一种双水相萃取体系及应用此体系分离纯化α－淀粉酶抑制剂的方法

摘要

本发明公开双水相萃取体系及其此体系用于分离纯化α－淀粉酶抑制剂的方法。此双水相体系的成相试剂为对生化产品的生物活性具有稳定与保护作用的聚乙二醇和果糖－1，6－二磷酸金属盐。将此双水相体系应用于α－淀粉酶抑制剂的分离提取过程中，利用其分相快，操作简便，易于放大等优点，并且集成膜分离技术以及冷冻干燥技术，可制备得到具有控制血糖功效的α－淀粉酶抑制剂产品。

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白生物活性目标产物的分离纯化技术，特别是涉及一种双水相萃取体系及应用此体系分离纯化α-淀粉酶抑制剂的方法。

技术背景

生物制品，尤其是蛋白质类生物大分子的药理作用与其生理活性是密切相关的。因此，在分离纯化过程中必须根据目标产物的特点，在保持其生物活性的前提下进行提取操作。双水相萃取体系就是考虑到这种现状，基于液-液萃取理论同时考虑保持生物活性所开发的一种新型的分离技术。

双水相体系是指某些有机物之间或有机物与无机盐之间，在水中以适当的浓度溶解后形成互不相溶的两相或多相体系，双水相体系萃取分离原理是基于生物物质在双水相体系中的选择性分配。当生物物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种分子间作用力的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同，表现为更大或更小的分配系数。双水相体系萃取技术是一种高效而温和的生物分离新技术，该技术由于操作方便，分离效率高，不会导致被分离物质的破坏和失活，目前广泛应用于生物大分子物质的分离和纯化，特别是成功地应用在蛋白质的大规模分离纯化中。

成功利用双水相萃取技术分离提取目标蛋白的关键是选择合适的双水相体系。目前在生化工程中得到广泛应用的双水相体系是聚合物/聚合物体系以及聚合物/无机盐体系，聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran)体系以及聚乙二醇(PEG)/磷酸盐体系或聚乙二醇(PEG)/硫酸盐体系分别是这两者的代表。

α-淀粉酶抑制剂是一种纯天然蛋白生物活性物质，属于糖水解酶抑制剂的一种，存在于植物种子的胚乳中，国外称之为“starch blocker”。α-淀粉酶抑制剂的来源广泛，从小麦粉中提取的α-淀粉酶抑制剂比从豆类中提取的α-淀粉酶抑制剂对胰淀粉酶有更强的抑制作用。在胃肠道中，α-淀粉酶抑制剂能抑制肠胃道内唾液和胰淀粉酶的活性，阻碍或延缓其对食物中主要的碳水化合物淀粉的消化作用，降低食物中淀粉糖类物质的分解吸收，从而起到减低血糖、血脂的作用，抑制血糖浓度的升高。对于肥胖患者，可减少糖向脂肪转化，延缓肠道的排空，增加脂肪消耗以减少体重。因此，α-淀粉酶抑制剂能够防止和治疗肥胖症、脂肪过多症、动脉硬化症、高血脂及糖尿病等。同时α-淀粉酶抑制剂可以阻碍或延缓其对食物中主要的碳水化合物淀粉的消化作用，阻止血糖的升高，从而能使糖尿病人吃饱饭，消除饥饿感。这种可以同时达到控制血糖升高和防治肥胖的蛋白质类生物制品在当今社会有很大的科研价值和应用前景。

目前国外主要采用离子交换纤维素层析或凝胶层析等分离纯化的方法，从小麦粉中提取α-淀粉酶抑制剂，比活力可以提高到4.08倍，但活性回收率仅为9.8％

(Purification and properties of an α-amylase inhibitor from wheat MARY D.O`DONNELL and K.F.McGEENEY Biochinica et Biophysica Acta，422(1976)159～169)；从豆类中提取时纯化倍数可以提高31.7倍，但是活性回收率也只有37％

(Purification and Properties of Phaseolamin，an Inhibitor of α-Amylase，from the KidneyBean，Phaseolus vulgaris J.JOHN MARMEN M.LAUDA The Journal of BiologicalChemistry Vol250，No.20，Issue of October 25，pp.8030～8037，1975)。国内在小麦粉中分离α-淀粉酶抑制剂方面做的比较好的是江西省中医药研究所的张万山等。他们利用Sephadex75、CM-cellulose进行分离得到比活为原来的4.3倍，收率为54％的α-淀粉酶抑制剂。上述提取方法成本很高，操作周期长，不利于进行工业化放大应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种双水相萃取体系-聚乙二醇和果糖-1，6-二磷酸金属盐体系。

本发明的另一目的是应用此体系分离纯化α-淀粉酶抑制剂的方法。

本发明根据α-淀粉酶抑制剂疏水性较强、抑制活性易受环境因素影响等特点，通过实验设计出一种双水相萃取体系，体系所用的双水相试剂为聚乙二醇(PEG)/果糖-1，6-二磷酸(FDP)金属盐，其中聚乙二醇的成相浓度范围重量百分比为1-50％，果糖-1，6-二磷酸金属盐的成相浓度范围重量百分比为2-30％。在一定的条件下，上述的两种试剂能够形成目前文献中尚未见报导的双水相体系。实验过程中，将此双水相体系与PEG/无机盐双水相体系α-淀粉酶抑制剂萃取实验结果进行了对照比较。结果发现，PEG/无机盐萃取体系一旦成相，几乎所有的蛋白都进入到PEG相中，达不到分离纯化α-淀粉酶抑制剂的作用。而采用果糖-1，6-二磷酸金属盐作为下相的聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸金属盐双水相萃取体系分离提取α-淀粉酶抑制剂，取得了较为理想的效果。此体系可简化α-淀粉酶抑制剂的制备过程，保持产物的生物活性，缩短操作周期，与目前文献报道的α-淀粉酶抑制剂提取方法相比，本发明具有极高的技术优势与应用前景。

本发明所提供的双水相体系的建立及在α-淀粉酶抑制剂分离提取中的应用采取如下技术方案：

在20℃的温度条件下，取一定量50％浓度的聚乙二醇于10ml离心管中，逐滴滴加40％浓度的果糖-1，6-二磷酸金属盐，并在混匀器上震荡混匀，直到出现浑浊，记下此时的重量，算出聚乙二醇和果糖-1，6-二磷酸金属盐的百分含量即为临界点含量；接着加入一定量蒸馏水，混匀变澄清，再次滴加果糖-1，6-二磷酸金属盐至刚好出现浑浊。重复进行此操作找出不同PEG浓度时的临界点，利用计算机软件绘制出双水相相图。

本发明的双水相试剂优选聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸金属盐体系，其中的果糖-1，6-二磷酸金属盐为果糖-1，6-二磷酸钠盐、果糖-1，6-二磷酸镁盐或者果糖-1，6-二磷酸钾盐。实验过程中通过对蛋白浓度以及对α-淀粉酶的抑制活性的检测，计算目标蛋白产品收率及活性回收率。

本发明中所使用的双水相试剂为聚乙二醇和果糖-1，6-二磷酸金属盐。聚乙二醇对生化产品的生物活性具有保持和稳定作用，同时果糖-1，6-二磷酸是多羟基化合物，在水溶液中对蛋白质的生物活性具有保护作用。因此，本双水相体系特别适用于生物活性物质的分离提取，在对α-淀粉酶抑制剂的萃取实验中验证了这一点。

通过控制聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸金属盐双水相体系的两相组成，在20℃～25℃，pH4～5之间，将聚乙二醇和果糖-1，6-二磷酸金属盐加入α-淀粉酶抑制剂粗提液中，经过振荡混匀，静置，其中α-淀粉酶抑制剂选择性分配于聚乙二醇相中；将成相试剂与含有目标产品的料液混合成相后，用截留分子量为6000的超滤膜回收聚乙二醇，并将浓缩后的料液通过喷雾干燥或冷冻干燥，制备得到α-淀粉酶抑制剂粉状产品。因此，本发明与其他生物分离技术的集成化，不但稳定并保持了产品的生物活性，而且能够简化制备α-淀粉酶抑制剂产品的工艺路线，降低了生产成本，为α-淀粉酶抑制剂的产业化奠定了基础，同时精制得到的α-淀粉酶抑制剂产品具有控制血糖的功效。

本发明与文献报道的α-淀粉酶抑制剂分离纯化技术相比，具有如下的优点：

1.稳定和保持产品的生物活性

本发明中所使用的双水相试剂为聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸金属盐。聚乙二醇对目标物质的生物活性具有保持和稳定作用，同时果糖-1，6-二磷酸是多羟基化合物，在水溶液中对蛋白质的生物活性具有保护作用。本发明中，α-淀粉酶抑制剂经双水相体系分离纯化后，抑制活性回收率及纯化倍数高于文献中的报道。因此，本双水相体系特别适用于生物活性物质的分离提取。

2.分相迅速，节省溶媒

使用本发明的聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸金属盐双水相体系萃取α-淀粉酶抑制剂，在10分钟左右即可分相，缩短了整个工艺操作周期。同时结合运用膜分离技术超滤浓缩料液，节省了双水相试剂的用量，降低了操作成本。

3.工艺操作简单，易于生产放大

将本发明与膜分离和冷冻干燥等其它生物分离技术集成，将优化α-淀粉酶抑制剂的制备工艺，缩短操作周期，提高产品的收率，为α-淀粉酶抑制剂的产业化打下了基础。

附图说明

图1是本发明聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸钠盐双水相体系的相图。

具体实施方式

下面结合实施例作详细说明

实施例1

1.α-淀粉酶抑制剂的粗提：

●称取4kg面粉，加入16L、0.1mol/L的NaCl溶液，置于转速为100rpm/min搅拌罐中搅拌提取3小时，浸提液用管式离心机离心得清液13.85L，测得蛋白浓度为3.543mg/ml，抑制活性为103.4AU，比活为29.18。

●离心清液用截流分子量为6000的超滤膜浓缩到体积为2.5升，测得蛋白浓度为17.76mg/ml，抑制活性为538.4AU，计算出比活为30.3，超滤浓缩液用25％饱和度的硫酸铵盐析并离心得固体，然后用0.1mol/ml磷酸缓冲液溶解再次离心得清液1L，测得蛋白浓度为12.88mg/ml，抑制活性为1218.9AU，计算出比活为94.6，。

2.聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸钠盐双水相体系分离提取α-淀粉酶抑制剂

●α-淀粉酶抑制剂的粗提清液用截留分子量为6000的超滤膜除盐，并浓缩到体积为400ml，调节浓缩液pH到4～5之间，测得此时的蛋白浓度为26.57mg/ml，抑制活性为2763.8AU，计算出比活为104。

●在1L的分液漏斗中，分别加入6000分子量的聚乙二醇116g，果糖-1，6-二磷酸钠盐345g，浓缩液400ml，充分振荡混匀，静置10min即可成相完毕，从底部放出下相溶液，得到上相溶液，体积为120ml，测定此时的蛋白浓度为29.49mg/ml，抑制活性为6686.5AU，计算出比活为226.7。

3.α-淀粉酶抑制剂的精制

萃取液用截留分子量为6000的超滤膜回收聚乙二醇，并浓缩体积为100ml，经过冷冻干燥得到α-淀粉酶抑制剂成品16.9g，该粉呈微黄色，易溶于水，易吸水潮解。称取10mg干粉溶于5ml蒸馏水中，测得蛋白浓度为1.98mg/ml，酶活为461AU，活性总回收率为54.4％，纯化倍数为8倍。

4.α-淀粉酶抑制剂的初步药效学实验

实验目的：观察α-淀粉酶抑制剂对链脲菌素引起的小鼠糖尿病的影响。

动物：ICR小鼠，购自中国药科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(苏)2002-0011号。

药物：由南京工业大学提供，供试品为灰白色粉末，临用前以蒸馏水配制成一定的浓度供小鼠ig用。剂量：初始提供临床人用量100mg/人/天，按50kg算，即为2mg/kg，换算成小鼠剂量为20mg/kg。因此设计小鼠给药的高、中、低剂量分别为80mg/kg、20mg/kg、5mg/kg。阳性药物：格列美脲片，正安医药(天津)有限公司，国药准字H20010577，批号：030801。盐酸二甲双胍片，正安医药(天津)有限公司，津卫药准字(1994)第002543号，批号：030201。

试剂：葡萄糖测定试剂盒(GOD-PAP法)，上海荣盛生物技术有限公司，批号：031114 。胆固醇试剂盒，上海荣盛生物技术有限公司，批号：20030901。甘油三酯试剂盒，浙江东瓯生物工程有限公司，批号：2003110220。链脲菌素(STZ)，为sigma产品，含量不低于98％，临用前以0.05M柠檬酸配制成1％的溶液供腹腔注射用。

小鼠造模方法：小鼠禁食12h，腹腔注射链脲菌素180mg/kg，72h后测定空腹血糖，以血糖值大于11.1mmol/L的标准判断模型是否成功。

实验方法与结果：取健康ICR小鼠，禁食不禁水12h后，每鼠(正常动物除外)腹腔注射STZ 180mg/kg，72h后测空腹血糖，选取血糖值大于11.1mmol/L的小鼠进行实验，以血糖值进行分为五组，按表1中所示剂量进行给药，每天给药一次，连续给药10d，逐日记录小鼠体重及饮水量。给药第5d、10d分别取血测定小鼠的空腹血糖值。以X±SD表示，组间差异以student’s t-test进行检验，结果见表1。

表1 X对STZ引起的糖尿病小鼠给药5天后血糖的影响(X±SD)

组别         剂量        动物           血糖值(mmol/L)

           (mg/kg)        数         给药前         给药5d后

正常动物                  13       5.50±1.16     5.05±0.82^***

模型空白                  15       19.88±5.89Δ     15.49±2.27

                                       ΔΔ

二甲双胍     100          10       20.15±4.98Δ     15.09±1.75^*

                                       ΔΔ

X             5           15       20.26±7.02Δ     15.25±3.04^*

                                       ΔΔ

X            20           15       20.35±7.58Δ     16.46±1.19^*

                                       ΔΔ

X           80            15       19.75±6.20Δ     13.06±

                                       ΔΔ                 2.40^***

t检验，与正常对照组比较，ΔΔΔp＜0.01，与模型空白组比较，^*P＞0.05，^***p＜0.01

给药5天后，将剂量调整为高、中、低剂量分别为800mg/kg、400mg/kg、80mg/kg，继续给药5天，未次给药后1h，小鼠摘眼球取血，分离血清，测血清中葡萄糖、甘油三酯及总胆固醇的含量。实验结果见表2.

表2 X对STZ引起的糖尿病小鼠给药10天后血糖的影响(X±SD)

组别           剂量     动     血糖值        总胆固醇    甘油三酯

             (mg/kg)    物    (mmol/L)       (mg/dl)     (mmol/L)

                        数

正常动物                13     4.53±                   117.75±         1.13±0.22^*

                               1.52^***       22.74^*

模型空白                15     14.98±3.80    138.87±         0.96±0.56

                                              52.29

格列美脲      0.4       10     12.03±3.12^*  153.76±         0.52±0.66^*

                                              19.73^*

X             80        15     14.49±1.19^*  140.30±         0.86±0.39*

                                              29.75^*

X             400       15     14.12±2.62^*  144.40±         0.64±0.37^*

                                              28.00^*

X             800       15     12.04±4.57^*  141.35±         0.74±0.55^*

                                              22.10^*

由表2可见，模型非常成功，药物的治疗效果显示出一定的苗头，药物的高剂量和格列美脲的效果相似，但两组均无统计学意义，可能由于给药时间较短的原因。糖尿病小鼠未出现总胆固醇及甘油三酯含量的升高现象，而且药物对胆固醇及甘油三酯的含量也未出现明显影响。

表3小鼠体重变化情况

  正常动物模型空白格列美脲低剂量组中剂量组高剂量组第一天24.1±1.7117.1±1.4617.5±1.4317.5±2.5318.5±3.1817.3±1.54第二天24.7±1.4916.8±1.7817.9±1.5216.5±3.4017.5±3.5016.5±1.19第三天26.4±1.6118.4±2.1019.4±1.5118.4±3.4819.6±3.5717.2±1.57第四天26.4±1.8518.5±2.4918.8±1.2718.7±3.3418.9±3.9518.2±1.90第五天27.4±1.8918.7±2.3519.3±1.2219.1±3.8519.3±4.0317.7±1.67第六天27.5±1.9418.6±2.1418.4±1.3319.3±3.8319.2±4.0418.4±1.59第七天27.5±2.2218.8±1.9718.7±1.7319.1±4.2119.6±4.2518.8±1.37第八天27.2±2.5119.6±2.2319.4±1.5919.3±3.2420.5±3.9819.2±1.57第九天26.8±3.0819.9±2.1319.7±2.2419.2±3.4220.3±4.2019.1±1.75第十天24.5±2.4418.4±1.8217.8±1.5117.7±2.6418.7±3.4717.9±1.58

由表3可见，模型动物体重较正常动物均有显著下降，药物在用药10天内，对动物的体重无明显影响。

实施例2

1.α-淀粉酶抑制剂的粗提：如实施例1。

2.聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸镁盐双水相体系分离提取α-淀粉酶抑制剂

●α-淀粉酶抑制剂的粗提清液用截留分子量为6000的超滤膜除盐，并浓缩到体积为405ml，调节浓缩液pH到4～5之间，测得此时的蛋白浓度为27mg/ml，抑制活性为2750.8AU，计算出比活为101。

●在1L的分液漏斗中，分别加入6000分子量的聚乙二醇114g，果糖-1，6-二磷酸镁盐340g，浓缩液405ml，充分振荡混匀，静置10min即可成相完毕，从底部放出下相溶液，得到上相溶液，体积为118ml，测定此时的蛋白浓度为28.4mg/ml，抑制活性为6978.5AU，计算出比活为245.7。

3.α-淀粉酶抑制剂的精制

萃取液用截留分子量为6000的超滤膜回收聚乙二醇，并浓缩体积为102ml，经过喷雾干燥得到α-淀粉酶抑制剂成品17.5g，该粉呈灰白色，易溶于水，易吸水潮解。称取10mg干粉溶于5ml蒸馏水中，测得蛋白浓度为1.85mg/ml，抑制活性为450AU，活性总回收率为55％，纯化倍数为8.3倍。

实施例3

1.α-淀粉酶抑制剂的粗提：如实施例1。

2.聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸钾盐双水相体系分离提取α-淀粉酶抑制剂

●α-淀粉酶抑制剂的粗提清液用截留分子量为6000的超滤膜除盐，并浓缩到体积为420ml，调节浓缩液pH到4～5之间，测得此时的蛋白浓度为30mg/ml，抑制活性为2830.8AU，计算出比活为94.4。

●在1L的分液漏斗中，分别加入6000分子量的聚乙二醇120g，果糖-1，6-二磷酸钾盐360g，浓缩液420ml，充分振荡混匀，静置10min即可成相完毕，从底部放出下相溶液，得到上相溶液，体积为140ml，测定此时的蛋白浓度为30mg/ml，抑制活性为6532.5AU，计算出比活为217.8。

3.α-淀粉酶抑制剂的精制

萃取液用截留分子量为6000的超滤膜回收聚乙二醇，并浓缩体积为110ml，经过冷冻干燥得到α-淀粉酶抑制剂成品18.4g，该粉呈灰白色，易溶于水，易吸水潮解。称取10mg干粉溶于5ml蒸馏水中，测得蛋白浓度为1.63mg/ml，抑制活性为489.9AU，活性总回收率为63.1％，纯化倍数为10倍。

分析方法

α-淀粉酶抑制剂抑制活性的测定方法：碘显色法

利用淀粉溶液在碘-碘化钾试剂作用下显蓝色，在660nm处的吸光值于一定淀粉浓度范围内和淀粉的量呈线性关系的特点，根据抑制剂加入前后α-淀粉酶分解淀粉量的差值即可计算出抑制剂的活性。

取一定量的α-淀粉酶和α-淀粉酶抑制剂于0.5ml磷酸缓冲液中，在37℃条件下预反应30min后，加入0.5ml的0.04％的淀粉溶液再反应15min，用0.3ml的2mol/L盐酸中止反应，3.5ml蒸馏水稀释反应液，加0.2ml 0.01mol/L的碘液显色，在600nm处测定吸光值。

抑制活性的定义：

一个单位的抑制剂活力定义为在上述条件下每毫升抑制剂液在15分钟内抑制α-淀粉酶消耗淀粉的量(mg)。

酶活的计算式为：

$>>AU>=>>>[>>(>>OD>1>>->>OD>2>>)>>->0.0085808>]>>>13.419>\times >n>\; >\times >1000>$>

其中OD₁为加抑制剂后的吸光值，OD₂为只加淀粉酶时的吸光值，n为加入抑制剂的体积(μl)数，1000是从μl换算到毫升的系数。