必特螺旋霉素及其在抗感染性疾病中的应用

摘要

本发明涉及必特螺旋霉素药物组合物及其在抗感染性疾病中的应用，所说组合物中的活性成分异戊酰螺旋霉素(I+II+III)总含量不低于50％，4”－酰化螺旋霉素的总含量不低于80％，与药学上可接受的一种或多种载体组成的组合物，经体内外药效学试验证明，不仅对多数G+阳性菌有较好活性，且对部分G－阴性菌也有作用，特别是对肺炎支原体效果显著，为临床治疗相关感染性疾病提供了科学依据。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种大环内酯类基因工程新抗生素，特别是4”-酰化螺旋霉素药物组合物及其在抗感染性疾病中的应用。

背景技术：

大环内酯类抗生素在临床上占有重要地位，因其对革兰氏阳性菌和支原体有很好的活性，对部分革兰氏阴性菌也有作用，且对一些日趋流行的弓形体、军团菌等难以控制的病原体有良好的抗菌活性和组织渗透性，口服吸收快，不良反应少，对肝、肾功能基本无影响，还有潜在的免疫调节作用，九十年代被认为在治疗成人呼吸道感染上将会与β-内酰胺类药物竞争。近年来，世界各国通过对十四元环红霉素分子结构的化学改造研制新的衍生物已取得进展。目前对红霉素的改造主要是采用化学半合成方法，如红霉素经二步反应获得罗红霉素，四步反应获得克拉霉素，五步反应获得阿齐霉素等。改造后的红霉素类抗生素在抗菌活性、血药浓度、半衰期、酸稳定性及不良反应方面均有明显的改善。但是，总的来说仍须通过发酵产物及化学半合成两个环节进行制备，不仅在生产成本、三废处理方面的问题需要解决，而且还有2.3-4.1％不良反应的报道。

16元环大环内酯类抗生素构效关系的研究显示，碳霉糖4”位亲酯酰基团对于分子向细胞的渗透有重要作用，采用基因工程技术在碳霉糖4”位接上长链酰基碳链，可以提高其亲脂性并增强其体内活性。基于上述思路，本实验室在国家“863”计划专题项目“抗生素基因工程研究”(课题编号：102-19-8)的支持下，自1990年开展了此项工作，成功地将碳霉素产生菌4”-异戊酰基转移酶基因在螺旋霉素产生菌中进行了克隆表达，获得了产生以异戊酰螺旋霉素为主成分的一株质粒型基因工程螺旋霉素链霉菌(Streptomyces spiramyceticus)p66B-F21(保藏编号：CGMCC No.0304)，并申请了生技霉素制造方法专利(申请号：97104440.6)；随后，在维持4”-异戊酰基转移酶基因整合状态下，通过诱变、自然分离等手段，提高整合型原始菌株WSJ-1发酵产生必特螺旋霉素(原名生技霉素)的能力，获得高产菌株WSJ-195(保藏编号：CGMCC No.0801)，并于同年申请了整合型基因工程菌种专利(申请号：02148771.5)。

必特螺旋霉素是以异戊酰螺旋霉素III、异戊酰螺旋霉素II、异戊酰螺旋霉素I三个组分为主的混合物，含有一定量的(异)丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素III及(异)丁酰、丙酰、乙酰螺旋霉素II，其化学结构及组分如下：

    异戊酰螺旋霉素(isv-)III R＝COCH₂CH₃  R’＝COCH₂CH(CH₃)₂

    异戊酰螺旋霉素II        R＝COCH₃     R’＝COCH₂CH(CH₃)₂

    异戊酰螺旋霉素I         R＝H         R’＝COCH₂CH(CH₃)₂

    异丁酰螺旋霉素(iBu-)III R＝COCH₂CH₃  R’＝COCH(CH₃)₂

    异丁酰螺旋霉素II        R＝COCH₃     R’＝COCH(CH₃)₂

    丁酰螺旋霉素(Bu-)III    R＝COCH₂CH₃  R’＝COCH₂CH₂CH₃

    丁酰螺旋霉素II          R＝COCH₃     R’＝COCH₂CH₂CH₃

    丙酰螺旋霉素(Pr-)III    R＝COCH₂CH₃  R’＝COCH₂CH₃

    丙酰螺旋霉素II          R＝COCH₃    R’＝COCH₂CH₃

    乙酰螺旋霉素(Ac-)III    R＝COCH₂CH₃  R’＝COCH₃

    乙酰螺旋霉素II          R＝COCH₃     R’＝COCH₃

目前，必特螺旋霉素已经完成全部临床前药理试验及I期临床研究。为了确保临床用药的安全性和可靠性，提供一种组分稳定、质量可控的必特螺旋霉素制剂(药物组合物)是十分必要的。

发明内容：

本发明提供4”-酰化螺旋霉素在制药中的应用。

本发明还提供一种以4”-酰化螺旋霉素为药物活性成分的药物组合物。

本发明所说的药物组合物，是指含有安全及治疗有效量的4”-酰化螺旋霉素和药学上可接受的载体。

此处所用术语“安全及治疗有效量”，是指能减轻或逆转或治疗人体或其它哺乳动物的疾病而且所服用的药物或药剂对哺乳动物的组织并无严重伤害的药物、化合物、组合物、产品或药剂的足够用量。

此处所用术语“药学上可接受的载体”，是指药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。此外，还可以在组合物中添加其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明所说的4”-酰化螺旋霉素是以异戊酰螺旋霉素III、异戊酰螺旋霉素II、异戊酰螺旋霉素I三个组分为主的混合物，含有一定量的异丁酰螺旋霉素III、异丁酰螺旋霉素II、丁酰螺旋霉素III、丁酰螺旋霉素II、丙酰螺旋霉素III、丙酰螺旋霉素II、乙酰螺旋霉素III及乙酰螺旋霉素II。其中，异戊酰螺旋霉素总含量(I+II+III)应不低于50％；4”-酰化螺旋霉素的总含量应不低于80％。

本发明的组合物可任选使用安全及有效量的稀释剂、崩解剂、润滑剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、赋形剂或任何其它安全及有效量的本领域常用的药物载体。

本发明的组合物以适合药用的制剂形式存在，这些制剂形式是：片剂、素片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、无菌粉针剂等。

本领域技术人员通常知道用于治疗所需的活性成分的量将随各种因素而变化，包括所治疗疾病的性质及患者的年龄和病情，最终由主治医生来判断。本发明所说的组合物以单位剂型给药时，每个单位剂量形式中含有约25～600mg的必活性成分必特螺旋霉素，优选约为50～400mg，更优选约为100mg，将每日所需要的剂量以单一剂量或分剂量的形式给药。

体内外药效学试验证明，本发明提供的组合物中其活性组分必特螺旋霉素具有较好的抗感染效果，不仅对革兰氏阳性菌，尤其是耐红霉素、耐β-内酰胺酶的金葡菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌有较好的抗菌活性，而且对部分阴性菌如卡他球菌、淋球菌、流感杆菌和部分军团菌及厌氧菌也有效，尤其对肺炎支原体的活性显著。

发明效果：

本发明在对高产菌株WSJ-195发酵液进行化学提取及纯化过程中，采用HPLC定量分析手段检测必特螺旋霉素的含量，确定了必特螺旋霉素中4”-酰化螺旋霉素各组分比例可控的提取工艺路线，为制备必特螺旋霉素原料药及其载体组合物奠定了科学可靠的基础。

实施范例：

下面所列实施例可以帮助本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：必特螺旋霉素的制备

从发酵液中制备必特螺旋霉素的方法，是在发酵液中加入1％硫酸铝等助滤剂，过滤。滤液用NaOH调节pH至8.5-9.0，用乙酸丁酯提取发酵液中的必特螺旋霉素，丁酯提取液用无盐水洗涤后，再用1/4体积的1％磷酸盐(NaH₂PO₄)洗涤(1-3次)，HPLC检测提取液中必特螺旋霉素各组分的比例，以确定用1％磷酸盐(NaH₂PO₄)洗涤次数。HPLC检测总异戊酰螺旋霉素含量不低于50％时，再用无盐水洗一次，然后将必特螺旋霉素转入pH2.0的0.7％NaH₂PO₄酸水，除去酸水中的乙酸丁酯，再转入pH到8.5～9.0的碱水中进行沉淀，干燥，获得必特螺旋霉素成品。必特螺旋霉素的详细提取流程图1。

实施例2：必特螺旋霉素的HPLC定量测定方法

使用岛津LC-10A高效液相色谱仪，岛津SPD-6A检测器；色谱柱：瑞典Kromasil C18柱，5μm，0.46×15cm；流动相：乙腈-0.2mol/L磷酸铵-水(53∶20∶27)(pH＝7.0)，每100ml流动相加7滴四丁基氢氧化铵；检测波长231nm，流速：1.0ml/min。

必特螺旋霉素对本系统在8mg/ml-0.2mg/ml浓度范围内，浓度和响应值成线性关系。最低检测限达到1×10^-4mg/ml。采用外标法，用标准品中的9个4”-酰化螺旋霉素总面积积分，计算每微克必特螺旋霉素的响应值，并将检品中9个4”-酰化螺旋霉素的总面积积分，与标准品比较，计算检品中必特螺旋霉素的含量。必特螺旋霉素标准品的HPLC图谱如(图2)所示。

实施例3：必特螺旋霉素成品组分的HPLC检测

按实施例1提供的必特螺旋霉素提取流程及实施例2提供的HPLC定量检测方法，对必特螺旋霉素发酵8批次发酵液进行提取，所获产品各组分的HPLC检测情况如表1所示。

                              表1 8罐枇必特螺旋霉素成品组分的HPLC检测情况

  1  2  3  4  5  6  7  8  平均  isv-III  34.86  36.22  33.84  37.03  34.19  37.76  35.37  39.79  36.13  isv-II  24.67  24.93  24.36  24.85  20.02  25.85  25.19  24.18  24.27  isv-I  13.79  14.89  13.42  14.02  15.86  15.34  13.33  12.38  14.13  Bu-III  iBu-III  3.56  3.45  3.54  3.56  3.22  3.16  3.04  2.62  3.27  Bu-II  iBu-II  0.77  0.27  0.22  0.57  0.33  0.24  0.26  0.27  0.37  Pr-III  5.11  5.48  5.70  5.23  6.73  4.76  5.13  5.32  5.43  Pr-II  0.85  0.82  0.86  0.89  0.30  0.17  0.28  0.26  0.33  Ac-III  8.13  5.74  7.43  7.16  7.43  5.68  7.37  7.36  7.04  Ac-II  2.84  1.92  3.05  3.08  3.47  1.89  3.18  3.09  2.82  总isv  73.32  76.04  71.62  75.9  70.07  78.95  73.89  76.35  74.53  总4”酰化  94.58  93.72  92.42  96.39  91.55  94.85  93.15  95.27  93.79

实施例4：药物制剂的制备

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。    

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1～99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5～95％的活性成分。

A、必特螺旋霉素素片                     (按10000片计算)

处方：必特螺旋霉素原粉                  1000g÷含水效价(u/mg)

      低取代羟丙基纤维素(5％)           92.5g

      羧甲基淀粉钠(3％)                 55.5g

      硬脂酸镁(1％)                     18.5g

      淀粉                              总重-其它原辅料重量

      总重                              1850g

具体工艺步骤：称取适量淀粉，用水稀释至15％浓度，加热至糊状，制成粘合剂；主料必特螺旋霉素、辅料淀粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁分别过100目筛，按处方量，称取所需主料和辅料；必特螺旋霉素、淀粉、低取代羟丙基纤维素充分混合均匀后，用15％淀粉浓度的淀粉糊制成软材，14目筛制粒，50-60℃干燥，水份控制在3-5％，14目筛整粒，加羧甲基淀粉钠，硬脂酸镁混合，测定颗粒含量；根据颗粒含量，计算片重，压片(Φ9mm浅凹冲头)，检测片重差异；经检验合格后进行包装。

B.必特螺旋霉素胶囊剂(按10000粒计算)

处方：必特螺旋霉素原粉         1000g÷含水效价(u/mg)

      淀粉(药用)               1080g-必特螺旋霉素原粉重量

      药用3号胶囊              10000粒

      液体石腊                 50ml

具体工艺步骤：将主料必特螺旋霉素、辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后，装入混和器充分混和后1.5-2小时；取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致(每粒胶囊所装重量约为0.105g)，将经检验合格的药用3号胶囊及混和好的待装原料按全自动胶囊机操作要求，分别填入装料器进行填充，将填充好的胶囊进行差异检验(±10％以内，＜0.3g)，崩解时限检查30分钟内，将检验后符合要求的胶囊，放入打光机内加入液体石腊进行15-20分钟的打光，然后取出进行成品包装和检验。

C.必特螺旋霉素糖衣片(按10000片计算)

处方：参照实施例A。

具体工艺步骤：按照实施例A方法操作，将检验合格后的片心放入糖衣锅中，将配好的糖浆(浓度为65-70％)慢慢加入锅内，然后将温度升至40℃左右，加入适量滑石粉，鼓风干燥25-30分钟反复几次粉衣层包平后，再进行糖衣层15-20分钟进行糖衣层包衣，待糖衣层包平后进行所需色调的包衣层包衣，将色浆调好后放入糖浆中搅匀倒入锅内，每次约15-20分钟，分别几次搅拌均匀。

D.必特螺旋霉素干糖浆                 (按10000袋计算)

处方：必特螺旋霉素原粉               1250g÷含水效价(u/mg)

      柠檬酸(0.5％)(枸橼酸)          15g

      蔗糖                           总重-其它原辅料

      总重约                         500g

      色素(姜黄素)                   约1g

具体工艺步骤：必特螺旋霉素原粉，柠檬酸、蔗糖分别用高速气流粉碎机粉碎成颗粒85％通过300目，15％通过180目，然后将粉碎后的细粉按处方量称取后充分混和1-1.5小时，测其含量，计算装量(理论装量为每袋500mg)，然后将混合物料装入袋装机中，装好铝铂纸，按分装机操作要求分装，装量差异在±5％以内，装好后进行检验合格后外包装。

E.必特螺旋霉素肠溶片(按10000片计算)

处方：参照实施例A。

具体工艺步骤：片心制备按实施例A操作，将符合要求的片心放入糖衣锅中，用60-70％浓度的糖浆和滑石粉进行底衣层包衣三层，然后进行隔离层包衣，加入10％玉米盶酒精溶液，滚转法10-15分钟吹干，再用苯二甲酸二乙酯、丙酮、邻苯二甲酸醋酸纤维、酒精溶液，即肠溶液滴加入锅内，滚转法10-15分钟吹干2-3次。检验合格后，按实施例C进行糖衣包衣。

F.必特螺旋霉素胃溶片(按10000片计算)

处方：参照实施例A。

具体工艺步骤：片心制备按实施例A操作，将符合要求的片心放入高效包衣机中，然后将符合标准的包衣粉(包括脂溶性和水溶性)按要求配制成包衣液，再将包衣液放入胶体磨粉碎、过滤待用。将装好片心的高效包衣锅预热，转速控制在5-10转/分，温度控制在45-60℃，用气雾喷头(＞300目)将包衣孔液喷入锅内，然后干燥25-35分钟，反复进行8-12次，直至包匀，晾干检验合格后包装。

G.必特螺旋霉素颗粒剂(按10000袋计算)

处方：必特螺旋霉素原粉         1250g÷含水效价(u/mg)

      糖粉                     20000g

      糊精                     9000g

      5％PVP-K30               适量

具体工艺步骤：必特螺旋霉素原粉、糖粉、糊精过120目筛，按处方量称取必特螺旋霉素、糖粉、糊精混合均匀，将混合均匀的上述物料用5％PVP-K30胶浆制成软材，摇摆式颗粒机制粒70℃干燥、整粒，送检合格后分装。

实施例5：体外抗菌活性

A、抗肺炎支原体作用

支原体(Mp)的培养用含葡萄糖G-PPLO(Difco公司)的培养基：G-PPLO 3g，酵母浸出液0.5g，三蒸镏水70ml，0.4％酚红液1.0ml，高压灭菌(121℃，15min)。在此培养基中加入兔血清20ml，酵母提取液10ml，50％葡萄糖液2ml，青霉素钠盐溶液(200,000单位/ml)0.5ml，调pH7.8。肺炎支原体采用标准株Mp-1(Mp-FH，ATCC-15531)，地方株(Mp-2，3，4)。将冷冻干燥或冰冻保存的Mp株，用G-PPLO液体培养基传二代，测定支原体浓度(≥10⁸CFU/ml)。称取必特螺旋霉素于容量瓶，加入无水乙醇充分溶解，再加三蒸水制成100微克/ml原液。采用试管二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)，将必特螺旋霉素原液制成系列浓度药液，每管1.8ml，每管加0.2ml菌量为2×10⁶CFU/ml的Mp菌液，37℃温箱培养，每日观察记录Mp生长情况，直至三周。以能抑制Mp生长的最低药液浓度作为必特螺旋霉素抗肺炎支原体的MIC。结果见表2。

表2.抗肺炎支原体的最低抑菌浓度

Mp实验次数必特螺旋霉素Mp-1    8 0.06-0.125Mp-2    3 0.06Mp-3    3 0.03-0.125Mp-4    3 0.03-0.125

B、抗菌作用

试验菌由临床分离致病菌、质控菌和标准菌株。培养基为MH(Difco公司)。各试验菌于2mlMH液中37℃培养18h，用MH液稀释成10⁶CFU/ml作为试验菌液。采用二倍稀释法稀释药液，加入10⁶CFU/ml试验菌液0.1ml，于37℃培养20h，观察生长情况，确定必特螺旋霉素对各试验菌的MIC(表3)。

表3.必特螺旋霉素对各试验菌的MIC

菌株    MIC微克/ml肺炎链球菌31108    0.12肺炎链球菌9757    0.25肺炎链球菌9618    0.06肺炎链球菌50    0.06化脓性链球菌A12    0.5化脓性链球菌3008    0.5化脓性链球菌772    0.25化脓性链球菌97129    0.25金葡菌ATCC25923    1.00金葡菌209p    1.00金葡菌15    0.5金葡菌9776    1.00表葡菌26069    1.00表葡菌9760    0.5表葡菌32    0.25表葡菌9784    0.5流感嗜血杆菌58530    0.06流感嗜血杆菌11    0.25

实施例6：体内抗感染效果

A、抗肺炎支原体效果

用肺炎支原体标准菌株Mp-FH，ATCC-15531感染金黄地鼠，感染量为Mp600万菌量，感染后经口服必特螺旋霉素，每天一次，连续給药12天，于感染后第14天处死动物，肺组织Mp培养，结果表明，用药后肺组织Mp培养明显呈阴性反应，并且必特螺旋霉素的抗肺炎支原体效应与剂量相关(表4)。

          表4.必特螺旋霉素的抗肺炎支原体效应

组别(mg/kg)    动物数(只)动物只数中Mp生长情况    -    +    +    200    10    8    2    0    40    10    3    2    5    20    10    0    1    9    感染对照    10    1    1    8

-Mp培养阴性，±Mp培养可疑，+Mp培养阳性

B、体内抗菌作用

试验菌于2mlMH培养液37℃培养18h，用5％胃膜素稀释菌液，使小鼠感染100％致死菌数作为感染菌液。每只小鼠注射0.5ml致死菌量，感染后分别在0.5-6h每只小鼠不同剂量灌胃給药0.2ml，每个剂量动物数为10只，观察动物死亡数，分别计算必特螺旋霉素对感染动物后的半数保护剂量(EDED)。结果见表5。

          表5.必特螺旋霉素对小鼠感染的保护效应

  感染菌剂量mg/kg  死亡率％  ED₅₀mg/kg  肺炎链球菌    22    10    11.72    17    30    12    50    7    80  化脓性链球菌    74    0    28.69    52    30    30    60    8    90  金葡菌    75    0    32.06    53    40    31    60    9    90

附图说明：

图1-必特螺旋霉素提取流程

图2-必特螺旋霉素标准品的HPLC图谱

其中：①-异戊酰螺旋霉素III

      ②-异戊酰螺旋霉素II

      ③-异戊酰螺旋霉素I

      ④-异丁酰螺旋霉素III

      ⑤-异丁酰螺旋霉素II

      ⑥-丙酰螺旋霉素III

      ⑦-丙酰螺旋霉素II

      ⑧-乙酰螺旋霉素III

      ⑨-乙酰螺旋霉素II

      ⑩-螺旋霉素III