造血细胞连续灌注悬浮培养过程细胞沉降截留装置

摘要

一种用于造血细胞连续灌注培养生物反应器系统的细胞沉降截留装置，包括斜置的横截面为矩形的管状沉降器，其一端的上部设有进料口，沉降器对应于进料口位置的底部设有出料口，其另一端的上底面设有排液口和排气口，本发明的优点在于避免了平板灌注腔或固定床培养反应器细胞难于回收的问题，细胞回收方便，避免了旋转丝网过滤和膜过滤的堵塞失效问题，解决了其它截留装置所用材料的生物相容性较差的问题，本装置内部由垂直沉降区和倾斜沉降区组成，兼有两者的优点，减少了细胞在沉降器底面的沉积，有效缩短了截留过程中细胞在反应器外的平均停留时间。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于造血细胞连续灌注培养生物反应器系统的细胞截留装置，具体地说涉及一种用于连续灌注培养过程中截留造血细胞的沉降分离装置。

背景技术

脐血造血干细胞移植在治疗造血功能障碍，及恶性肿瘤患者放疗后造血能力的恢复等方面有着良好的应用前景。但由于脐血的来源局限性，脐血造血干细胞数量不足已成为脐血造血干细胞移植研究和临床应用的瓶颈，所以脐血造血干细胞体外大规模扩增的研究变得非常迫切。灌注培养过程因其能在培养过程中不断更新培养基，维持良好的培养环境，有利于细胞扩增，而被认为是实现细胞高密度培养的有效途径。

平板灌注腔被用来培养造血细胞，Koller等开发了无基质细胞的灌注式培养体系，成功地将CFU-GM扩增了17-19倍。这种培养腔包括多个微槽(与培养基流动的方向垂直)，它能提供均一的环境，允许营养物的扩散，但把细胞保留在腔体中，不易回收。固定床生物反应器也是实现造血细胞关注培养的一种构思，一般也需要采用一定的介质来截留细胞，同样存在细胞难于回收的问题。

造血细胞悬浮培养在传质和检测方面具有优势，在培养过程中有效截留细胞是悬浮灌注培养反应器系统开发的关键问题。旋转丝网过滤是动物细胞(杂交瘤、CHO细胞等)连续灌注培养中常用的细胞截留装置，该装置通过旋转过滤丝网分离细胞和培养基，该方法的显著缺点在于丝网作为过滤介质容易被堵塞。造血细胞与一般动物细胞(杂交瘤、CHO细胞等)相比，细胞的均一性较差，故难于确定旋转过滤丝网的转速。此外，造血细胞对剪切较为敏感，高剪切会引起较大的细胞损伤，故不宜采用旋转丝网过滤截留。膜过滤，特别是错流膜过滤也被用来分离细胞与培养基，但膜过滤不仅同样存在剪切较大和易被堵塞的问题，而且膜材料与造血细胞的生物相容性较差，所以会引起较大的细胞损伤。

沉降过程由于不存在堵塞失效问题，也被应用于成系动物细胞的截留。垂直细胞沉降器因必须保证沉降器截面向上的流速小于细胞的沉降速率，往往需要较大的横截面积，从而使垂直沉降装置体积庞大。细胞截留过程中，大量细胞悬液离开反应器的培养空间，加上细胞沉降沉降速率较小，致使细胞在反应器外的平均停留时间较长，不利于细胞的正常生长。倾斜式细胞沉降器利用细胞在狭槽中的沉降效应，能使细胞较快沉降到底面，但倾斜式沉降器操作中细胞回流的方向与沉降器内主体流动的方向相反，导致大量细胞沉积于沉降器底面，难于回流至反应器，同样存在细胞在反应器外的平均停留时间较长的问题。大量细胞的积累会恶化沉降器内的培养环境，对细胞扩增不利。

王兆伟，谭文松等(ZL 00116518.6)提出的沉降器设计虽然能有效地进行杂交瘤细胞或其他成系动物细胞的截留，但由于该沉降器操作参数的确定需要确定临界沉降速率，而造血细胞为非均一细胞群，其中干细胞、祖细胞和成熟细胞之间存在显著的大小差异，难于确定临界沉降速率，故操作困难。若对造血细胞进行细胞全截留时，又由于其沉降面长度较大和流场不易控制等，细胞易沉积于沉降器下底面无法顺利回流，造成细胞损伤。一系列实验也发现，该方法不适用于造血细胞连续灌注培养过程的细胞截留。

细胞沉降器的尺寸对细胞截留效果有较大的影响。沉降器截面的宽高比太小(＜1)时，细胞悬液在不同径向高度的流速将出现较大的差异，造成沉降器内部流体的整体流动，不利于细胞沉降过程的控制，严重时径向漩涡引起的返混，会破坏整个沉降过程的定态；沉降器截面的宽高比太大(＞5)时，悬液中的大量细胞易沉积于沉降器底面，不利于细胞的回收。

沉降器长度的确定是依据细胞的平均沉降速率通过模型计算加以设计的，对于造血细胞，沉降器长度过小会削弱沉降器的细胞截留能力，使部分个体较小的细胞随上清液溢出；而沉降器长度过大，不但会加大沉降器的加工难度和材料成本，而且在操作中需要更长的系统稳定时间。所以本专利通过一系列的模型计算和实验研究，确定了较为优化的宽高比和沉降器长宽比。

实验表明，根据所述尺寸设计加工的沉降装置，可有效截留造血细胞，并取得了较高的细胞截留效率。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种用于造血细胞连续灌注培养生物反应器系统的细胞沉降截留装置，在造血细胞灌注培养系统中能有效截留细胞，而不引起较大细胞损伤、损失的造血细胞截留装置。

本发明的技术构思：

颗粒沉降操作常被应用于液固分离的化工过程。1920年，医师Boycotts首先报道了血细胞在倾斜狭槽中的沉降效应，之后许多学者对倾斜式沉降器的沉降现象进行了深入的理论研究，通过数学模型提出了上流式倾斜沉降槽工作流量的理论计算式：

S(vw)＝vw(L sinθ+b cosθ)

其中为S(v)体积流量，v为颗粒沉降速率，L、w、b分别是沉降槽的长、宽、高，θ为沉降槽与垂直方向之间的倾角。

本发明公开的装置首先使大多数细胞经过垂直沉降区快速回流，再利用造血细胞的Boycotts效应，使上溯细胞沉降到底面，上清液从沉降器上端的溢流口流出，有效截留细胞悬液中的造血细胞，回流反应器；少量沉积于沉降器底部的细胞在沉降器内静态培养，最后用培养液冲洗回收。

本发明的技术方案：

一种用于连续灌注培养生物反应器系统的细胞沉降截留装置，包括斜置的横截面为矩形的管状沉降器，其一端的上部设有进料口，沉降器对应于进料口位置的底部设有出料口，其另一端设有排液口和排气口，进料口与排液口之间为倾斜沉降区，进料口与出料口之间为垂直沉降区，排气口的作用是排除沉降器内的空气。

沉降器可采用低毒生物玻璃制作，沉降器内部在使用前用硅化剂(二甲基硅烷2％/甲苯)进行硅化处理。管状沉降器的宽度与高度之比为：宽度∶高度＝1.5～3∶1；长度为宽度的15～30倍。

生物反应器来的细胞悬液从进料口流入，大部分活细胞在垂直沉降区沉降，并从底端出料口流出，回流至生物反应器；少量细胞向上流动，在倾斜沉降区；沉降上清液从上部的排液口排出，工作前沉降器内的空气从排气口排出。

本发明的优点在于避免了平板灌注腔或固定床培养反应器细胞难于回收的问题，细胞容易回收，避免了旋转丝网过滤和膜过滤的堵塞失效问题，解决了其它截留装置所用材料的生物相容性较差的问题，本装置内部由垂直沉降区和倾斜沉降区组成，兼有两者的优点，减少了细胞在沉降器底面的沉积，有效缩短了截留过程中细胞在反应器外的平均停留时间。采用水浴夹套能使沉降器内沉积细胞处于相对稳定的环境，加上定时通过使细胞回流，可缓解沉积引起的细胞损伤，。

附图说明

图1为细胞沉降截留装置结构示意图。

图2为矩形沉降器横截面图。

图3为细胞密度随时间的变化。

图4为造血细胞截留效果。

图5为为上清液取样和冲洗回流后沉降器下底面的显微照片。

具体实施方式

一种用于连续灌注培养生物反应器系统的细胞沉降截留装置，包括斜置的横截面为矩形的管状沉降器1，其一端的上部设有进料口2，沉降器1对应于进料口2位置的底部设有出料口3，其另一端设有上清液的排液口4和排气口5，进料口2与排液口4之间为倾斜沉降区，进料口2与出料口3之间为垂直沉降区。

所说的矩形的管状沉降器1的宽度L与高度H之比为：

宽度∶高度＝1.5～3∶1；

管状沉降器1的长度为宽度的25～35倍；

进料口2，出料口3与沉降器1底面的夹角为40～50°，上下构成垂直沉降区，进料口2与排液口4之间构成倾斜沉降区。

进一步，在沉降器1外设有夹套6，用于通入保温流体(37C°)，以缓解少量细胞在沉降器底面沉积引起的细胞损伤。

                        实施例1

细胞分离与培养：从新鲜脐血(取自中国福利会妇幼保健院)分离得到单个核细胞(MNCs)，用含20％FBS的IMDM培养基(Gibco BRL，USA)重新悬浮，添加SCF、IL-3和IL-6三种细胞因子，其浓度分别为：50ng/ml、20ng/ml和40ng/ml，以1×10⁶cells/ml接种至转瓶中，置于37℃、5％CO₂、湿度饱和的二氧化碳培养箱中培养备用。

实验方法：细胞悬液从沉降装置底端上进料口2流入，从底端下表面的出料口3流出，清液从位于上端的排液口4排出，水浴夹套通以37℃水保温。

结果：考察了沉降过程达到稳定前的，排液口4和出料口3的细胞密度变化，如图3。可以看出，沉降过程稳定时间约为50min。沉降过程稳定后，溢流出口细胞密度稳定在较低的水平。

分析了沉降过程的细胞截留效果，沉降过程稳定后，总细胞的截留状况和截留比，如图4。进口流量在一定程度上会影响整体截留效果，进口流量较大时(50mL/h)，总细胞密度截留率为91.88％，进口流量较小时(20mL/h)，总细胞密度截留率达到96.47％。

沉降器内沉积细胞的显微照片，上清液取样和冲洗回流后沉降器下底面的显微照片见图5。图中，31为沉积于底面的细胞，32溢流口的细胞碎片，33冲洗后的沉降器底面。本实验结果说明本装置在一定实验条件下能有效截留造血细胞。