一类双链RNA分子及其在制备抑制乙型肝炎病毒复制药物中的应用

摘要

本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，具体为一种利用大肠杆菌发酵制备RNA干扰用双链RNA分子或小干扰RNA分子的方法，并将这些RNA分子用于制备治疗乙型肝炎的药物。将本发明得到的ldsRNA或siRNA以适当的比例与乙型肝炎病毒表达载体混合，并用尾静脉液压法注射到小鼠体内。结果显示非同源性序列ldsRNA和siRNA基本不抑制乙型肝炎病毒在小鼠体内的复制，而与乙肝病毒基因同源性的ldsRNA和siRNA可以有效抑制乙型肝炎病毒在小鼠体内的感染复制，抑制率高达90％以上。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药技术领域。具体涉及一种利用大肠杆菌发酵制备RNA干扰用双链RNA(dsRNA)分子或小干扰RNA(siRNA)分子的方法，并将这些RNA分子用于制备治疗乙型肝炎的新药物。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA(dsRNA)特异性地诱发与其同源序列的mRNA分子被降解，导致相应基因表达抑制的现象，是一种特殊的转录后基因表达沉默(post transcriptional gene silence，PTGS)现象。RNAi技术是指基于RNAi现象而开发的抑制特定基因表达的分子生物学技术。最早的有关RNAi现象的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的共抑制(co-suppression)现象。以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNAi现象。

对RNAi原理的研究始于在线虫(C. elegans)中的遗传学分析，用这种方法找到了一系列与RNAi相关的基因。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNAi现象的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸(nt)的RNA片段，这些RNA片段被证明是RNAi所必需的，称为小干扰RNA(short interfering RNA，“siRNA”)。在果蝇中的研究，使RNAi的机制被基本阐明：当长链的dsRNA进入细胞时，它被一种被称为Dicer的核酸水解酶所识别并被剪切成21-25nt的siRNA，双链的siRNA被RNA解链酶解链，以单链的形式与另一核酸水解酶结合形成RNA酶复合体，复合体中的单链RNA象向导一样引导酶复合体识别序列与之互补的mRNA并将其水解，从而特异性地抑制基因的翻译表达。在线虫和植物中，单链的siRNA除了起“向导”作用之外，还可作为聚合反应的引物。在RdRP的作用下，以mRNA为模板，单链的siRNA为引物合成互补链，使得单链的mRNA成为双链RNA，新合成的dsRNA则又被核酸酶Dicer剪切成siRNA。RdRP的作用使RNAi的信号得到放大，只要极微量的dsRNA就能引起强烈的基因表达抑制。

RNAi高效而专一地抑制基因表达的特性使其在基因功能研究方面得到了广泛的应用。与反义核酸、核酶和利用同源重组进行小鼠基因敲除等技术相比，RNAi技术具有无法比拟的优越性。在利用反义核酸技术和核酶技术抑制基因的表达时，如何从目的基因中选择有效的抑制序列，到目前为止仍没有精确的理论指导，只能通过不断的尝试和改进，是一个比较费时费力的过程。而利用RNAi技术则没有这个问题，研究表明目的基因mRNA的二级结构和GC含量都不会影响RNAi的效率。在线虫和植物中，RdRP的作用能够使RNAi的信号得到放大，只要极微量的dsRNA就能引起强烈的基因表达抑制。尤其在线虫中，只要用能够表达目的基因dsRNA的大肠杆菌喂养线虫，该基因的表达就会被抑制。这种优越性使得RNAi技术首先在线虫功能基因组研究中得到广泛的应用，并极大地推进了线虫的功能基因组研究。

在哺乳动物细胞中，超过30bp的dsRNA会通过激活PKR系统和RNase L，导致翻译起始的抑制以及非特异的RNA降解，最终导致非特异性的基因表达抑制。这种机制阻碍了RNAi技术在哺乳动物细胞中的应用。Elbashir等人的工作解决了这一问题。他们用人工合成的21nt的互补双链siRNA在多种哺乳动物细胞中诱发了RNAi机制，并避开了PKR系统和RNase L，专一性地抑制了目的基因的表达。他们的工作首次证明了RNAi技术可以应用于哺乳动物细胞。

RNAi技术不仅在功能基因组研究中显示出无法替代的优越性，而且也为某些目前难以治疗的疾病提供一种新的治疗手段成为可能。病毒性疾病，尤其是反转录病毒感染导致的疾病，象HIV感染引起的AIDS病和HBV、HCV感染引起的病毒性肝炎严重影响着人们的健康，而且目前的治疗手段无法达到根治，RNAi技术的应用，可能会提供更好的治疗和预防手段。目前已经在体外培养细胞体系中实现了利用RNAi技术抑制HIV、HCV、HBV、以及流感病毒的感染复制。可以预见RNAi技术同样可以为肿瘤、心血管疾病和糖尿病等现代高发性疾病提供新的治疗手段。

RNAi技术应用于哺乳动物体系的关键是制备siRNA。目前大约有3种制备方法：化学合成法、细胞内表达法和体外转录长片段dsRNA(ldsRNA)后用大肠杆菌III型RNase或Dicer水解制备siRNA。最初只能用化学合成法制备siRNA。很多生物技术公司都提供RNA合成服务。只要从目的基因mRNA序列中选择出合适的碱基序列，就能由生物技术公司合成此序列的正义RNA链及其互补链，经变性退火后就得到双链siRNA。这一方法比较简单直接，由于RNA合成的价格相当昂贵，限制了化学合成法的推广应用。2002年4月，国际上数个研究小组几乎同时报道了利用哺乳动物细胞III型RNA聚合酶启动子表达短片段的(19-21bp)带茎环结构的双链RNA可以在哺乳动物细胞体系中产生RNAi，对特定基因表达的抑制率达到90％以上，优于人工合成的siRNA。这一技术的产生使得哺乳动物体系的RNAi技术变得更为简便更为成熟。然而要将这种方法应用于临床，类似于基因治疗，而且比基因治疗难度更大。除了需要克服基因治疗所需克服的靶向性、安全性等困难以外，它对整合效率的要求更高，因为它同一般的基因治疗是要增加某一基因的功能相反，它需要抑制特定基因的表达。安全有效而简便的方法是给病人服用或注射siRNA，这类似于以往的反义核酸药物。用大肠杆菌RNase III或Dicer水解体外转录的ldsRNA来制备siRNA是目前已有的最方便的制备方法。本发明提供了一种更为高效、简便和低成本的siRNA制备方法。

乙型肝炎病毒在感染人体肝脏以后会严重影响肝脏功能，尤其在形成慢性感染后会引起多种严重的慢性肝脏疾病，如肝纤维化、肝硬化和肝癌等严重疾病。原发性肝癌患者中约三分之一病人有慢性乙肝病史，血清HBsAg阳性率为66％～80％，远远超出正常人群10％～15％的阳性率。我国是乙型肝炎病毒高感染地区。我国人群中的HBsAg检出率约为10％，包括抗HBs和抗HBc的流行率为50-60％。慢性无症状携带者约1.2亿。乙肝患病率约为2770/10万，其中慢性乙肝患病率0.1-1％。由于现有的乙肝治疗手段效果不佳，并面临耐药突变株的问题，因此对开发新的乙肝治疗方法仍有急切的需求。目前国外数个研究小组已报道成功地应用RNA干扰技术在细胞体系和动物实验中高效地抑制了乙肝病毒的感染复制。对小鼠血清中乙肝表面抗原含量的抑制率可达94％。小鼠肝脏中的病毒DNA和RNA转录物也能被有效抑制。尽管这些数据表明RNA干扰技术可能是非常有前景的乙肝治疗新方法，但要将这一技术应用于临床治疗尚需解决若干问题。例如目前用来获得可抑制病毒感染复制的siRNA的方法有限，且均价格昂贵，不适合于大规模制备。本发明提供的方法弥补了这一缺陷，为应用RNA干扰技术治疗人体乙肝奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于提出一种利用大肠杆菌发酵大规模制备RNAi用长链dsRNA(ldsRNA)和siRNA分子的方法，并将ldsRNA或siRNA分子用于制备治疗乙肝病毒的新药物。

本发明提出的用大肠杆菌发酵大规模制备RNAi用ldsRNA和siRNA分子的方法，包括构建ldsRNA表达载体，并转化大肠杆菌宿主菌，通过大规模发酵，用碱-SDS法抽提发酵菌体得到全RNA和质粒DNA的混合物；该混合物用CF-11柱进行纯化得到ldsRNA，并利用大肠杆菌RNase III将ldsRNA切成12-30bp的siRNA。

本发明中提出了两种可在大肠杆菌中表达长链dsRNA的表达载体，具体如下：

1.茎环结构dsRNA的表达载体的构建

带颈环结构的ldsRNA的表达载体的构建方法是将目的基因片段以相反的方向将基因的3’端连接到第三段DNA片段的两侧，然后克隆到带有一个T7启动子的载体中去，质粒示意图见附图1。当把此表达质粒转化到能表达T7 RNA聚合酶的宿主菌内后，目的基因的正反两个方向的DNA链以及两者之间的第三段DNA链就能被依次转录，成为一条连续的RNA链。由于这条RNA链中的目的基因部分是完全互补的序列，在生理条件下整条RNA链就会形成茎环结构，结构中的双链部分就是目的基因的ldsRNA。

2.双向启动子表达载体的构建

双向启动子表达载体的构建是利用带有大肠杆菌复制起点的表达载体，在合适的位置加入抗性基因和多克隆位点，并在多克隆位点两侧分别加入相对的两个启动子以及终止子(如图2所示)，当在多克隆位点中插入目的DNA片段后就可以以正反两个方向转录RNA。由于转录出来这两条RNA链是完全互补的序列，所以在生理条件下会形成双链，这就是目的基因的双链RNA。

本发明中提出的利用大肠杆菌发酵生产与分离纯化dsRNA的步骤如下：

1.菌体发酵：将dsRNA表达载体通过常规的氯化钙法转化到大肠杆菌中。含有表达载体的大肠杆菌菌落接种到含相应筛选抗生素的培养液中，培养8-12小时，转接到发酵罐中，培养3-5小时后，加入乳糖或IPTG，继续培养3-5小时后放罐，以连续式离心机收集菌体，进行ldsRNA抽提和纯化。

2.RNA抽提：每1g菌体中加入10-20ml的悬浮液(50mM葡萄糖，25mM Tris·HCl，10mM EDTA，pH8.0)中，充分悬浮后加入2倍于悬浮液体积的裂解液(含0.2NNaOH，1％SDS)，轻轻搅拌混匀后加入1.5倍于悬浮液体积的乙酸钾溶液(含5M醋酸根，3M钾离子)，搅拌混匀后冰浴放置10-20分钟后，10000-12000g离心10-30分钟，将上清液转移到另一离心管中。加入与上清液等体积的酚·氯仿·异戊醇(25∶24∶1)，激烈振荡混匀后10000-12000g离心10-30分钟，收集上清液后用于纤维素CF-11吸附纯化。

3.用纤维素CF-11的吸附层析分离ldsRNA：在上述2中得到的离心上清液中向抽提液加入乙醇至终浓度为17-30％，预冷后上样到用含同样比例酒精的STE溶液(0.1M NaCl，10mM Tris·HCl，1mM EDTA，pH8.0)预平衡的CF-11层析柱中；用含有17-20％乙醇的STE溶液连续洗CF-11柱以除去单链RNA和DNA，直至洗脱液OD₂₆₀无吸收时停止。然后用STE溶液洗脱双链RNA，收集流出液，至OD₂₆₀无吸收时结束。所收集的含ldsRNA的溶液或以酒精沉淀或以正丁醇进行浓缩，备用。

本发明中提出的利用大肠杆菌III型RNA酶水解ldsRNA制备小干扰RNA的方法如下：经CF-11纯化得到的ldsRNA经定量后，按每微克ldsRNA用0.02-0.03微克大肠杆菌来源的RNaseIII在37℃水解2-4小时。反应溶液中含1mM DTT，20mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，5mM MgCl₂，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.9。

本发明提出的用大肠杆菌发酵生产的ldsRNA和siRNA抑制乙肝病毒在小鼠体内的复制的方法如下：

1.可用于抑制乙肝病毒感染复制的ldsRNA和siRNA的制备

按本发明提供的长链dsRNA表达载体的构建方法将乙肝病毒基因组任何片段构建到双向启动子表达载体或茎环结构ldsRNA的表达载体中，然后按本发明提供的利用大肠杆菌发酵生产与分离纯化ldsRNA的方法制备所需的ldsRNA，最后用本发明提供的利用大肠杆菌III型RNA酶水解长链ldsRNA制备siRNA的方法制备相应的siRNA。

2.乙肝病毒表达载体的构建

乙型肝炎adr亚型环状基因组DNA用BamHI线性化后连接到pUCmT质粒载体(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)的BglII/BamHI位点中，然后再在得到的重组质粒载体的BamHI位点中连接同一病毒环状基因组DNA的BamHI线性化片段。用PCR和酶切方法鉴定后，得到两拷贝乙肝病毒基因组DNA以首尾相连的方式排列的重组质粒，该质粒命名为pUC-HBV。该质粒用QIAGEN公司质粒纯化试剂盒纯化后用紫外分光光度法定量。

3.按上述方法制备的pUC-HBV和ldsRNA或siRNA以适当的比例用尾静脉液压法注射到小鼠体内，24小时后开始以不同的时间点检测小鼠血清中的乙肝表面抗原含量，乙肝病毒e抗原含量，以及小鼠肝脏功能。结果显示，当pUC-HBV质粒的注射剂量为10μg/只小鼠时，从25μg到100μg的ldsRNA注射剂量均可显著抑制乙肝病毒的复制，并且未见肝脏功能损伤。在所有试验组中，以100μg编码乙肝病毒DNA复制酶部分序列的ldsRNA的抑制效果最佳。

上述结果表明，由本发明制备的双链ldsRNA和siRNA可用于制备治疗乙型肝炎的新药物。

本发明中可以上述ldsRNA或siRNA为主要成份，配以辅料制制成注射液剂型。具体配方如下：

ldsRNA                 12.5-50mg

NaCl                  8.6g

KCl                   0.3g

CaCl₂                 0.13g

加注射用水至1000ml

注射剂量为1.25-5mg/kg体重。

本发明的优点：

与化学合成法和体外转录法相比，本发明提供的siRNA制备方法更为简便，成本更加低廉，尤其适合用于药物制造目的的工业化规模siRNA制备。本发明制备的ldsRNA和siRNA均可特异而高效地抑制乙肝病毒在小鼠体内的感染复制，因而可用于制备高效治疗乙型肝炎的新药物。

附图说明

图1 表达带颈环结构的双链RNA的质粒载体示意图。

图2 双向启动子表达载体示意图。

图3 pET-HBXII图谱。

图4 pET-2P质粒图谱。

图5 CF-11柱纯化dsRNA。其中，A：含pET-SEAP2的大肠杆菌RNA抽提液，B：含pET-22b的大肠杆菌RNA抽提液，C：含pET-SEAP2的大肠杆菌RNA抽提液经过CF-11柱纯化后的样品，D：含pET-22b的大肠杆菌RNA抽提液经过CF-11柱纯化后的样品。

图6 dsRNA的RNaseIII水解。其中，1为24bp分子量Marker；2为水解0小时；3为水解2小时；4为水解4小时。

图7 pST质粒图谱。

图8 转染后第一天小鼠血清中乙肝病毒表面抗原的相对表达量。

图9 转染后第一天小鼠血清中乙肝病毒e抗原的相对表达量。

图10转染后第一天小鼠血清中碱性磷酸酯酶的相对活性。

图11转染后第四天小鼠血清中乙肝病毒表面抗原的相对表达量。

图12转染后第四天小鼠血清中乙肝病毒e抗原的相对表达量。

图13转染后第一天小鼠血清中碱性磷酸酯酶的相对活性。

图14转染后第七天小鼠血清中乙肝病毒表面抗原的相对表达量。

图15转染后第七天小鼠血清中乙肝病毒e抗原的相对表达量。

具体实施方式

1.人乙肝病毒(HBV病毒)X蛋白基因带茎环结构双链RNA表达载体的构建过程如下：

以寡核苷酸5’-GGAATTC ATG GCT GCT AGG CTG TG-3’和5’-GGGGTACC GGCAGA GGT GAAAAA GTT G-3’为引物，以乙肝病毒基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出HBV病毒X蛋白基因，并在5’端和3’端分别引入EcoRI和KpnI位点，然后用上述酶切位点将此基因分别克隆到pUC-118(购自TaKaRa公司)和pST(如图7，构建过程如下：人工合成寡核苷酸5’-ggccgcaacggtaccaccaagcttagtggatccgaattccggct-3’，将此片段连接到pSectag2a(Invitrogen公司)质粒的SfiI/NotI酶切位点之间，得到pST质粒。)载体上，得到pUC-HBX和pST-HBX，将pST-HBX用SalI酶切得到1.5Kb片断，将此片断克隆到pUC-HBX的SalI位点中，用BamHI酶切鉴定得到重组质粒，能释放出1Kb片断的克隆为正确克隆，命名为pUC-HBXII。用NheI和PvuII酶切克隆进入pCI(购自Clontech公司)质粒的NheI和SmaI位点中，得到的克隆称为pCXII。用EcoRI酶切得到的1Kb的片断克隆到pET-22b(购自Novagen公司)中，得到了pET-HBXII，如图3。

2.双向启动子表达载体pET-2P的构建过程如下：

已知pET-22b(购自Novagen公司)表达载体上有T7的启动子和T7终止子，用PCR引物(p5：5’-ccgctcgagttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgcggccgcaagcttgtc-3’；p3：5’-aagatctggcccacccgtgaaggtgagccc gatcccgcgaaattaatacg-3’)以pET-22b为模板扩增出的DNA片断中引入了tac启动子和T3终止子，将此片断用XhoI和BglII酶切克隆进入pET-22b，得到的重组质粒具有双向启动子和终止子，将此质粒命名为pET-2P，如图4。

3.乙肝病毒表面抗原X蛋白以及聚合酶部分编码区基因dsRNA表达质粒载体的构建

乙肝病毒表面抗原，X蛋白以及聚合酶部分编码区DNA片段用pUC-HBV作模板，以

下述引物扩增得到：

HBVS1Ag-sense：        5’-cgggatcctaccacagagtctagactcg-3’，

HBVS1Ag-antisense：    5’-catgtcgacgcaacataccttggtagtcc-3’，

HBX-sense              5’-ggaattcatggctgctaggetgtg-3’

HBX-antisense          5’-ggggtaccggcagaggtgaaaaagttg-3’

HBVP-sense             5’-ggaattcgtcttgggtatacatttgacc-3’，

HBVP-antisense         5’-ggggtaccagaggacaacagagttg-3’，

扩增得到的编码乙肝表面抗原的DNA片段用BamHI/SalI酶切位点克隆入pUC118质粒的相应位点中，编码乙肝X蛋白和聚合酶部分区域的DNA片段用EcoRI/KpnI酶切位点克隆入pUC118质粒的相应位点中。得到的质粒经测序确认克隆到的DNA片段序列的正确性。正确的编码乙肝表面抗原的DNA片段用BamHI/SalI酶切位点克隆入pET-2P的相应位点中。正确的编码X蛋白和聚合酶部分区域的DNA片段用EcoRI/SalI酶切位点克隆入pET-2P的相应位点中。得到的表达质粒分别命名为pET-HBS，pET-HBX和pET-HBVP。

4.dsRNA的发酵表达，提取与纯化过程如下：

菌体发酵：将含有pET-HBXII(其中含有一个可转录出发夹结构的RNA的基因SEAP2)的BL21(DE3)菌株接种到200ml升含氨卞青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，转接到25升的小发酵罐培养8-9小时后再转入装液300升(溶积500升)的大发酵罐中，37℃发酵培养3小时后加入6kg乳糖诱导表达dsRNA，继续发酵3小时后以上海离心机研究所产的GL105型离心机收集菌液，备用。

RNA抽提：将100克菌体以1000ml的悬浮液(同2中所叙)中，加入2000ml的裂解液(同2中所叙)，轻轻搅拌混匀后加入1500ml乙酸钾溶液(同2中所叙)，轻轻搅拌混匀后分装在数个三角烧瓶中后在冰上放置10分钟，以10000g离心10分钟，将上清液回收在数个三角烧瓶中后，加入等体积的酚·氯仿·异戊醇(25∶24∶1)，激烈振荡混匀后以10000g离心10分钟，再回收上清液，备用。

dsRNA的纯化：将1kg CF-11粉末用含20％乙醇STE溶液浸泡平衡后装在一根直径为8cm的玻璃柱中，放置在4℃冷库中。将酚·氯仿·异戊醇抽提后离心得到的上清液中补加乙醇至终浓度20％，在冰上放置20分钟后在冷库中上样到CF-11柱上。用5L含17％乙醇的STE溶液进行洗涤除去单链RNA和质粒DNA后，在用2L预热到55℃的不含乙醇的STE溶液回收dsRNA。下图为纯化前后的DNA样品的琼脂糖凝胶电泳(泳道A与C)，与普通质粒进行的对照试验结果(泳道B和D)相比可知，纯化得到的样品(泳道C)为长链dsRNA。

5.利用RNase III水解长链dsRNA制备siRNA的过程如下：

取4微克经CF-11纯化得到的dsRNA，用0.1微克RNase III 37℃，在不同时间取样，电泳检测结果如图6所示。

动物实验结果

25μg 50μg或者100μg编码HBsAg，HBX，HBV聚合酶部分片段和碱性磷酸酯酶基因的dsRNA(命名为dsHBS，dsHBX，dsHBVP和dsAP)同10μg乙肝病毒表达质粒pUC-HBV2和10μg碱性磷酸酯酶pSEAP2-Control质粒用尾静脉液压法共转染到小鼠肝脏，负对照组只转染10μg pUCmT质粒，正对照组只转染10μg pUC-HBV2和10μgpSEAP2-Control质粒。正对照组小鼠血清中的表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的表达量在转染后24小时达到最高峰，并在观察的7天时间内基本保持稳定。共转染dsHBS，dsHBX和dsHBVP实验组的小鼠血清中的HBsAg和HBeAg被明显抑制，并具有剂量依赖关系，而这些小鼠血清中的碱性磷酸酯酶活性并没有被抑制.。相反的，共转染dsAP实验组小鼠血清中碱性磷酸酯酶活性被抑制，而HBsAg几乎没有被抑制。上述结果表明乙肝病毒的复制被特异性地抑制。抑制效率在转染后第一天最高，以后逐渐减弱。在3种双链RNA中dsHBVP的抑制效率最为显著，转染100μg dsHBVP后第一天对HBsAgHbeAg的抑制率分别为98.5％和100％，并在实验观察过程中始终保持显著的抑制效果第7天的抑制率分别为88.3％and 98.6％。在整个实验过程中小鼠肝脏功能保持良好，血清白蛋白以及谷丙转氨酶水平均表现正常。具体数据见表1和表2。

                   乙肝表面抗原抑制率％    

组别^*          第一天     第四天     第七天

dsAP 25          3.85       2.99       22.12

dsAP 50         10.08      -3.97       35.69

dsAP 100        15.85       9.53       6.66

dsHBS 25        73.69       11.59      2.07

dsHBS 50        84.46       58.47      28.92

dsHBS 100       91.38       79.99      53.6

dsHBVP 25       96.46       42.11      67.86

dsHBVP 50       99.07       90.22      88.3

dsHBVP 100      98.46       92.02      88.3

dsHBX  25       49.07       16.73      31.96

dsHBX  50       73.38       26.78      27.01

dsHBX  100      77.07       10.74      54.63

表一不同种类不同剂量双链RNA对乙肝表面抗原的抑制率

                     乙肝e抗原抑制率％     

  组别^*        第一天    第四天      第七天

dsAP   25       55.53      40.79      32.68

dsAP   50       62.84      38.48      55.43

dsAP   100      59.93      32.93      34.16

dsHBS  25       94.65      44.03      40.85

dsHBS  50       96.31      71.28      61.74

dsHBS  100      97.48      78.78      53.01

dsHBVP 25       99.45      89.39      86.35

dsHBVP 50       100        98.4       93.5

dsHBVP 100      100        100.57     98.6

dsHBX  25       86.56      59.87      57.38

dsHBX  50       96.7       71.99      41.78

dsHBX  100      91.98      45.36      49.76

表二不同种类不同剂量双链RNA对乙肝e抗原的抑制率

^*dsAP编码碱性磷酸酯酶的双链RNA；dsHBS  编码乙肝表面抗原的双链RNA；

dsHBVP编码乙肝DNA聚合酶的双链RNA；dsHBX编码乙肝X蛋白的双链RNA。

数字表示所用双链RNA的剂量(μg)。