一种细胞差异表达与基因测试复合微流芯片

摘要

一种细胞差异表达与基因测试复合微流芯片，其特征在于该芯片由细胞培养单元和分离单元构成，细胞培养单元为多孔点阵，每个孔通过微流通道与分离单元的流入端相连。可以用于不同类细胞的差异表达和/或基因比较分析；同一种细胞的差异培养分析；正常细胞、肿瘤细胞、可疑细胞的比较分析；基于细胞差异表达的药物筛选常规的细胞培养、表达、基因变异分析。本发明将细胞培养和细胞差异表达及基因分析集成在同一块芯片，减少了操作的成本，减少了传统的细胞培养及细胞差异表达及基因分析过程中的污染，提高了分析的速度，为细胞的差异表达及基因分析提供完全一致的分析环境，提高分析数据的可比较性。

说明书

技术领域：

本发明涉及微全分析技术，特别提供了一种细胞差异表达与基因测试复合微流芯片。

背景技术：

在细胞生物学领域，通常要对不同种细胞表达进行差异比较，如对正常细胞、肿瘤细胞、可疑细胞的比较分析；或者对同一种细胞的表达进行培养条件的筛选，或者药物筛选。所有这些都要获取细胞的蛋白质的含量或种类信息，以及基因的拷贝数或转录数。因而常需要以下生化步骤：细胞培养，细胞的转化，细胞的收集，细胞的裂解，核酸的提取、纯化、扩增、电泳分析，或蛋白的提取、纯化、电泳分析。以往这些步骤都是分开进行的。

微全分析技术是20世纪90年代提出的一种全新的概念，可分为芯片式与非芯片式两大类，目前芯片式是发展的重点，其中依据芯片结构及工作原理又可分为微阵列生物芯片，以及微流控芯片。微阵列生物芯片主要以生物技术为基础，以亲和结合技术为核心，以在芯片表面固定一系列可寻址的识别分子阵列为结构特征，已经实现深度产业化。微流控芯片则主要以分析化学和分析生物化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，是当前微全分析技术发展的重点。目前：

芯片点阵已经可以接受各种无菌处理，各种必须的细胞外基质也可以包被在芯片的表面。这为细胞的活体分析提供了基础，同时完全可以在芯片点阵上建立与普通细胞培养相同的环境，从而细胞可以在点阵中存活、生长、繁殖。另外可以根据研究的目的，改变细胞的培养环境：在培养液中加入化学物质，以考察这种物质对细胞生长的影响；改变培养点阵的物理空间结构，考察特定细胞的空间诱导下生长变化；改变细胞培养的温度、湿度、培养液的组成，以优化细胞的培养。这些都为选择性的细胞培养提供了可能。

同时各种生化过程也可以集成在微芯片上。芯片上的链式扩增反应，已经取得成功，可以采用非接触是热循环方式：利用凸镜将红外光源聚焦于芯片上的链式扩增反应的反应液上，热偶可以检测温度反馈给加热源和散热部件，从而精确控制反应的温度。也可以采用接触式的热循环方式：接触的电阻加热片取代凸镜聚焦红外光源，其他部件基本相似。痕量核酸样品的链式扩增反应与高分子溶液的电泳筛分已经可以集成在一个芯片上。甚至将细胞破碎、链式扩增反应、电泳筛分集成在一块芯片也已实现。

另外基于硅凝胶的固相萃取反应也已经在微流通道上实现。作为固相萃取的凝胶可以有多种选择：可以将硅球微颗粒直接灌入柱内；也可以用有机硅烷直接合成：首先将一些有机硅烷用水、酸在加热的条件下制成溶液，灌入微流通道后，再用碱催化制成凝胶。当核酸分子在压力或电渗的带动下通过凝胶时就被吸附，然后用洗脱液洗脱。

但是，到目前为止，将微阵列生物芯片和微流控芯片相结合应用到细胞生物学领域的研究尚未见报道。

发明的技术内容：

本发明的目的在于提供一种细胞差异表达与基因测试复合微流芯片，它可以在一块芯片上实现细胞培养，细胞的转化，细胞的收集，细胞的裂解，核酸的提取、纯化、扩增、电泳分析，或蛋白的提取、纯化、电泳分析，从而大大节省分析时间和分析成本。

本发明提供了一种细胞差异表达与基因测试复合微流芯片，其特征在于该芯片由细胞培养单元和分离单元构成，细胞培养单元为多孔点阵，每个孔通过微流通道与分离单元的流入端相连。

本发明细胞差异表达与基因测试复合微流芯片中，所述分离单元可以是多个基本分离单元的阵列。基本分离单元可以采用十字交叉型，或者双T型。其分离通道可以是直线、折线或者曲线。

本发明还提供了另一种细胞差异表达与基因测试复合微流芯片，其特征在于该芯片由细胞培养单元、固相萃取单元和分离单元构成；细胞培养单元为多孔点阵；固相萃取单元为一段灌注硅凝胶的微通道；细胞培养单元的每个孔通过微流通道与固相萃取单元的流入端相连，固相萃取单元的流出端与分离单元的流入端相连。

本发明提供的第二种细胞差异表达与基因测试复合微流芯片中，所述固相萃取单元中增设一洗脱液的储液槽，其通过微通道与流入端相连。所述分离单元可以是多个基本分离单元的阵列。基本分离单元可以采用十字交叉型，或者双T型。  其分离通道可以是直线、折线或者曲线。

本发明细胞差异表达与基因测试复合微流芯片中，所述细胞培养单元可以用用胶原、细胞表面纤连蛋白、层粘连蛋白，肌腱蛋白、血小板反应蛋白和玻连蛋白、糖蛋白选择性包被。

本发明细胞差异表达与基因测试复合微流芯片，首次将阵列生物芯片技术与微流控芯片相结合，并应用于细胞生物学领域，具有下述功能区域：

细胞培养区：芯片点阵，可以根据需要选择点阵数，以及点阵的尺寸和面积。各种细胞外基质包括胶原、细胞表面纤连蛋白、层粘连蛋白，肌腱蛋白、血小板反应蛋白和玻连蛋白、糖蛋白都可以选择性的包被在点阵内。在需要的情况下，可以将将细胞裂解液加入点阵内裂解细胞，当然也可以用超声、电击穿等其他方法裂解细胞。

核酸的固相萃取：将硅球微粒直接灌入固相萃取通道，或者将有机硅烷水解后的硅溶液灌入通道后，在较高的温度或者碱催化下制成硅凝胶。细胞的裂解液在电渗或压力的驱动下流经硅凝胶后核酸被吸附。

核酸的链式扩增反应区：一定的核酸模板、引物、和碱基在DNA聚合酶的作用下，通过温度循环使核酸扩增。芯片上的被硅凝胶吸附的核酸用洗脱液洗脱后可以集中到核酸扩增区，用接触式或非接触式热循环后扩增。根据需要链式扩增反应区的大小和形状可以任意设计。

核酸分离区：分离区采用一般的十字交叉构型或双T构型，核酸扩增区现在即是样品池，与之相对的是样品废液池，另外的两个是缓冲池和废液池。从交叉点到废液池的通道为分离用，可以根据需要设计成任意长度，采用直线或者折叠形状。一般分离后的核酸可以用激光诱导荧光实现在线检测。核酸的分离一般采用高分子溶液筛分模式。

蛋白分离区：一般也采用十字交叉或双T构型，储液池和分离通道也可以根据需要设计成任意的形状。蛋白分离过程中可以用染料动态标记以便于激光诱导荧光检测，也可以采用偶连质谱检测。蛋白的电泳分离模式相对较多，可以是自由区带电泳、等电聚焦电泳、胶束电动电泳、高分子溶液筛分电泳。

本发明芯片制作的基本过程是：图案经计算机辅助设计后打印，制成挡板，然后在玻璃或石英上直接腐蚀成型，封接制成芯片；也可以用硅片、玻璃、石英、金属制成模板，在各种塑料上复制出子板，然后封接成芯片。

本发明具有以下优点：

(1)  细胞培养和细胞差异表达及基因分析集成在同一块芯片，减少操作的成本。

(2)基于(1)，减少了传统的细胞培养及细胞差异表达及基因分析过程中的污染，提高了分析的速度。

(3)基于(1)(2)，为细胞的差异表达及基因分析提供完全一致的分析环境，提高分析数据的可比较性。

另外，基于本发明细胞培养和细胞蛋白和基因差异分析芯片的结构，它至少具有以下方面的应用：

(1)不同类细胞的差异表达和/或基因比较分析。

分子生物学的实验中，经常会要了解生物体不同的组织部位中的蛋白表达情况，以了解组织发育的分化过程、内在控制机制，从而可以为分子胚胎学、组织学、发育学研究提供准确信息。现在进行这类实验需要单独培养、分另提取需要的蛋白和串行凝胶电泳分析，这样实验量大、操作误差大、结果可靠性低。现在用细胞差异表达与基因测试复合微流芯片，可以最大限度的降低误差，加快实验速度。

(2)同一种细胞的差异培养分析。

特定组织发育的细胞群或肿瘤组织的细胞，对特别的培养的体系(加入了特定的试剂)的反应是非常重要的信息，用细胞差异表达与基因测试复合微流芯片用于细胞培养和差异表达分析，可以以最快的速度拿到信息。

(3)细胞、肿瘤细胞、可疑细胞的比较分析。

现在的医院里，基于免疫学做一些血清方面的检查，以得到肌体内蛋白表达的信息，用于疾病方面的检测，这科方法灵敏性和特异性都很差。不可能用于肿瘤的早期诊断。而用细胞差异表达与基因测试复合微流芯片可以对很少的细胞样品做差异分析，对比正常细胞、肿瘤细胞、可疑细胞的结果，可以很快得到准确的疾病信息。

(4)基于细胞差异表达的药物筛选。

化合物对细胞培养的效应分析用于药物筛选是一种非常有效的药筛手段。这需要将细胞培养和差异表达分析集成起来、高通量快速分离。现在没有这样的设备。细胞差异表达与基因测试复合微流芯片则可以应用于这一领域。

(5)常规的细胞培养、表达、基因变异分析。

很多生物学现象最终要在细胞层次上才能找到答案，所以常规的细胞培养、表达、基因变异分析越来越成为一个普通的生物学研究手段，现在的培养板或培养瓶的单独培养，再细胞破碎，蛋白或核酸提取，凝胶电泳、染色、显象、人工定量已经不能适应生物学研究的需要了。细胞差异表达与基因测试复合微流芯片完全可以代替以上流程。

附图说明：

图1为细胞培养多孔板结构示意；

图2为核酸的固相萃取与洗脱结构示意；

图3为核酸或蛋白分离结构示意；

图4为细胞差异表达与基因测试复合微流芯片I结构示意；

图5为细胞差异表达与基因测试复合微流芯片II结构示意；

图6为细胞差异表达与基因测试复合微流芯片III结构示意；

图7为细胞差异表达与基因测试复合微流芯片IV结构示意；

图8为细胞差异表达与基因测试复合微流芯片V结构示意；

图9为细胞差异表达与基因测试复合微流芯片VI结构示意。

具体实施方式：

细胞差异表达与基因测试复合微流芯片，主要由三个部分组成：  第一部分，细胞培养多孔板，见图1；孔的大小、个数、与空间构型由实际需要确定，细胞培养的试剂和裂解液直接加到多孔中，图1.1是一个48孔的培养板。

第二部分，核酸的固相萃取与洗脱，见图2，流入端A与所有的细胞培养点阵由微流通道相连，洗脱液的储液槽B也与A相连。当细胞的裂解液流出时，流出端C与蛋白的进样端相连。当核酸的洗脱液流出时，流出端与核酸的链式扩增区相连。

第三部分，核酸或蛋白分离芯片，见图3，可以采用十字交叉型，如A′B′，也可以采用双T型，如C′、D′，以增大进样量。分离通道可以是直线的，如A′、C′，也可以是折线的，如B′、D′，以增大分离长度，提高分离度，增大峰容量。蛋白样品的进样端就是细胞裂解液流经固相萃取区后的流入端。核酸样品的进样端就是核酸固相萃取经洗脱后的流入端，同时也是核酸链式扩增反应区。

细胞差异表达与基因测试复合微流芯片可以是以上三个部分的合理组合，图4是细胞培养、核酸萃取、蛋白分离的组合，图5是细胞培养、蛋白分离的组合，可以用于细胞的差异培养和细胞内蛋白差异表达的分析。图6是细胞培养、核酸萃取、核酸链式扩增反应以及核酸分离的组合。可以用于细胞的差异培养以及细胞内核酸差异分析。

图7是单孔细胞培养、核酸固相萃取、核酸链式扩增反应、蛋白及核酸分离的组合，可以用于一种细胞的常规培养及蛋白和核酸的分析。图8，9将单孔增加到多孔，芯片也可以是圆形或其他形状，以方便芯片的设计。