大肠杆菌BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS在高温诱导下或者转染了重组表达载体pET₄₂-hIL-15质粒的大肠杆菌BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS在1.0mmol/l的IPTG诱导下，表达人白细胞介素-15的过程。

术语“工程菌”指转染了重组表达载体pBV₂₂₀-hIL-15质粒的大肠杆菌BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS和转染了重组表达载体pET₄₂-hIL-15质粒的大肠杆菌BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS。

术语“重组人白细胞介素-15(rhIL-15)”指通过基因工程，产自于大肠杆菌的人白细胞介素-15，它可能比人体中产生的白细胞介素-15多一个氨基酸(即N端第一个氨基酸——蛋氨酸)，除此之外，氨基酸顺序同人体内的白细胞介素-15。

术语“全长人白细胞介素-15成熟基因的新DNA序列I/II”和“全合成人白细胞介素-15DNA序列I/II”均指编码人白细胞介素-15成熟肽的全长DNA序列的衍生物，其表达的多肽，除N端第一个氨基酸为蛋氨酸外，氨基酸序列同人白细胞介素-15。

术语“表达和纯化工艺”指诱导工程菌表达并纯化重组人白细胞介素-15的方法、流程。

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明，并不意味着限定本发明的范围。

实施例1

全长人白细胞介素-15成熟基因的全合成

根据图1所示PCR法全合成人白细胞介素-15成熟基因的原理。4对引物两两部分互补配对，彼此以对方为模板，在Taq酶作用下合成DNA片断。同样，合成的DNA片断间也可以彼此部分互补配对合成更长一点的DNA片断。因此，通过逐步搭桥拼接可以合成出短片断、次全长和全长人白细胞介素-15成熟基因DNA序列。引物L1s、L2s、L3s、L4s的3’端分别与引物L1a、L2a、L3a、L4a的3’端互补配对，引物L2s、L3s、L4s的5’端分别与引物L1a、L2a、L3a的5’端互补配对。小引物用于第二轮和第三轮PCR扩增，起辅助引物作用。在第一轮PCR反应中，L1s与L1a配对、L2s与L2a配对、L3s与L3a配对、L4s与L4a配对。第二轮PCR反应中，第一轮的PCR产物L1与L2配对、L3与L4配对。第三轮PCR反应中，第二轮的PCR产物L1-2与L3-4配对，即合成全长的人白细胞介素-15的成熟基因序列。

实施例2

重组表达载体的构建

重组表达载体的构建技术路线如图7和图8所示。首先通过聚合酶链反应(PCR)搭桥拼接出全长的人白细胞介素-15成熟基因，并在其3’和5’端加上酶切位点，引物如图2和图4所示。使用pBV₂₂₀构建重组表达载体的，在rhIL-15的3’和5’端分别加上PstI和EcoRI的酶切位点，即CTGCAG和GAATTC。使用pET_42a构建重组表达载体的，在rhIL-15的3’和5’端分别加上XhoI和NdeI的酶切位点，即CTCGAG和CATATG。将此带有酶切位点的全长人白细胞介素-15成熟基因装入pGEM-T质粒后测序，将带有全长人白细胞介素-15成熟基因的pGEM-T质粒以PstI和EcoRI双酶切，或者以XhoI和NdeI双酶切。回收含全长人白细胞介素-15成熟基因的DNA片段，同时，将pBV₂₂₀质粒以PstI和EcoRI双酶切，或者pET_42a质粒以XhoI和NdeI双酶切，回收大片段。将酶切后的pBV₂₂₀载体片段或pET_42a载体片段与含全长人白细胞介素-15成熟基因的DNA片段连接成pBV₂₂₀-hIL-15质粒和pET₄₂-hIL-15质粒。然后，进行连接产物的转化、小量提取纯化质粒DNA。

实施例3

工程菌BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS/pBV₂₂₀-hIL-15和BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS/pET₄₂-hIL-15的获得、筛选及其鉴定

步骤1.筛选稳定高效表达的工程菌

(1)将上述实施例2获得的pBV₂₂₀-hIL-15质粒和pET₄₂-hIL-15质粒转化入宿主菌BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS，即本发明的工程菌；

(2)在固体LB琼脂培养基平板中挑取单克隆菌落BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS/pBV₂₂₀-hIL-15于4ml LB液体培养基中28℃，250转/分，摇菌过夜；

(3)以1∶100的比例接种于4mlLB培养基，28℃，250转/分，摇菌至OD₆₀₀值为0.4-0.6时，迅速升温至42℃诱导表达，继续摇菌4-5小时，回收菌体。

(4)至于工程菌BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS/pET₄₂-hIL-15也一样，只是培养条件换成常规的37℃，诱导条件改为OD₆₀₀值为0.4-0.6时往培养基中加入终浓度为1mmol/l的IPTG。

(5)离心收集菌体，用缓冲液A(Buffer A：50mM Tris，5Mm EDTA，150Mm NaCl，pH8.0)洗涤一次，然后重悬于1×上样缓冲液，95℃煮5分钟，即可上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯兰染色，对照诱导前、后菌体蛋白质的变化，筛选出目的蛋白表达量最高的菌株保存作种子菌。

步骤2.目的蛋白的Western-Blot鉴定

诱导前后的菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳，电转至硝酸纤维素膜，用抗人白细胞介素-15的单克隆抗体Western Blot法鉴定目的蛋白就是重组人白细胞介素-15。

实施例4

目的蛋白的大量制备和初步纯化

(1)保存的种子菌BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS/pBV₂₂₀-hIL-15按1∶1000的比例接种于100ml LB培养基，28℃，250转/分，摇菌8小时；

(2)菌液再按1∶100的比例接种于大瓶LB培养基，28℃，200转/分，摇菌至OD₆₀₀值为0.4-0.6(需2.5-3小时)，迅速升温至42℃诱导表达，继续摇菌4-5小时，回收菌体。

(3)工程菌BL₂₁ Star^TM(DE3)plysS/pET₄₂-hIL-15诱导方法一样，只是培养条件换成常规的37℃，诱导条件改为OD₆₀₀值为0.4-0.6时往培养基中加入终浓度为1mmol/l的IPTG。

(4)离心收集菌体；Buffer A(50mM Tris，5mM EDTA，150mM NaCl，pH8.0)洗涤2遍；冰浴下超声破碎菌体(360瓦，工作10秒，停30秒，80个循环)；离心分离沉淀；沉淀依次经含2％TritonX-100的Buffer B和含2M尿素的Buffer C洗涤。洗涤后，沉淀溶于6M盐酸胍，即得重组人白细胞介素-15粗品。

实施例5

反相层析分离纯化重组人白细胞介素-15

反相柱RPC Resource15纯化重组人白细胞介素-15。

(1)Buffer A(三氟乙酸∶乙腈∶水＝0.065％∶2％∶97.35％)平衡层析柱5个柱体积(column volume，CV)；

(2)重组人白细胞介素-15粗品进样；

(3)用Buffer A和Buffer B(三氟乙酸∶乙腈∶水＝0.1％∶90％∶9.9％)以线性流速2.5cm/min分段梯度洗脱，洗脱梯度为0％B 2CV40％ B 5CV 40-50％B 8CV 50-65％B 1CV 65％B5CV 100％B 5CV，按目的蛋白吸收峰收集。

(4)收集物冻干；

(5)冻干物于4-10℃溶于生理盐水，12000转/分离心10分钟即得纯化重组人白细胞介素-15溶液。

溶解的目的蛋白经细胞活性实验证明为具有生物活性的重组人白细胞介素-15。

实施例6

反相层析分离纯化重组人白细胞介素-15

反相柱RPC Resource15纯化重组人白细胞介素-15。

(A)用Buffer A(0.005％三氟乙酸∶0.5％乙腈)的水溶液平衡层析柱5个柱体积(column volume，CV)；

(B)重组人白细胞介素-15粗品进样；

(C)用Buffer A和Buffer B(0.005％三氟乙酸∶85％乙腈的水溶液)以线性流速2.5cm/min分段梯度洗脱，洗脱梯度为0％B 2CV40％ B 5CV 40-50％B 8CV 50-65％B 1CV 65％B5CV 100％B 5CV，按目的蛋白吸收峰收集；

(D)收集物冻干；

(E)冻干物于4-10℃溶于生理盐水，12000转/分离心10分钟即得纯化重组人白细胞介素-15溶液。

溶解的目的蛋白经细胞活性实验证明为具有生物活性的重组人白细胞介素-15。

实施例7

重复实施例6的方法步骤，不同的是缓冲液A为含有0.01％三氟乙酸∶2％乙腈的水溶液，而缓冲液B为是含有0.01％三氟乙酸∶95％乙腈的水溶液。

实施例8

用Amersham Sephacryl S100(16×100)分子筛凝胶过虑层析分离、复性重组人白细胞介素-15

(1)复性缓冲液A(Buffer A：50mM Tris，1 mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，50mM Glycine，GSSG-GSH 0.5：5mM，0.4M尿素，pH8.0)平衡凝胶过滤层析柱2个柱体积；

(2)用B液(50mM Tris，1mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，50mMGlycine，GSSG-GSH 0.5：5mM，8M尿素，pH8.0)逐渐增加尿素的浓度，在层析柱上端0.6个柱体内形成8M至0.4M尿素的向下递减梯度，线性流速为0.5-1cm/min，此时，层析柱下端0.4倍柱床为0.4M的尿素缓冲液，上端0.6倍柱床为8M-0.4M的尿素缓冲液；

(3)上样(体积不超过柱床的5％，浓度不超过10mg/ml)；

(4)B液洗脱0.5个柱体积，然后换成A液洗脱，得一目的蛋白收集物。

由于尿素梯度较重组蛋白向下移动的慢，所以随着洗脱进行，重组蛋白逐渐流经尿素梯度递减的洗脱液而逐渐复性，此过程中线性流速为0.05～0.1cm/min，不宜过快，否则蛋白易析出。按吸收峰收集重组人白细胞介素-15，进行离子交换层析分离。

实施例9

用DEAE阴离子交换柱层析分离分子筛分离得到的重组蛋白

(2)用缓冲液C液(Buffer A：50mM Tris，1mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，pH8.0)平衡层析柱2个柱体积；

(3)采用实施例8得到的目的蛋白收集物上样后用A液洗涤层析柱2个柱体积；

(4)缓冲液D液(50mM Tris，1mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，1MNaCl，pH8.0)梯度洗脱，按吸收峰收集重组人白细胞介素-15；

(5)收集物经脱盐柱脱盐即得纯化的重组人白细胞介素-15。

实施例10

重复实施例8的步骤，不同的是采用的缓冲液A为含有20mMTris，1mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，30mM Glycine，GSSG-GSH 0.4：4mM，pH8.0。而缓冲液B为其中所述的缓冲液B含有20mM Tris，1mM EDTA，30mMβ-巯基乙醇，30mM Glycine，GSSG-GSH 0.4：4mM，8M尿素，pH8.0。

实施例11

重复实施例8的步骤，不同的是采用的缓冲液A含有100mM Tris，5mM EDTA，100mMβ-巯基乙醇，80mM Glycine，GSSG-GSH 0.6：6mM，1M尿素，pH8.0；

而缓冲液B含有100mM Tris，5mM EDTA，80mMβ-巯基乙醇，80mM Glycine，GSSG-GSH 0.6：6mM，8M尿素，pH8.0。

实施例12

重复实施例9的步骤，不同的是采用的缓冲液C含有20mM Tris，1mM EDTA，20mMβ-巯基乙醇，pH6.0；而缓冲液D含有20mM Tris，1mM EDTA，20mMβ-巯基乙醇，1M NaCl，pH6.0。

实施例13

重复实施例9的步骤，不同的是采用的缓冲液C含有100mM Tris，5mM EDTA，80mMβ-巯基乙醇，pH8.0；缓冲液D含有100mM Tris，5mM EDTA，80mMβ-巯基乙醇，2M NaCl，pH8.0。

                             序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>可用于生产人重组白细胞介素-15的原核表达工程菌及纯化方法

<130>

<160>30

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>66

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>1

gaattcatga actgggttaa cgtaatctct gacttgaaaa aaatcgaaga cctgatccag     60

tctatg                                                                66

<210>2

<211>59

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>2

cgggtgaacg tcgctttcgg tgtacagagt agcgtcgatg tgcatagact gatcaggtc      59

<210>3

<211>60

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>3

gaaagcgacg ttcacccgtc ttgcaaagta accgctatga agtgcttcct cctggagctc     60

<210>4

<211>59

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>4

gtcgtggata gaagcgtcac cggactcaag agagataacc tggagctcca gaggaagca      59

<210>5

<211>60

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>5

gacgcttcta tccacgacac cgtagaaaac ctgatcatcc tggctaacaa ctctttgtct     60

<210>6

<211>59

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>6

ctcgcattct ttgcaaccag attcggttac gttcccgtta gaagacaaag gttgttagc      59

<210>7

<211>60

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>7

ggttgcaaag aatgcgagga actggaggaa aaaaacatca aagagttctt gcagagcttc     60

<210>8

<211>63

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>8

ctgcagctat taagaagtgt tgatgaacat ctgaacgatg tgtacgaagc tctgcaagaa     60

ctc                                                                   63

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>9

gaattcatga actgggttaa cgta                                            24

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>10

gtcgtggata gaagcgtc                                                   18

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>11

gacgcttcta tccacgac                                                   18

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>PstI

<400>12

ctgcagctat taagaagtgt tgat                                            24

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>NdeI

<400>13

catatgaact gggttaacgt a                                               21

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>XhoI

<400>14

ctcgagctat taagaagtgt tgat                                            24

<210>15

<211>351

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>15

atgaactggg ttaacgtaat ctctgacttg aaaaaaatcg aagacctgat ccagtctatg     60

cacatcgacg ctactctgta caccgaaagc gacgttcacc cgtcttgcaa agtaaccgct    120

atgaagtgct tcctcctgga gctccaggtt atctctcttg agtccggtga cgcttctatc    180

cacgacaccg tagaaaacct gatcatcctg gctaacaact ctttgtcttc taacgggaac    240

gtaaccgaat ctggttgcaa agaatgcgag gaactggagg aaaaaaacat caaagagttc    300

ttgcagagct tcgtacacat cgttcagatg ttcatcaaca cttcttaata g             351

<210>16

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>16

atgaactggg ttaacgtaat ctctgacctg aaaaaaatcg aagacctgat ccagtctat      59

<210>17

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>17

tgaacgtcag attcggtgta cagagtagcg tcgatgtgca tagactggat caggtcttc      59

<210>18

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>18

caccgaatct gacgttcacc cgtcttgcaa agttactgct atgaaatgtt tcctgctgg      59

<210>19

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>19

ggatagaagc gtcacctgac tccagagaga taacctggag ttccagcagg aaacatttc      59

<210>20

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>20

tctatccacg acaccgttga aaacctgatc atcctggcta acaactctct gtcatctaa      59

<210>21

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>21

tcctcacatt ctttgcaacc tgattcagta acgttaccgt tagatgacag agagttgtt      59

<210>22

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>22

ggttgcaaag aatgtgagga actggaagaa aaaaacatca aagagttcct ccagtcttt      59

<210>23

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>23

ctattaagag gtgttgatga acatctgaac gatgtgaacg aaagactgga ggaactctt      59

<210>24

<211>24

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>24

gaattcatga actgggttaa cgta                                            24

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>25

tgtcgtggat agaagcgtca c                                               21

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>26

gacgcttcta tccacgacac c                                               21

<210>27

<211>26

<212>DNA

<213>PstI

<400>27

ctgcagctat taagaggtgt tgatga                                          26

<210>28

<211>351

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>28

atgaactggg ttaacgtaat ctctgacctg aaaaaaatcg aagacctgat ccagtctatg     60

cacatcgacg ctactctgta caccgaatct gacgttcacc cgtcttgcaa agttactgct    120

atgaaatgtt tcctgctgga actccaggtt atctctctgg agtcaggtga cgcttctatc    180

cacgacaccg ttgaaaacct gatcatcctg gctaacaact ctctgtcatc taacggtaac    240

gttactgaat caggttgcaa agaatgtgag gaactggaag aaaaaaacat caaagagttc    300

ctccagtctt tcgttcacat cgttcagatg ttcatcaaca cctcttaata g             351

<210>29

<211>115

<212>PRT

<213>EcoRI

<400>29

Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu

1               5                   10                  15

Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val

            20                  25                  30

His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu

        35                  40                  45

Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val

    50                  55                  60

Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn

65                  70                  75                  80

Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn

                85                  90                  95

Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile

            100                 105                 110

Asn Thr Ser

        115

<210>30

<211>580

<212>DNA

<213>EcoRI

<400>30

gtgtgtgatg atacgaaacg aagcattggt taaaaattaa ggaggaattc atgaactggg     60

ttaacgtaat ctctgacttg aaaaaaatcg aagacctgat ccagtctatg cacatcgacg    120

ctactctgta caccgaaagc gacgttcacc cgtcttgcaa agtaaccgct atgaagtgct    180

tcctcctgga gctccaggtt atctctcttg agtccggtga cgcttctatc cacgacaccg    240

tagaaaacct gatcatcctg gctaacaact ctttgtcttc taacgggaac gtaaccgaat    300

ctggttgcaa agaatgcgag gaactggagg aaaaaaacat caaagagttc ttgcagagct    360

tcgtacacat cgttcagatg ttcatcaaca cttcttaata gctgcagcca agcttggctg    420

ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg    480

tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc    540

gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg                          580