基因芯片筛选骨髓间充质干细胞与软骨细胞的差异表达基因

摘要

目的：通过筛选大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)与透明软骨细胞及弹性软骨细胞的差异表达基因，找到在两种软骨中共同上调的基因，以及在透明软骨中上调而在弹性软骨中下调及在弹性软骨中上调而在透明软骨中下调的基因，从中找到在MSCs向软骨细胞方向分化过程中起关键作用的基因，为进一步筛选可诱导MSCs向软骨细胞分化的生长因子打下基础。 方法： (1)采用密度梯度离心法分离SD大鼠的MSCs；采用酶消化法获得SD大鼠弹性软骨细胞；取SD大鼠肋软骨，剥离软骨膜，收集透明软骨组织。 (2)体外传代培养已分离获得的MSCs与弹性软骨细胞。 (3)分离、培养MSCs与弹性软骨细胞至第三代，采用一步法提取MSCs与弹性软骨细胞及透明软骨组织的总RNA并纯化，将三者RNA反转录为双链cDNA，用Cy5-dCTP,Cy3-dCTP分别标记MSCs和软骨细胞的cDNA探针，分别与两片芯片杂交并清洗，用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪进行扫描后获得的荧光信号图像用计算机GenePix Pro 4.0图像分析软件进行分析。 (4)以2倍差异显著性为标准，即cy5/cy3<0.5为上调基因，cy5/cy3>2为下调基因。找出差异表达基因，对所获差异表达基因进行功能查询并结合cy5/cy3比值找到可能在MSCs向软骨细胞方向分化过程中起关键作用的基因。 结果： (1)MSCs经形态学及流式细胞仪鉴定符合实验要求。 (2)MSCs与两种软骨细胞的总RNA的OD260/OD280都介于1.80与2.0之间，且三组RNA的电泳条带清晰，28S比18S的亮度接近2:1，三份样品的纯度符合要求，亦无降解。 (3)在透明软骨组中找出差异表达基因2148条，其中上调基因1041条，下调基因1107条。在弹性软骨组中找出差异表达基因2114条，其中上调基因1226条，下调基因888条。在两种软骨中共同上调的基因数为582条，共同下调的基因数为612条，而于透明软骨组中上调，弹性软骨组中下调的基因数为459条，在弹性软骨组中上调而在透明软骨组中下调的基因数为345条。 (4)对所获差异表达基因进行功能查询并结合cy5/cy3比值后在与软骨分化相关的差异表达基因中筛选出了cy5/cy3比值最高，差异显著性最大的一组差异表达基因：软骨调节素1(chondromodulinl，Chml)基因、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因、前Ⅱ型胶原α1链(procollagen，type2，alpha1，Col2α1)基因、软骨同源异型蛋白1(cartilage homeoprotein 1，Cartl)基因、基质金属蛋白酶3(matrix metallopeptidase3，MMP3)基因及基质金属蛋白酶抑制因子3(tissue in hibitors of metalloproteinase3，TIMP3)基因。他们为本文研究的目标基因。 结论： (1)骨髓间充质干细胞和软骨细胞的基因表达谱存在显著差异。 (2)诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化可通过多种生长因子的协同作用，上调或者下调某些关键基因的表达来实现。 (3)在两种软骨中均相对于MSCs上调表达的Chm1基因和CTGF基因，可能是诱导MSCs向软骨细胞方向分化的关键基因。 (4)在透明软骨中相对于MSCs上调而在弹性软骨中相对于MSCs下调表达的Col2α1基因与Cart1基因可能是诱导MSCs向透明软骨方向分化的关键基因。 (5)在弹性软骨中相对于MSCs上调而在透明软骨中相对于MSCs下调表达的MMP3基因及TIMP3基因，可能是诱导MSCs向弹性软骨方向分化的关键基因。 (6)进一步分析验证以上所获差异表达基因，可能筛选出新的生长因子，实现定向诱导MSCs生成表型鲜明、稳定的组织工程软骨。

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结论

参考文献

综述软骨组织工程相关生长因子的研究进展

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