肽－间隔基－脂质缀合物的固相合成方法、由其合成的缀合物及含有该缀合物的靶向脂质体

摘要

本发明涉及制备肽－间隔基－脂质缀合物的固相合成方法，由该方法合成的肽－间隔基－脂质缀合物，以及含有该肽－间隔基－脂质缀合物的脂质体。本发明提供方便地制备肽－间隔基－脂质缀合物的固相合成方法，并且提供用于缀合肽、间隔基和脂质的各种连接基团(如酰胺基)，其中间隔基可以包括PEG。可以实现几种优点，如简化合成程序，可以将合成方法设置成自动化，各反应步骤中的纯化更容易，以及合成期间的产品损失可以降低到最小。本发明的合成方法适于制备多种肽－间隔基－脂质缀合物，并提供由本发明的固相合成方法制备的肽－间隔基－脂质缀合物，它们可以作为面向特定细胞的脂质体给药系统的靶部分而引入脂质体中，而且本发明提供含有本发明的肽－间隔基－脂质缀合物的靶向脂质体。

说明书

技术领域

本发明涉及制备肽-间隔基-脂质缀合物的固相合成方法以及这些缀合物的用途。

背景技术

药物转运在治疗剂改良方面起着重要的作用，因为如果直接用于人体，许多药剂都有不利的缺点。因此，对于特定的药剂，为了改善其利用度，如降低副作用、增强功效和方便使用，需要开发给药系统。举例来说，抗肿瘤化学疗法由于其对正常组织的广泛毒性所带来的不利副作用而受到限制。因此，需要能够阻止药物扩散并将药物集中于疾病部位的给药系统。

脂质体用作给药系统可以提供几个优点，因为它们对生物系统是安全的，具有运载亲水性或者疏水性药物的优良球形双层结构，并且能够阻止药物的降解和扩散。此外，可以修饰脂质体使之对特定目的具有附加功能。成功的实例可见于聚乙二醇(PEG)接枝的脂质体。这些修饰的脂质体可以避开网状内皮系统并且在血液中具有延长的循环时间。另外，包封在PEG接枝的脂质体中的细胞毒癌症药物提供显著增强的抗肿瘤活性作用，并且降低了对正常细胞的毒性副作用。因此，PEG接枝的脂质体得到了商业应用，而且提供了进一步修饰这些PEG接枝的脂质体用于靶向给药的可能性。

已经开发了几种类型的靶向脂质体(Maruyama等，BiochimBiophys Acta.1995，1234，74-80；和Allen TM，Trends Pharmacol Sci.1994，15，215-220)。通常使用的靶向脂质体包括(1)连接在常规脂质体脂质首基上的靶向配体(A型)；(2)连接在PEG接枝的脂质体脂质首基上的靶向配体(B型)；以及(3)连接在PEG接枝的脂质体上PEG链末端的靶向配体(C型)。迄今为止，研究表明C型靶向脂质体为靶向给药提供更好的脂质体结构(Maruyama等，BiochimBiophys Acta.1995，1234，74-80)。基于这种脂质体结构，几种类型的分子，如抗体(Ahmad等，Cancer Res.1993，53，1484-8；以及Suzuki等，Biochim Biophys Acta.，1995，1245，9-16)、蛋白质(Eavarone等，JBiomed Mater Res.2000，51，10-4)、小的合成分子(Gabizon等，Bioconjug Chem.1999，10，289-98)，以及肽(Zalipsky等，BioconjugChem.1997，8，111-8)，都已经被开发用作与靶位结合的靶向配体。在这些分子类型中，肽被认为是具有很大潜力的靶向配体，因为肽可以用作蛋白-蛋白相互作用，如受体-配体相互作用中的识别成分。此外，与疾病有关的许多细胞膜受体也已经得到研究。

肽，如RGD肽、促生长素抑制素、趋化肽、血管活性肠肽以及它们的模拟物都是靶向配体的良好候选物。已经发现这些肽的许多抗衡受体在各种肿瘤细胞中过度表达。此外，肽和肽的模拟物比其它分子类型(如抗体)具有几种独特的优点。一般而言，这些肽以高亲和性配体-受体缔合作用结合于靶细胞，并且通过受体介导的胞吞作用进入细胞间区室。但是，基于抗体的靶向脂质体却不能通过细胞膜上的抗原利用胞吞作用途径进入细胞内部。另外，肽很少有机会被网状内皮系统所识别并因此被从血液循环系统中清除。与天然肽相比，肽模拟物能够提供更高的结合亲和力，并且更好地抵抗蛋白酶降解。

现在，已经开发了两种制备肽基靶向脂质体的方法，从而使肽配体可以连接在PEG的末端。第一种方法是将端基官能化的PEG脂质缀合物引入脂质体，然后与肽配体缀合(Zalipsky等，Bioconjug.Chem.，1995，6，705-8)。但是，当端基官能化的PEG缀合于肽配体时，如果肽配体中反应基团多于一种，那么就可能发生非同质缀合。此外，官能化PEG的未反应端基很难定义，而且在偶联反应后被完全去活化。第二种方法是直接将肽-PEG-脂质缀合物引入脂质体膜(Zalipsky等，Bioconjug.Chem.，1997，8，111-8)。这种方法可以提供结构上良好定义的靶向脂质体成分。

尽管肽-PEG-脂质缀合物是制备靶向脂质体的预期分子，但是可获得的缀合物仍然十分有限，并且合成困难。这是因为在肽-PEG-脂质缀合物中，肽中侧链的化学性质多样，PEG的分子量不均匀，而且脂质的性质是两亲性的。这些特性在侧链保护的合成方法、纯化和反应中引起困难，并且明显已经合成的肽-PEG-脂质缀合物很少，而且肽、间隔基和脂质的缀合通常导致形成拙劣的连接以及异常的官能团。

Zalipsky等(1997)公开了YIGSR-PEG-脂质缀合物的合成方法。但是该方法不能用作合成多种肽-PEG-脂质缀合物的一般方法，因为在肽中可能发生溴乙酰基与强亲核残基，如氨基或者其它巯基的非特异性反应。此外，在YIGSR-PEG-脂质缀合物中，使用硫代乙酰(-S-CH₂-CO-)连接基来缀合肽与PEG，这在工业化生产中不利，因为这需要在肽和PEG的末端分别附加修饰溴乙酰基和巯基。YIGSR-PEG-脂质缀合物中PEG和脂质间的尿烷连接是非天然且酸碱不稳定的。因此，需要有制备多种肽-间隔基-脂质缀合物的合成方法。

既使EP 1 118 336举例阐述了奥曲肽-间隔基-PEG-间隔基-DOPE缀合物的合成，但是奥曲肽与DOPE通过间隔基-PEG-间隔基的偶联涉及四个官能基和三种间隔基，这将使分子变得更为复杂，并且对分子的表征和工业使用不利。同样，EP 1 118 336也未能清晰地描述合成程序、试剂、条件和纯化方法。结果，奥曲肽-间隔基-PEG-间隔基-DOPE缀合物的纯化与结构未能被公开。因此，基于EP1 118 336的技术，本领域技术人员不能实施奥曲肽-间隔基-PEG-间隔基-DOPE缀合物的合成。

发明内容

本发明提供方便地制备肽-PEG-脂质缀合物的固相合成方法，并且提供用于缀合肽、间隔基和脂质的各种连接基团(如酰胺基)。根据本发明的固相合成方法，可以实现几种优点，如简化的合成、自动合成、各反应步骤中的容易的纯化方法，以及合成期间最小的产物损失。另外，本发明的方法适于制备多种肽-间隔基-脂质缀合物。

本发明还提供由本发明的固相合成方法制备的肽-间隔基-脂质缀合物。这种肽-间隔基-脂质缀合物可以作为面向特定细胞的脂质体给药系统的靶向部分引入脂质体。

本发明还提供一种包含本发明的肽-间隔基-脂质缀合物的靶向脂质体。

缩略语表

本文公开的本发明使用下列化学命名：2-Br-Cbz              2-溴苄氧碳基(2-bromobenzyloxycarboyl)2-Br-Z                2-溴苄氧羰基2-Cl-Cbz              2-氯苄氧碳基(2-chlorobenzyloxycarboyl)2-Cl-Z                2-氯苄氧羰基Abu                   4-氨基丁酸AC                    酰基Acm                   乙酰氨基甲基Boc                   叔丁氧羰基Bz                    苯甲酰基Bzl                   苄基Cbz            苄氧碳基(benzyloxycarboyl)DCC            二环己基碳二亚胺DC-Chol        3β[N-(N′，N′-二甲氨基乙烷)氨基甲酰]胆固醇DCM            二氯甲烷DDAB           溴化二甲铵Dde            1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亚环己-1-基)乙基DIPCDI         1，3-二异丙基碳二亚胺DMAP           二甲基氨基吡啶DME            乙二醇二甲醚DMF            N，N-二甲基甲酰胺DMRIE          溴化N-[1-(2，3-二-十四烷基氧)丙基]-N，N-二

           甲基-N-羟乙基铵DMS            二甲硫DOPAT          1，2-二油基氧-3-(三甲基氨基)丙烷DOPE           二油酰磷脂酰胆胺DORIE          溴化N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N-二甲基-

           N-羟乙基铵DOTMA          氯化N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲

           基铵DOX            阿霉素DSPE           硬脂酰磷脂酰胆胺EDC            1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺EDT            乙二硫醇EGF            表皮生长因子FGF            成纤维细胞生长因子Fmoc           9-芴基甲氧羰基For            甲酰基HF            氟化氢HGF           肝细胞生长因子HOBt          N-羟基苯并三唑HSPC          氢化大豆卵磷脂IGF           胰岛素样生长因子Im            咪唑-1-基MBHA          4-甲基二苯甲基酰胺MeOH          甲醇Mmt           4-甲氧基三苯甲基Mtr           4-甲氧基-2，3，6-三-甲苯-磺酰基Mts           均三甲苯-2-磺酰基Mtt           4-甲基三苯甲基mPEG-DSPE     甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰胆胺NGF           神经生长因子NHS           N-羟基丁二酰亚胺PACAP         垂体腺苷酸环化酶-活化肽Pbf           2，2，4，6，7-五甲基二氢-苯并呋喃-5-磺酰基PDGF          血小板衍生生长因子Pd-C          活性炭负载的钯催化剂PEG           聚乙二醇pMeoBzl       对甲氧基苄基Pmc           2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基pNP           对硝基苯基SPPS          固相肽合成SST           促生长素抑制素Su            丁二酰亚胺TCP           2，4，5-三氯苯基TEA          三乙胺TFA          三氟乙酸TFE          三氟乙醇TFMSA        三氟甲磺酸Tf           三氟甲磺酰基Tfa          三氟乙酰基TGF          转化生长因子THP          四氢吡喃基Tos          甲苯磺酰基Trt          三苯甲基tBu          叔丁基tButhio      叔丁基硫VEGF         血管内皮生长因子VIP          管活性肠肽Z            苄氧羰基

具体实施方式I.制备肽-间隔基-脂质缀合物的固相合成方法

根据本发明，制备肽-间隔基-脂质缀合物的固相合成方法包括以下步骤：

(1)在固相中合成氨基酸残基受保护的肽基树脂；

(2)将间隔基和脂质缀合于肽基树脂，从而形成带有肽-间隔基-脂质的肽-间隔基-脂质树脂；

(3)从肽-间隔基-脂质树脂上裂解下肽-间隔基-脂质；

(4)从肽-间隔基-脂质的至少一个氨基酸上脱除至少一个侧链保护基，从而形成肽-间隔基-脂质缀合物；以及

(5)使肽-间隔基-脂质缀合物经受选自基本上由下列方法组成的组的方法：

(a)没有进一步处理，

(b)在前述步骤(1)～(4)中的任何步骤期间将肽-间隔基-脂质缀合物的肽部分修饰成环状形式，以及

(c)在前述步骤(1)～(4)中的任何步骤之后将肽-间隔基-脂质缀合物的肽部分修饰成环状形式，

其中间隔基通过连接官能团缀合于选自基本上由肽基树脂和脂质组成的组的成分。A.氨基酸残基受保护的肽基树脂的固相合成

本发明的肽基树脂可以通过本领域公知的任何固相合成技术制备。相关技术如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963)，Stewart，Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)(Freeman和Co.，SanFrancisco，(1969))，Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)(Pierce Chemical Company，Rockford，(1984))，以及Atherton等，Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach(固相肽合成：实用方法)(IRL Press，Oxford(1989))引入本文作参考。

根据本发明，Fmoc和Boc固相肽合成(SPPS)方法是制备肽基树脂的优选方法。Boc SPPS使用酸不稳定的Boc(1-丁氧羰基)基团作为α-氨基的保护基，而Fmoc SPPS使用碱不稳定的Fmoc(9-芴基甲氧羰基)作为c-氨基的保护基。Fmoc和Boc SPPS都是本领域公知的方法，例如Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，Pierce Chemical Company，Rockford(1984)，以及Chan和Whiite，FmocSolid Phase Peptide Synthesis：a Practical Approach(Fmoc固相肽合成：实用方法)，Oxford University Press，Oxford，(2000)。

在初始连接后，用洗涤溶液去除过量的试剂和副产品。随后加入氨基酸，通过包括下列步骤的方法延长肽链：(1)用脱保护试剂使α-氨基保护基脱保护；以及(2)在有机溶剂中用偶联试剂偶联氨基酸。在每步脱保护和偶联之后用洗涤溶液进行洗涤步骤。可以用Kaiser试验(Kaiser等，Anal Biochem.，1970，34，595-8页)来确定偶联反应是否完成。当试验呈“阴性”时终止偶联反应。在预期的肽完成之后，将所得肽基树脂与间隔基缀合。

根据本发明，偶联试剂可以选自用于肽键形成的试剂。这些偶联试剂的实例包括，但不限于，二环己基碳二亚胺/N-羟基苯并三唑(DCC/HOBt)、1，3-二异丙基碳二亚胺/N-羟基苯并三唑(DIPCDI/HOBt)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)。偶联试剂优选的实施方案是DIPCDI/HOBt。

根据本发明，用于叔丁氧羰基(Boc)保护基的脱保护试剂可以是三氟乙酸(TFA)，而用于9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基的脱保护试剂可以是哌啶。

根据本发明，用于脱保护、偶联和洗涤的主要溶剂包括，但不限于，二氯甲烷(DCM)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)。树脂

根据本发明，许多种树脂可以用于肽基树脂的合成。适于Fmoc固相肽合成(SPPS)的树脂包括，但不限于，羟甲基树脂、王氏树脂(Wang resin)、2-氯三苯甲基氯树脂和Rink酰胺树脂。适于Boc SPPS的树脂包括，但不限于，Merrifield树脂、4-甲基二苯甲基酰胺(MBHA)树脂和肟树脂。在Fmoc化学中，王氏树脂和羟甲基树脂可以用于合成在C-端带有羧基(-COOH)、烷基酰胺基(-C(O)NHR)、二(烷基)酰胺基(-C(O)NR¹R²)，或者酯基(-C(O)OR)的肽。在Fmoc化学中，Rink酰胺树脂可以用于合成在C-端带有酰胺基(-C(O)NH₂)的肽。在Fmoc化学中，2-氯三苯甲基树脂可以用于合成在C-端带有羧酸、胺，或者羟基官能团的肽。在Boc化学中，Merrified树脂可以用于合成在C-端带有羧酸或酯的肽。在Boc化学中，MBHA树脂可以用于合成在C-端带有酰胺的肽。在Boc化学中，肟树脂可以用于合成在C-端带有烷基酰胺或酯的肽。

在本发明的一个优选实施方案中，肽-间隔基-脂质缀合物的合成通过使用Fmoc化学中的王氏树脂、2-氯三苯甲基氯树脂和Rink酰胺树脂来进行。氨基保护基

根据本发明，用于肽链延长的氨基酸中的氨基可以在氨基酸偶联成延长肽的期间进行保护。在偶联反应后，为了进行下一个氨基受保护的氨基酸偶联，将保护基脱除。

根据本发明，适当的保护基包括，但不限于，酰基类保护基如甲酰基、三氟乙酰基和乙酰基；芳族尿烷类保护基如Fmoc、苄氧碳基(Cbz)和取代的Cbz；脂族尿烷类保护基如叔丁氧羰基(Boc)、异丙氧羰基和环己基氧羰基；以及烷基类保护基，如苄基和三苯甲基。但是，优选的保护基是Fmoc和Boc。侧链保护基

根据本发明，侧链保护基是指能够连接于氨基酸侧链从而在化学反应中保护侧链，但是在所需反应完成后又能容易脱除的基团。适当的氨基侧链保护基包括，但不限于，乙酰基(AC)、Boc、Cbz、2-氯苄氧碳基(2-Cl-Cbz)、2-溴苄氧碳基(2-BrCbz)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、苄氧羰基(Z)、Fmoc、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧亚环己-1-基)乙基(Dde)和三氟乙酰基(Tfa)。适当的羟基侧链保护基包括，但不限于，苄基(Bzl)、叔丁基(tBu)和三苯甲基(Trt)。适当的巯基侧链保护基包括，但不限于，乙酰氨基甲基(Acm)、Bzl、tBu、叔丁基硫(tButhio)、对甲氧苄基(pMeoBzl)和4-甲氧基三苯甲基(Mmt)。适当的酚羟基侧链保护基包括，但不限于，四氢吡喃基、tBu、Trt、Bzl、Cbz、z-Br-Cbz和2，5-二氯苄基。适当的咪唑基侧链保护基包括，但不限于，Boc、Mtt、甲苯磺酰基(Tos)和Trt。适当的吲哚侧链保护基包括，但不限于，Boc。适当的羧酸侧链保护基包括，但不限于，苄基、2，6-二氯苄基、tBu和环己基。适当的胍基侧链保护基包括，但不限于，4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯-磺酰基(Mtr)、均三甲苯-2-磺酰基(Mts)、2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)和Tos。B.脂质-间隔基-肽基树脂的合成

在本发明的一个优选实施方案中，通过将间隔基缀合于肽基树脂，获得间隔基-肽基树脂，然后将脂质缀合于间隔基-肽基树脂，从而合成脂质-间隔基-肽基树脂。

在本发明的另一个实施方案中，通过将间隔基-脂质缀合于肽基树脂，从而合成脂质-间隔基-肽基树脂。将间隔基缀合于肽基树脂

根据本发明，亲水聚合物间隔基可以通过许多种连接官能团缀合于肽基树脂。连接官能团的实例列于下表I中。表I产生连接官能团的肽N-端官能团、脂质首基和间隔基端基

通常，通过在适当的溶剂中将端基官能化或活化的间隔基偶联到肽基树脂上，并且在约0℃到约90℃的温度范围内振荡直到Kaiser试验呈“阴性”为止而进行连接反应。在反应已经完成后，用洗涤溶液去除过量的试剂和副产品，然后将肽基树脂与脂质偶联。

在本发明的一个优选实施方案中，端基官能化的间隔基是官能化的聚乙二醇(PEG)。各种端基官能化或活化的PEG的制备综述可见于本领域的文献Zalipsky S.，Bioconjug.Chem.，6，150-165(1995)。

PEG与肽基树脂的缀合需要在PEG的末端和肽的N-端有适当的官能团。当胺(-肽-NH-PEG)是连接官能团时，可以使用端基被卤素(如-Cl、-Br和-I)或磺酸酯(如-OSO₂C₆H₄CH₃，-OSO₂CH₂CF₃)官能化的PEG来偶联肽基树脂N-端的氨基。当尿烷(-肽-NHC(O)O-PEG)是连接官能团时，可以使用端基被活性碳酸酯(如-C(O)-Im、-OC(O)-pNP、-OC(O)-NHS、-OC(O)-TCP)官能化的PEG来偶联肽基树脂N-端的氨基。当酰胺(-肽-NHC(O)-PEG)是连接官能团时，可以使用端基被活化的羧基(如DCC/HOBt、DCC/二甲氨基吡啶(DMAP)、DIPCDI/HOBt和EDC/NHS活化的羧基)官能化的PEG来偶联肽基树脂N-端的氨基。当硫代酯(-肽-C(O)CH₂SC(O)-PEG)是连接官能团时，可以使用端基被硫代酸官能化的PEG(-PEG-C(O)S)来偶联肽基树脂N-端，其中肽基树脂的N-端被修饰成溴乙酰基(树脂-肽-C(O)CH₂Br)。当硫醚(-肽-C(O)CH₂SCH₂-PEG)是连接官能团时，可以使用端基被巯基官能化的PEG(-PEG-CH₂SH)来偶联肽基树脂N-端，其中肽基树脂的N-端被修饰成溴乙酰基(树脂-肽-C(O)CH₂Br)。当马来酰亚胺基/硫代缀合物的硫醚是连接官能团时，可以使用端基被巯基官能化的PEG(C(O)-PEG-C(O)CH₂CH₂SH)来偶联肽基树脂N-端，其中肽基树脂的N-端被修饰成马来酰亚胺基(马来酰亚胺基-CH₂CH₂C(O)-肽-树脂)。

偶联反应的适当溶剂可以选自基本上由下列溶剂组成的组：DCM、氯仿、DMF、四氢呋喃(THF)以及它们不同比例的混合物。

洗涤溶液可以选自基本上由下列溶剂和溶液组成的组：DCM、氯仿、甲醇(MeOH)、DMF、THF、CH₃CN、水、缓冲液以及它们不同比例的混合物。

在本发明的一个优选实施方案中，连接官能团是酰胺键，即缀合于肽基树脂N-端氨基的羧基官能化的PEG。在酰胺键偶联反应中，反应中羧基的活化剂选自基本上由肽键形成中使用的试剂组成的组，如DCC/HOBt、DIPCDI/HOBt或EDC/NHS。偶联反应的适当溶剂选自基本上由DCM、氯仿、DMF、THF以及它们不同比例的混合物组成的组。洗涤溶液选自基本上由DCM、氯仿、MeOH、DMF、THF、氰化氢、水、缓冲液以及它们不同比例的混合物组成的组。反应温度在约20℃到约90℃的范围内。羧基的优选的活化剂是DIPCDI/HOBt，而且溶剂选自基本上由DCM、氯仿和DMF组成的组。优选的洗涤溶液选自基本上由氯仿、MeOH、水、DMF、缓冲液(pH3.0～11.0)以及它们不同比例的混合物组成的组。优选的反应温度在约20℃到约60℃的范围内。脂质与间隔基-肽基树脂的缀合

根据本发明，脂质通过上述连接官能团缀合于间隔基-肽基树脂。通常，通过在适当的溶剂中向端基官能化或活化的间隔基-肽基树脂中加入脂质，并且在约0℃到约90℃的温度范围内持续振荡约24小时而进行偶联反应。反应完成后，过量的试剂和副产品用洗涤溶液去除。

在本发明的一个实施方案中，间隔基-肽基-树脂中的间隔基是PEG。PEG的端基官能化在上述相关文献Zalipsky S.，Bioconjug.Chem.，6，150-165页(1995)中陈述。

脂质与间隔基-肽基-树脂的缀合需要适当的PEG端基官能团和脂质首基。当胺(脂质-NH-PEG-)是连接官能团时，可以使用端基被卤素(如-Cl、-Br和-I)或磺酸酯(如-OSO₂C₆H₄CH₃，-OSO₂CH₂CF₃)官能化的PEG来偶联脂质首基中的氨基。当尿烷(脂质-NHC(O)O-PEG-)是连接官能团时，可以使用端基被活性碳酸酯(如-C(O)-Im、-OC(O)-pNP、-OC(O)-Su、-OC(O)-TCP)官能化的PEG来偶联脂质首基中的氨基。当酰胺(脂质-NHC(O)-PEG-)是连接官能团时，可以使用端基被活化的羧基(如被DCC/HOBt、DCC/DMAP、DIPCDI/HOBt和EDC/NHS活化的羧基)官能化的PEG来偶联脂质首基中的氨基。当硫代酯(脂质-C(O)CH₂SC(O)-PEG-)是连接官能团时，可以使用端基被硫代酸(-间隔基-C(O)S)官能化的PEG来偶联脂质，其中脂质的首基被修饰成溴乙酰基(脂质-C(O)CH₂Br)。当硫醚(脂质-C(O)CH₂SCH₂-PEG-)是连接官能团时，可以使用端基被巯基(-间隔基-CH₂SH)官能化的PEG来偶联脂质，其中脂质的首基被修饰成溴乙酰基(脂质-C(O)CH₂Br)。当马来酰亚胺基/硫代缀合物的硫醚是连接官能团时，可以使用端基被巯基官能化的PEG(-PEG-CH₂SH)来偶联脂质，其中脂质的首基连接于马来酰亚胺基(马来酰亚胺基-CH₂CH₂C(O)-脂质)。

在本发明的一个优选实施方案中，脂质与PEG-肽基树脂的缀合通过酰胺键形成，其中PEG-肽基树脂终端的羧基连接于脂质首基中的氨基。一般而言，通过加入活化剂以活化羧基-PEG-肽基树脂的末端羧基而引发偶联反应。然后，在含有碱的适当溶剂中向活化的羧基-PEG-肽基树脂中加入脂质，接着在约0℃到约90℃的温度范围内在氮气氛下振荡混合物。反应完成后，过量的试剂和副产品用洗涤溶液去除。

反应中羧基的活化试剂可以选自基本上由肽键形成中使用的试剂组成的组，如DCC/HOBt、DIPCDI/HOBt或EDC/HOSu。偶联反应的适当溶剂可以选自基本上由DCM、氯仿、DMF、THF以及它们不同比例的混合物组成的组。洗涤溶液可以选自基本上由DCM、氯仿、MeOH、DMF、THF、CH₃CN、水、缓冲液以及它们不同比例的混合物组成的组。反应温度在约到20℃到约90℃的温度范围内。反应中羧基的优选的活化试剂是EDC/NHS。偶联反应中优选的碱是三乙胺(TEA)。偶联反应中优选的溶剂是氯仿和DMF的混合物。优选的反应温度在约45℃到约85℃的温度范围内。将间隔基-脂质缀合于肽基树脂

根据本发明，脂质-间隔基-肽基树脂可以通过包括下列步骤的方法合成：(1)制备端基官能化的间隔基-脂质缀合物；和(2)将缀合物和肽基树脂偶联。端基官能化的间隔基-脂质缀合物可以通过将端基官能化的间隔基缀合于脂质来合成。在本发明的一个实施方案中，端基官能化的间隔基是官能化的PEG。各种端基官能化或活化的PEG的制备综述可见于本领域的文献Zalipsky S.，Bioconjug.Chem.，6，150-165(1995)。端基官能化的PEG-脂质缀合物的合成实例在下列文献中有描述：Blume等，Biochim.Biophys.Acta，1149，180-184(1993)和Zalipsky S.Bioconjugate Chem.，4，269-299(1993)。

根据本发明，端基官能化的PEG-脂质缀合物可以根据上述方法与肽基树脂偶联。C.从树脂上裂解肽-间隔基-脂质

根据本发明，通过振摇脂质-间隔基-肽基树脂和裂解试剂来实现肽-间隔基-脂质从树脂上裂解。一般而言，本发明中使用的裂解试剂和程序与SPPS领域中使用的处理相同。

当使用王氏树脂、2-氯三苯甲基氯树脂和Merrified树脂来合成C-端带有羧基的肽-间隔基-脂质缀合物时，脂质-间隔基-肽基树脂可以通过裂解试剂(至少一种酸、清除剂和溶剂的混合物)来裂解。

酸可以选自基本上由TFA、氟化氢(HF)和三氟甲磺酸(TFMSA)组成的组。清除剂可以选自基本上由下列试剂组成的组：茴香硫醚、茴香醚、乙烷二硫醇(EDT)、二甲硫(DMS)、乙基甲基硫醚、三氟乙醇(TFE)、4-甲巯基苯酚、苄基硫醇、三乙基甲硅烷和水。用于裂解肽-间隔基-脂质的适当溶剂包括，但不限于，DCM、氯仿、DMF、THF以及它们不同比例的混合物。将脂质-间隔基-肽从树脂上裂解需要强酸，如在Boc化学中为HF或者TFMSA，以及在Fmoc化学中为TFA。DCM和DMF是用于裂解的主要溶剂。

当使用羟甲基树脂或王氏树脂来合成肽-间隔基-脂质缀合物的低级烷基酰胺C-端时，将肽-间隔基-脂质缀合物从树脂上裂解可以优选地在烷基胺、氯化铝和DCM的混合物下进行。裂解程序在本领域中是公知的，如C.R.McArthur等，(1982)，Can.J.Chem.，60，1836，该文献引入本文作参考。当使用羟甲基树脂或王氏树脂来合成肽-间隔基-脂质缀合物的低级烷基化的羧基C-端时，将肽-间隔基-脂质缀合物从树脂上裂解可以优选地在烷基醇、TEA、氰化钾和苯的混合物下进行。裂解程序在本领域中是公知的，如Moon等，(1994)，Tetrahedron Lett.，35，8915，该文献引入本文作参考。当使用Rink酰胺树脂来合成肽-间隔基-脂质缀合物的酰胺化羧基C-端时，将肽-间隔基-脂质缀合物从树脂上裂解可以优选地在TFA、清除剂和DCM的混合物下进行。当使用MBHA树脂来合成肽-间隔基-脂质缀合物的酰胺化羧基C-端时，将肽-间隔基-脂质缀合物从树脂上裂解可以优选地在HF和清除剂的混合物下进行。当使用肟树脂来合成肽-间隔基-脂质缀合物的烷基酰胺C-端时，使用的裂解试剂优选是RNH₂。当使用肟树脂来合成肽-间隔基-脂质缀合物的烷基酯C-端时，使用的裂解试剂优选是烷基醇和TFE。D.侧链保护基的脱除

一般而言，本发明中的侧链保护基通过SPPS领域中使用的相同方法脱除。大多数侧链保护基，如氨基酸的t-Bu、Boc、Mts、Mmt、Pbf、Pmc、Tos、Trt可以在将肽-间隔基-脂质从树脂上裂解期间由TFA或HF脱除。其它的侧链保护基可以由适当的脱保护试剂选择性地脱除。优选的脱除Acm的脱保护试剂包括，但不限于，Hg(II)、Ag(I)、Tl(III)和I₂。优选的脱除Bzl、Z、2-溴苄氧羰基(2-Br-Z)、2-氯苄氧羰基(2-Cl-Z)的脱保护试剂是活性炭负载的钯催化剂(Pd-C)/氢气。优选的脱除叔丁巯基的脱保护试剂包括硫(thio)和三丁基膦。优选的脱除Fmoc的脱保护试剂是哌啶。E.缀合物肽部分的修饰

根据本发明，肽-间隔基-脂质缀合物的肽部分可以根据本领域公知的方法通过在肽中的两个氨基酸或它们的衍生物间形成分子连接从而被修饰成环状形式。分子内连接的实例包括，但不限于，二硫化物、酰胺、酯、硫醚、硫代乙酸酯和硫代乙酰胺，如下所示：其中x和y代表1到3的整数；X代表Cl或者Br，而且Y代表NH或O。

通过使用氧化剂，如I₂、Tl(III)和空气来特定地氧化肽中的巯基可以形成分子内二硫键。酰胺和酯键可以通过使用羧基活化剂，如DCC/HOBt与肽中的氨基形成酰胺键，或者与肽中的羟基形成酯键而制备。硫醚键和α取代的乙酸连接可以通过用硫基取代氯或溴基而生成。见Englebretsen，D.R.等，Tetrahedron Lett.，1995，36，8871-8874；Barker等，J.Med.Chem.，1992，35，2040-2048；以及Or等，J.Org.Chem.，1991，56，3146-3149的实例，各文献均引入本文作参考。F.肽-间隔基-脂质缀合物的纯化

根据本发明，肽-间隔基-脂质缀合物的纯化方法包括，但不限于，柱色谱法、膜渗析法以及它们的组合。

在本发明的一个实施方案中，肽-间隔基-脂质缀合物可以通过使用凝胶过滤介质的柱色谱法纯化。凝胶过滤介质包括，但不限于，交联葡萄糖G(Sephadex G)和LH系列、琼脂糖(Sepharose)系列，以及Sephacryl系列和Superose系列。

在本发明的另一个实施方案中，肽-间隔基-脂质缀合物还可以通过使用反相色谱柱的柱色谱法纯化。反相色谱包括，但不限于，C8和C18系列色谱。

在本发明的另一个实施方案中，肽-间隔基-脂质缀合物的聚集形式可以通过膜渗析从含有不需要的成分，如肽-间隔基、肽和其它游离小分子的混合物中分离出来。优选渗析膜具有分子量截留小于100000道尔顿的孔径。II.肽-间隔基-脂质缀合物

根据本发明，肽-间隔基-脂质缀合物由本发明的方法合成，而且由每端具有连接官能团的线性亲水聚合物链组成，这种聚合物在一端与肽配体共价缀合，在另一端与脂质共价缀合。可以将肽-间隔基-脂质缀合物引入脂质体中，其中缀合物的脂质插入脂质体的双层中，从而将缀合物固定在细胞膜中，其中缀合物的肽配体容易暴露于细胞膜的外面，并且容易选择性地结合于细胞或组织。A.肽配体

根据本发明，肽配体是一种由天然氨基酸组成的合成肽。在本发明的一个优选实施方案中，肽配体可以结合于受体。受体可以选自基本上由下列受体组成的组：促生长素抑制素受体、血管活性肠肽受体、整联蛋白受体、成纤维细胞生长因子受体、肝细胞生长因子受体、表皮生长因子受体、胰岛素样生长因子受体、神经生长因子受体、血管内皮生长因子受体、血小板衍生生长因子受体和转化生长因子受体。

在本发明的另一个实施方案中，肽配体可以选自基本上由激素、细胞因子、毒素、化学吸引素以及用于细胞粘附的细胞外基质的肽组成的组。

肽配体和肽-受体对的实例列于下面的表II中。表II配体-受体对和肽配体的实施例配体              受体            肽配体的实例SST              SSTR2，5     奥曲肽：F(d)-C-F-W(d)-K-T-C-T(ol)

                          BIM-23268：环C-F-F-W(d)-K-T-F-C-NH₂

                          BIM-23023：环F(d)-C-Y-W(d)-K-Abu-C-T-NH₂VIP              VIP/PACAP    VIP(1-12)：H-S-D-A-V-F-T-D-N-Y-T-R

                          EP 0 620 008：A-V-T-T-D-N-Y-T

                          Prepro-VIP(111-122)：S-S-E-G-E-S-P-O-F-P-E-E-L-E-KRGD              整联蛋白     纤连蛋白CS-1：E-I-L-D-V

                          纤连蛋白CS-3：G-R-G-E-S

                          层粘连蛋白(442-447)：L-G-T-I-P-GHGF              MET          HGF：G-H-KEGF              EGFR         EGF(20-31)：C-M-H-I-E-S-L-D-S-Y-T-C

             EGFR         USP5,969,099：C-R-F-L-V-Q-D-K-X-A-C(X＝aa)FGF              FGF1R        FGF1(1-11)：F-N-L-P-L-G-N-Y-K-K-P

             FGFR         FGF(119-126)：K-R-T-G-Q-Y-L

                          WO00/03245：C-S-A-L-F-V-G-A-P-F-H-V-P-D-C

                          USP5,789,382：R-K-L-A-V-Y-W-S-S-Y-K-R-S-RYIGF              IGFR         IGF1(30-41)：G-Y-G-S-S-S-R-R-A-P-Q-T

                          JP601009599：Y-F-D-K-P-T-G-Y-G-S-S-S-R-R-A-P-Q-TNGF              NGFR         Prepro-NGF(99-115)：P-E-A-H-W-T-K-L-Q-H-S-L-D-T-

                          A-L-R

                          WO97/15593：C-G-S-E-V-P-N-S-A-R-C-C-V-CVEGF             VEGFR        C-S-C-K-N-T-D-S-R-C-K-A-G-L-G-L-N-G-R-TPDGF             PDGFR        G-R-P-R-G-S-G-K-K-R-K-R-K-R-L-K-P-T

在本发明的另一个实施方案中，肽配体是激素。根据本发明，激素包括，但不限于，促生长素抑制素、血管活性肠肽(VIP)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)，以及血管内皮生长因子(VEGF)。

在本发明的另一个优选的实施方案中，肽配体是结合于整联蛋白或层粘连蛋白受体的细胞外基质的肽片段。这些肽的实例包括，但不限于，含有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自基本上由RGD、RGE、DGEA、EILDV、GPRP、KQAGDV和QKRLDGS组成的组。

在本发明的另一个优选实施方案中，肽配体是：EGF(20-31)

Cys-Met-His-Ile-Glu-Ser-Leu-Asp-Ser-Tyr-Thr-Cys；FGF I，酸性脑驱动(Acidic Brain drived)(1-11)

Phe-Asn-Leu-Pro-Leu-Gly-Asn-Tyr-Lys-Lys-Pro；层粘连蛋白结合抑制剂(Lamin B-1(442-447))

Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly；整联蛋白结合抑制剂(纤连蛋白CS-3)

Gly-Arg-Gly-Glu-Ser；纤连蛋白CS-1(1378-1382)

Glu-Ile-Leu-Asp-Val；FGF(119-126)

Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu；IGF I(30-41)

Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr；HGF

Gly-His-Lys；前神经生长因子原(99-15)

Pro-Glu-Ala-His-Trp-Thr-Lys-Leu-Gln-His-Ser-Leu-Asp-Thr-Ala-Leu-Arg；血小板衍生生长因子的拮抗剂(PDGF A-链194-211)

Gly-Arg-Pro-Arg-Glu-Ser-Gly-Lys-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-Leu-Lys-Pro-Thr；TGFα(34-43)

Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys；VIP(1-12)

His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg；VEGF(GST-外显子7(1-20))

Cys-Ser-Cys-Lys-Asn-Thr-Asp-Ser-Arg-Cys-Lys-Ala-Gly-Leu-Gly-Leu-Asn-Gly-Arg-Thr；内皮他丁(血管生成同源区)

Ser-Ala-Ala-Ser-Cys-His-His-Ala-Tyr-Ile-Val-Leu-Cys-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ser-Phe-Ser-Lys；奥曲肽(促生长素抑制素模拟物)

环(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol)。

根据本发明，肽配体可以是肽模拟物，该模拟物是包括下面一种或更多修饰的如上定义的肽配体的类似物：

(1)肽中的氨基酸被非天然氨基酸所取代；

(2)肽中的氨基酸被D型天然氨基酸所取代；

(3)肽的C-端羧基被修饰成酰胺、低级烷基酰胺、二(低级烷基)酰胺、低级酯衍生物、羟基或者低级烷氧基；以及

(4)肽被环化。氨基酸

根据本发明，氨基酸定义为含有至少一个羧酸基和一个氨基的有机化合物。优选的氨基酸包括D或L型的天然氨基酸和非天然氨基酸。

天然氨基酸包括20种α-氨基酸，其中氨基和羧基与同一个碳相连。含有非极性或疏水侧链的天然氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；含有酸性侧链的天然氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸；含有碱性侧链的天然氨基酸，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及含有不带电亲水性侧链的天然氨基酸，包括天门冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。

本发明的非天然氨基酸包括侧链修饰的氨基酸、非α-氨基酸和N-甲基氨基酸。

侧链修饰的氨基酸是α-氨基酸，其中每个氨基酸的侧链都是非天然的或是从天然氨基酸修饰来的。侧链修饰的氨基酸实例包括，但不限于，2-氨基丁酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸、α-氨基异丁酸、二苯丙氨酸、对苯甲酰苯丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、3-环己基丙氨酸、α-环己基甘氨酸、(S)-2，3-二氨基丙酸、(S)-2，3-二氨基丁酸、2-氨基-4-苯基丁酸、高丝氨酸、高酪氨酸、(S)-(-)-二氢吲哚-2-羧酸、β-2-萘基丙氨酸、3-(1-萘基)-丙氨酸、3-(2-萘基)-丙氨酸、八氢吲哚-2-羧酸、青霉胺、对氨基苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、2-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、3，4-二氯苯丙氨酸、3，4-二氟苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、5-羟基色氨酸、4-碘苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、五氟苯丙氨酸、2-哌啶酸、炔丙基甘氨酸、四氢噻唑-4-羧酸、1，2，3，4，-四氢异喹啉-3-羧酸、3，5-二碘酪氨酸、3-碘酪氨酸、3-硝基酪氨酸、o-磷酸酪氨酸、二乙基甘氨酸、二正丙基甘氨酸、二正丁基甘氨酸、1-氨基-1-环丙烷羧酸、1-氨基-1-环戊烷-1-羧酸、1-氨基-1-环己烷-1-羧酸和4-羟基脯氨酸。

非α-氨基酸是指那些氨基和羧基没有连接在同一个碳上的氨基酸。非α-氨基酸的实例包括，但不限于，2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、4-(氨甲基)苯甲酸、4-(氨甲基)环己烷、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸、10-氨基癸酸、11-氨基十一酸、12-氨基月桂酸、六氢异烟酸(isonipecotic acid)、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸和4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸。

N-烷基氨基酸是指其中α-氨基被单烷基化的氨基酸。烷基包括，但不限于，甲基、乙基和丙基。氨基醇

根据本发明，氨基醇是修饰的氨基酸，其中羧基被修饰成羟基。氨基醇可以被缀合于肽链的C-端。肽配体的环化

根据本发明，采用上述方法，通过在肽配体中的两个氨基酸或者它们的衍生物之间形成分子内连接，可以将肽配体环化。B.连接官能团

根据本发明，连接官能团是可以将脂质或肽配体共价连接于间隔基的任何官能团。适用于肽-间隔基-脂质缀合物中的多种官能团包括，但不限于，表I中所列的那些官能团。C.间隔基

根据本发明，间隔基是在链的每端均含有用于连接肽和脂质的连接官能团的线性亲水聚合物链。本发明中适当的间隔基包括，但不限于，聚甘氨酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚氧化烯(polyoxyalkene)和亲水性肽。

在本发明的一个优选实施方案中，间隔基是分子量在100～10000道尔顿之间的聚乙二醇，更优选在100-5000道尔顿之间。D.脂质

根据本发明，脂质是在同一个分子中拥有亲水和疏水部分的天然或合成的两亲性分子，它们在水中可以自发地形成双层囊泡，或者能够牢固地引入脂质双层。

在本发明的一个实施方案中，脂质是包括磷酸甘油二酯和鞘脂的磷脂。磷酸甘油二酯结构是三碳甘油通过酯或醚键在1和2位连接于两个烃链，并且在3位具有磷酰基首基。鞘脂由通过酰胺键连接到鞘氨醇的氮上的烃链组成，烃链连接于磷酰基首基。磷脂的磷酰基首基可以是磷酰胆碱、磷酰胆胺、磷酰丝氨酸、磷酰甘油、磷酰肌醇和磷酸。磷脂中的烃链通常具有14-22个碳原子的链长，并且可以是饱和的或者有一些不饱和度。

在本发明的另一个优选实施方案中，脂质是二硬脂酰磷脂酰胆胺(DSPE)。

可以牢固地引入脂质双层中的脂质包括，但不限于，硬脂酰胺、十二胺、十六胺、乙酰棕榈酸酯、甘油蓖麻醇酸酯、十六烷基肉豆蔻酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、两性丙烯酸聚合物、脂肪酰胺、胆固醇、胆固醇酯、二酰甘油丁二酸酯、二酰甘油、脂肪酸等。

在本发明的另一个实施方案中，脂质是由连接到中性亲脂部分，如甾醇、烃链或两个烃链上的带正电的首基，如胺、聚胺或聚赖氨酸组成的阳离子脂质。阳离子脂质的实例包括1，2-二油基氧-3-(三甲基氨基)丙烷(DOPAT)、溴化N-[1-(2，3-二-十四烷基氧)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基铵(DMRIE)、溴化N-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基铵(DORIE)、氯化N-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTMA)、3β[N-(N′，N′-二甲氨基乙烷)氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)、3β[N-(N′，N′-二甲氨基乙烷)氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)和溴化二甲铵(DDAB)。III.靶向治疗脂质体

本发明进一步提供包含由本发明的方法合成的肽-间隔基-脂质缀合物的靶向治疗脂质体。

本发明中的靶向治疗脂质体包含(i)一种或多种形成脂质体膜的脂质；(ii)一种或多种作为靶部分引入脂质体膜中的肽-间隔基-脂质缀合物；(iii)引入脂质体的治疗或诊断试剂；以及(iv)任选地，引入脂质体以修饰其表面的亲水聚合物-脂质缀合物。A.靶向治疗脂质体的成分脂质

用于制备脂质体的适当脂质可以是一种或多种选自基本上由上面所定义的脂质组成的组的脂质。

在本发明的一个实施方案中，脂质体中使用的脂质包括磷脂和胆固醇。优选的磷脂可以选自基本上由氢化大豆卵磷脂(HSPC)、蛋卵磷脂(EPC)和二硬脂酰卵磷脂(DSPC)组成的组。

在本发明的另一个实施方案中，脂质体中使用的脂质包括脂质和中性脂质，如DOPE或胆固醇。亲水聚合物-脂质缀合物

本发明中的脂质体表面可以通过将聚合物-脂质缀合物结合入脂质体双层中而被亲水聚合物所修饰。本发明中的聚合物-脂质缀合物是具有重复单元以及与脂质首基相连的连接官能团的线性亲水聚合物链。这些亲水聚合物包括，但不限于，聚甘氨酸、聚乙二醇、聚丙二醇、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚氧化烯和亲水性肽。

在本发明的一个优选实施方案中，聚合物-脂质缀合物中的聚合物是平均分子量在100-10000道尔顿之间的PEG，更优选在100-5000道尔顿之间。单甲氧基或单乙氧基PEG衍生物也是用于脂质缀合物的优选聚合物。肽-间隔基-脂质缀合物

根据本发明，用于引入脂质体的适当的肽-间隔基-脂质缀合物是一种或多种由上述方法合成的肽-间隔基-脂质缀合物。治疗剂

医疗应用中使用的适于引入脂质体中的各种治疗剂在本领域中是公知的。但是，根据本发明，适当的治疗剂包括，但不限于，天然和合成的具有以下治疗作用的化合物：抗肿瘤、抗血管生成、抗菌、抗病毒、抗寄生物、抗真菌、免疫增强、免疫抑制、抗偏头痛、解热、抗血清、抗炎、抗凝血、抗代谢、抗利尿、抗癫痫、抗有丝裂解、抗关节炎、抗心律失常、抗老化、止痛、麻醉、止血、激素、激素抑制、减轻血钙过多、减轻血钙过少、减轻血糖过多、减轻血糖过低、肌松、神经传递、治疗精神病、治疗心血管病、溶解血栓，以及血管扩张。

根据本发明，用于包埋在脂质体中的适当的治疗剂包括，但不限于，拓扑异构酶I和II抑制剂、血管生成抑制剂、DNA转录酶抑制剂、喜树碱和类似物、抗生素、抗寄生虫药、抗肿瘤药、抗炎药、抗代谢药、抗有丝裂解药、能与DNA反应或结合的抗肿瘤药、免疫修饰剂、寡核苷酸和多核苷酸、化学辐射敏化剂和保护剂，以及光化学活性抗癌药。

在本发明的一个优选实施方案中，引入的治疗剂是拓扑异构酶I抑制剂，包括但不限于本领域中公知的喜树碱和类似物，如文献FoyeW.O.Cancer Chemotherapeutic Agents(癌症化疗药)，AmericanChemical Society，Washington，DC，(1995))所描述。

在本发明另一个优选的实施方案中，引入的治疗剂是抑制拓扑异构酶II的蒽环霉素(anthracycline)。这种药物的实例是阿霉素、柔红霉素、表阿霉素和伊达比星。

在本发明的另一个优选实施方案中，引入的治疗剂是抗有丝裂解剂，如长春花碱、navelbine、长春新碱、长春甘酯、长春曲醇和长春利定。

在本发明的另一个实施方案中，引入的治疗剂是抗炎药。

在另一个实施方案中，引入的治疗剂是血管生成抑制剂，如糊精2-硫酸盐、ukrain、沙利度胺、血管他丁、内皮他丁和1-[11-(十二烷氨基)-10-羟基十一烷基]-3，7-二甲基-黄嘌呤。

在本发明的另一个实施方案中，引入的治疗剂包括核酸基因，它包括但不限于基因、基因的部分、寡核苷酸、RNA以及它们的类似物。用作治疗剂的适当基因包括，但不限于，(1)可以通过突变补偿基因缺陷功能的肿瘤抑制基因，如p53、BR1、APC、Rb、DCC、HNPCC、NF-1、NF-2、BRCA1或BRCA2；(2)在宿主细胞中可以把无活性的前药转变为细胞毒化合物的毒素基因，如HSV-tk；(3)能将免疫系统的细胞成分修饰成肿瘤，或者修饰肿瘤细胞以诱导免疫反应的免疫基因，如IL-2、IL-4、IL-12或GM-CSF；(4)影响细胞对化疗药和放射治疗敏感性的用于化学敏化或放射敏化的基因，如肝细胞色素P450基因、CYP2B或tk基因；(5)调节细胞调亡过程的基因或蛋白编码基因，如TNF/TNFR1、Apo3L/DR3、Apo2L/DR4或5、细胞色素c、TP53、E1A、bax、bcl-xs、apoptin、bcl-2、存活的(surving)、XIAP、IAP-1或IAP-2；以及(6)与耐药性相关的基因，如MDR1。

寡核苷酸包括，但不限于，反义寡核苷酸，它可以与mRNA或DNA结合，从而调节基因的翻译或转录。反义寡核苷酸的靶基因包括，但不限于，肿瘤抑制基因的突变体(如p53、BR1、E1A和BRCAl)、致癌基因(如k-ras、c-myc和c-fos)、生长因子基因(如IGF 1、PDGF、酸性和碱性FGF，以及TGFβ)、编码与多药耐药性相关的蛋白的基因(如MDR1)。诊断剂

本发明中使用的诊断剂包括，但不限于，用于γ闪烁照相法造影剂的γ放射放射性核苷酸、用于计算断层X射线照相法的不透射线材料和用于磁共振的顺磁性金属离子。

在本发明的一个优选实施方案中，γ-放射放射性核素是⁶⁷Ga、¹¹¹In和⁹⁹mTc。

在本发明的一个优选实施方案中，顺磁性金属离子是Gd。B.脂质体

根据本发明，适于制备靶向治疗脂质体的脂质体是球形颗粒，它们由通过一种或多种脂质以及一种或多种包封在其中的含水区室形成的双层膜组成。

根据本发明，脂质体大小范围在约30nm到约1000nm的范围内，这取决于靶器官或组织以及待转运的治疗剂。举例来说，对于血流转运治疗剂，优选的脂质体大小在约50nm到约150nm的范围内；而对于直接向组织或肿瘤部位施用的治疗剂，优选的脂质体大小在约30nm到约80nm的范围内。

在本发明的一个优选实施方案中，脂质体由(1)从大豆或蛋中提取的天然磷脂，(2)胆固醇，(3)聚合物-脂质缀合物组成。

在本发明的另一个优选实施方案中，脂质体是包括阳离子脂质和一种或多种中性脂质，如DOPE和胆固醇的阳离子脂质体。C.靶向治疗脂质体的制备

根据本发明，通过将由本发明的方法合成的肽-间隔基-脂质缀合物合引入含脂质体的治疗剂中，可以制备靶向治疗脂质体。

本发明的脂质体可以通过本领域中公知的许多方法制备，例如Gregoriadis，G.，ed.Liposome Technology(脂质体技术)，第I、II、III卷，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1984；Szoka，F.等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9，476(1980)；和New，R.R.C.，Liposomes，a Pratical Approach，Oxford IRL Press，New York，1990，这些文献引入本文作参考。

在本发明的一个实施方案中，如下制备脂质体：水化脂质膜从而产生初始多层囊泡，使初始多层囊泡经历挤出或匀化方法来降低囊泡的大小。通常，蒸发在有机溶剂中的带有或不带有亲水聚合物-脂质缀合物的脂质(或脂质组合)并在真空中干燥，从而在管中形成膜。通过涡流在水溶液中水化脂质膜，从而形成初始多层囊泡。然后，含水囊泡被冷冻并融化几次循环。悬浮的多层囊泡通过如下文献中描述的膜挤出或匀化方法来降低尺寸：Hope等，Biochim.Biophys.Acta.，812，55-65(1985)；Mayhew等，Biochim.Biophys.Acta.，775，169-174(1984)，和Brandl等，in Gregoriadis，G.，ed.LiposomeTechnology，第2版，第I卷，CRC Press，Boca Raton，Fla.，1992，第49-65页，这些文献引入本文作参考。

向脂质体中装载治疗剂或诊断剂包括装载水溶的、疏水的和离子性的化合物。水溶性化合物通常通过在水溶液中溶解药剂或与脂质膜混合而包封入脂质体中。疏水剂可以通过用脂质或脂质组合在适当有机溶剂中溶解药剂并蒸发溶剂产生膜而包埋在脂质体中或者引入脂质双层中。装载离子性药剂的方法可以通过文献中报道的pH、离子梯度方法来进行，如Mayer等，Biochemistry，27，2053-2060，(1988)，和Haran，G.等，Biochim.Biophys.Acta.，1151，201-215，(1993)中所述，这些文献引入本文作参考。

DNA可以通过几种方法引入脂质体中，这些方法包括，但不限于，(1)将DNA包埋入脂质体中；(2)形成脂质复合物(lipoplex)(DNA-脂质体复合物)；(3)形成脂质多元复合物(lipopolyplex)(脂质体、聚阳离子聚合物和DNA的复合物)，这些引入DNA的脂质体的制备方法在本领域中是公知的，例如Hug P和Sleight R.G.，Biochim.Biophys.Acta.，1097，1-17(1991)；Nabel，G.L等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90，11307-11311(1993)；Gao，X.和Huang L.，Biochemistry，35，1027-1036(1996)；以及Whitmore等，Gene Ther.，6，1867-1875(1999)，这些文献引入本文作参考。

根据本发明，将肽-间隔基-脂质缀合物引入脂质体膜可以通过在高于脂质膜转变温度的温度下将肽-间隔基-脂质缀合物/甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰胆胺(mPEG-DSPE)胶束和含治疗剂的脂质体一起温育而实现。一般而言，将干燥的肽-间隔基-脂质缀合物/mPEG-DSPE的脂质膜在含水缓冲液中水化，其浓度高于缀合物的临界胶束浓度，并在升温下温和搅动混合物。在脂质膜融化，并且混合物变成清澈的胶束溶液之后，在高于脂质体膜转变温度的温度下将胶束溶液转移入含有治疗剂的脂质体中，持续一段时间，完成插入。然后，让溶液通过大小排阻柱从而分离胶束和靶向脂质体。为了进行定量分析，分别合并胶束部分和靶向脂质体部分。

根据本发明，脂质膜的转变温度影响靶向治疗脂质体的制备。本发明中适当的脂质体转变温度在约3℃到约70℃的范围内。

下面的实施例用于举例说明，但是它们并不限制本发明。实施例1：氨基醇的制备

Fmoc-Thr(tBu)-醇(Fmoc-Thr(tBu)-醇)的制备将Fmoc-Thr(tBu)-OH(1eq，0.663g，1.67mmol)悬浮在2ml乙二醇二甲基醚(DME)中，并且在氮气保护下于-15℃以下冷冻。加入N-甲基吗啉(1eq，0.19ml，1.67mmol)和氯甲酸异丁酯(1eq，0.22ml，1.67mmol)后，在-15℃搅拌混合物。搅拌5分钟后，除去沉淀，并且加入NaBH₄(3eq)的5ml水悬浮液，再搅拌1小时。反应结束后，加入40ml水。混合物用DCM(20ml×3)提取，并且用5％的NaHCO₃洗涤合并的有机层，接着用盐水(如NaCl)漂洗，并用无水Na₂SO₄(或MgSO₄)干燥。蒸发溶剂。粗产品Fmoc-Thr(tBu)-醇用DCM作洗脱剂采用硅胶柱色谱纯化。¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：1.16(3H，d，J＝6.2Hz，CHCH₃)，1.20(9H，s，tBu)，2.88(1H，宽峰，OH)，3.61(1H，宽峰，CHCH₂OH)，3.66(2H，宽峰，CHCH₂OH)，3.94(1H，m，CHCH₃)，4.22(1H，t，J＝6.8Hz，CHCH₂CO)，4.40(2H，m，CHCH₂CO)，5.28(1H，d，J＝7.5Hz，NH)，7.30(2H，d，J＝7.4Hz，芳环)，7.38(2H，t，J＝7.2Hz，芳环)，7.59(2H，d，J＝7.4Hz，芳环)，7.74(2H，d，J＝7.4Hz，芳环).实施例2：肽基树脂的制备

根据Merrified固相合成技术制备肽基树脂(参见Steward和Young，Solid Phase Peptide Synthesis(固相肽合成)，第2版，PierceChemical Company，Rockford，(1984)和Merrified，J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154(1963))。本发明中使用Fmoc合成技术中的王氏树脂、2-氯三苯甲基氯树脂和Rink酰胺树脂。王氏树脂被用于合成C-端具有羧酸部分的肽基部分。2-氯三苯甲基氯树脂用于合成C-端具有Pro、Cys或氨基醇的肽基部分。Rink酰胺树脂被用于合成C-端具有酰胺的肽基部分。这些树脂在SPPS中的应用在本领域中已有描述，例如，对于王氏树脂有S.-S.Wang，J.Am.Chem.Soc.，95，1328(1973)和G.Lu，等J.Org.Chem.，46，3433(1981)；对于2-氯三苯甲基氯树脂有K.Barlos，等，Int.J.Peptide Protein Res.，37，513(1991)和K.Barlos，等，Int.J.Peptide Protein Res.，38，562(1991)；对于Rink树脂有H.Rink，Tetrahedron Lett.，28，3787(1987)和M.S.Bematowicz，等，Tetrahedron Lett.，30，4645(1989)。

用于肽链形成的氨基被Fmoc基团保护。用叔丁基作为酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的侧链保护基；用Trt作为天冬酰胺和组氨酸的侧链保护基；用Boc作为赖氨酸和色氨酸的侧链保护基；用Pbf作为精氨酸的侧链保护基；用Acm作为半胱氨酸的侧链保护基。

一般来说，肽根据由下面(1)和(2)组成的循环来组装：(1)用20％哌啶-DMF脱除Fmoc保护基，30分钟；(2)在DMF中用DIPCDI(2eq)和HOBt(2eq)偶联Fmoc氨基酸衍生物，2小时。当树脂对Kaiser试验(Kaiser等，1970)呈阳性时，重复偶联反应。在预期的肽得以组装后，少量肽基树脂用TFA、氯仿、茴香硫醚、EDT和茴香醚的裂解混合物裂解。裂解后的肽用HPLC纯化，并用MS鉴定。构建的肽如下所列：EGF

H-Cys(Acm)-Met-His-Ile-Glu-Ser-Leu-Asp-Ser-Thr-Cys(Acm)-OH

MS预期：1543.7，MS实测：1543.8；FGF I

H-Phe-Asn-Leu-Pro-Leu-Gly-Asn-Tyr-Lys-Lys-Pro-OH

MS预期：1289.7，MS实测：1290.4；层粘连蛋白结合抑制剂

H-Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly-OH

MS预期：556.3，MS实测：557；整联蛋白结合抑制剂

H-Gly-Arg-Gly-Glu-Ser-OH

MS预期：504.2，MS实测：505；纤连蛋白CS-1片段

H-Glu-Ile-Leu-Asp-Val-OH

MS预期：587.6，MS实测：587.6；FGF(119-126)

H-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-OH

MS预期：993.2，MS实测：993.3；IGF I(30-41)

H-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr-OH

MS预期：1266.4，MS实测：1267；HGF

H-Gly-His-Lys-OH

MS预期：340.3，MS实测：340.1；前神经生长因子原(99-15)

H-Pro-Glu-Ala-His-Trp-Thr-Lys-Leu-Gln-His-Ser-Leu-Asp-Thr-Ala-Leu-Arg-OH

MS预期：2003.2，MS结果：2003.0；促生长素抑制素类似物(奥曲肽)

环状H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol)

MS预期：1019.2，MS实测：1019.4；and促生长素抑制素模拟物

环状H-(D)Phe-Cys-Phe-Gly-Lys-Thr-Cys-Thr(ol)

MS预期：890，MS实测：890.实施例3：端基官能化的PEG衍生物的合成羧基PEG及其活性酯

羧基PEG.将PEG2000(8.6g)和叔丁氧钾(20g)溶解在300ml叔丁醇中，并加热到40℃。在20分钟的时间内加入溴乙酸己酯(10ml)。然后，将混合物搅拌2小时，并蒸发除去溶剂。将残余物在200ml 1 N的NaOH中水解，并在室温下搅拌2小时。水解结束后，调节混合物的pH值到2，并用CHCl₃(2×200ml)提取。所得合并的提取液用水洗涤，并用无水MgSO₄干燥，蒸发浓缩并在真空中干燥。得到白色粉未状的羧基-PEG，收率为6.88g。¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：3.66(s，O-CH₂CH₂-O)，4.13(s，HO-C(O)-CH₂-O)。

PEG-氧苯并三唑在4ml DMF中混合HOBt(2.6mmol)、DIPCDI(1.91mmol)和羧基-PEG₃₀₀₀(0.87mmol)，并于室温下在氮气氛中搅拌20分钟。混合物不经进一步纯化PEG-氧苯并三唑而用于同肽基树脂缀合。

用二环己基碳二亚胺(DCC)活化羧基-PEG在4ml DMF中混合DMAP(1.91mmol)、DCC(1.91mmol)和羧基-PEG₃₀₀₀(0.87mmol)，并于室温下在氮气氛中搅拌20分钟。混合物不经进一步纯化羧基-PEG而用于与肽基树脂缀合。

羧基-PEG的丁二酰亚胺酯(Su-OC(O)-PEG)秘羧基-PEG₂₀₀₀(0.87mmol)的4ml DMF混合物中加入HNS(2.6mmol)和EDC(2.6mmol)，并于室温下在氮气氛中搅拌过夜。反应结束后，蒸发混合物除去溶剂。将残余物加入10ml水中，并用20ml DCM提取三次。合并的提取液用饱和盐水(如NaCl)洗涤，再用无水MgSO₄干燥，然后浓缩并真空干燥。粗产品用醚沉淀并进一步从异丙醇/醚中纯化，收率为45％。¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)；2.87(s，O-N(C(O)CH₂)₂)，3.66(s，O-CH₂CH₂-O)，4.53(s，-CH₂O-C(O)-OSu)。

PEG的碳酸对硝基苯酯(pNP-O-C(O)-PEG)向PEG₂₀₀₀(10g)和TEA(1.31ml)的40ml DCM混合物中加入氯甲酸对硝基苯酯(2.22g)，并于室温下在氮气氛中搅拌过夜。搅拌结束后，过滤混合物除去TEA的盐酸盐并蒸发除去溶剂。粗产品用异丙醚沉淀并从乙酸乙酯和乙醚中结晶两次。¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)；3.66(s，O-CH₂CH₂-O)，3.80(4H，s，O-CH₂CH₂-OC(O)OC₆H₄NO₂)，4.44(4H，s，O-CH₂CH₂-OC(O)OC₆H₄-NO₂)，7.38 & 8.28(8H，dd，-OC(O)OC₆H₄NO₂)。

Tos-PEG(CH₃C₆H₄S(O₂)O-PEG)向PEG₂₀₀₀(10g)和吡啶(1.21ml)的15mlDCM混合物中加入对甲苯磺酰氯(2.29g)，并于室温下在氮气氛中搅拌过夜。反应结束后，蒸发混合物除去溶剂。白色粗产品在冰浴中用1∶1.3的异丙醇/异丙醚混合溶剂沉淀。用体积比1∶1的乙酸乙酯/乙醚结晶两次。¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：2.34(6H，s，-OSO₂C₆H₄CH₃)，3.66(s，O-CH₂CH₂-O)，4.15(4H，s，O-CH₂CH₂-OSO₂C₆H₄CH₃)，7.16 & 7.79(8H，dd，-OSO₂C₆H₄CH₃)。实施例4：间隔基-肽缀合物的制备

HOC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-DSPE的制备.向含有DSPE(0.449g，0.6mmol)、TEA(0.2ml，1.4mmol)和DMF(5ml)的混合物中加入Su-OC(O)-PEG₂₀₀₀(0.6mmol)。混合物在40℃到45℃的温度范围内搅拌4小时。产品用薄层色谱证实，展开剂为氯仿/甲醇/水(3∶1∶0.1v/v)。

Pnp-O-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-DSPE的制备.向含有DSPE(0.45g，0.6mmol)、TEA(0.6mmol)和氯仿(10ml)的混合物中加入pNP-O-C(O)-PEG₂₀₀₀(0.6mmol)。混合物在40℃到45℃的温度范围内搅拌约2小时。产品用薄层色谱证实，展开剂为氯仿/甲醇/水(3∶1∶0.1v/v)。实施例5：将间隔基缀合于肽基树脂

HOC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇－树脂的制备用5ml 20％哌啶的DMF溶液处理由2-氯三苯甲基氯树脂从固相肽合成中获得的H-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂(0.13mmol)，从而从肽基树脂的N-端脱除Fmoc保护基。除去Fmoc之后，用DMF(5ml×3)洗涤树脂。将在5ml DMF中混合HOBt(0.8mmol)、DIPCDI(0.8mmol)和羧基-PEG₆₀₀(0.4mmol)所得的PEG-氧苯并三唑混合物加入到H-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂中。振荡，在室温下进行2小时的偶联反应。用Kaiser试验检测反应的完成程度。反应完成后，洗去过量的试剂和副产品。裂解少量HOC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂，并用NMR和MS谱鉴定。¹HNMR(CD₃OD)在δ3.5ppm处显示乙二醇峰和肽质子峰。质谱中，观测到源于不同分子量PEG的钟形分子量分布。测量的HOC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-醇的中心分子量1763.5与计算分子量1763.6相匹配。

HOC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂的制备.除了用羧基-PEG₂₀₀₀代替羧基-PEG₆₀₀之外，反应条件和程序如上所述进行。

HOC(O)-PEG₃₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂的制备.除了用羧基-PEG₃₀₀₀代替羧基-PEG₆₀₀之外，反应条件和程序如上所述进行。

pNP-OC(O)-PEG₂₀₀₀-OC(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂的制备.用5ml 20％哌啶的DMF溶液处理从固相肽合成中获得的H-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂(0.13mmol)，从而从肽基树脂的N-端脱除Fmoc保护基。脱除Fmoc之后，用DMF(5ml×3)洗涤树脂。再将pNP-O-C(O)-PEG₂₀₀₀(0.39mmol)和TEA(1.15mmol)的5mlDMF混合物加入到H-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂中。在室温下进行偶联反应过夜。用Kaiser试验检测反应的完成程度。反应完成后，洗去过量的试剂和副产品。将少量组装的HO-PEG₂₀₀₀-OC(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-醇缀合物从树脂上裂解，并用¹H NMR谱鉴定。¹H NMR(CD₃OD)谱在δ3.5ppm处显示乙二醇峰和肽质子峰。实施例6：将脂质缀合于间隔基-肽基树脂

DSPE-NHC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂的制备.向HOC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂(0.13mmol)的2mlDMF溶液中加入NHS(0.4mmol)和EDC(0.4mmol)，然后将混合物在室温下振摇4小时。随后，加入DSPE(0.26mmol)与活化的HOC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂(0.13mmol)在混合溶剂(4ml氯仿和0.5ml TEA)中于55℃下偶联过夜。反应后，树脂用氯仿、DMF和MeOH洗涤，并经历裂解。实施例7：间隔基-脂质与肽基树脂的缀合

DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂的制备.向HOC(O)-PEG₂₀₀₀-DSPE(0.4mmol)的DMF溶液(5ml)中加入DIPCDI(0.8mmol)和HOBT(0.8mmol)。将溶液在室温下搅拌30分钟，然后加入肽基树脂中。在近室温下，偶联反应在振摇下进行约2小时。用Kaiser试验检验反应完成的程度，反应完成后，洗去过量的试剂并裂解树脂。实施例8：脂质-间隔基-肽基树脂的裂解

用裂解混合物(50％TFA、45％CHCl₃、3.75％茴香醚和1.25％EDT)裂解DSPE-NHC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂。将裂解的混合物再在室温下振摇10分钟，从而完全脱除保护基。在冰浴中冷却混合物，然后加入冷乙醚以沉淀产品。旋转沉淀物并用冷乙醚洗涤三次。粗产品用C8硅胶柱采用液相色谱纯化，用甲醇的水溶液(0到85％v/v)梯度洗脱，得到白色固体粉未(每克树脂200mg)。用¹H NMR和MS鉴定DSPE-NHC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-醇。¹H-NMR(MeOH)δ(ppm)：0.90(6H，t，CH₃-(CH₂)_n-)，1.29(56H，br.s，-(CH₂)_n-)，1.97(6H，s，-NHC(O)-CH₃)，1.59(4H，m，CH₂-CH₂CH₂-C(O)O-)，2.33(4H，t，-CH₂CH₂-C(O)O-)，3.63(268H，s，-O-(CH₂CH₂)_n-O-)，5.23(1H，s，sn2甘油质子)，6.85-8.50(15H，苯基和吲哚的芳环质子)。质谱测量的中心分子量2451与计算分子量2450相符。实施例9：脂质-间隔基-肽缀合物的二硫化物环化

用含10当量I₂的甲醇(1ml甲基中含40μl 20％的I₂)溶解DSPE-NHC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-醇，浓度低于1.0mg/ml，并且在室温下振摇混合物1小时。将溶液转移入渗析管，如Spectra/Por^TM渗析管(MWCO2000)，在4℃下用水进行渗析(3×1000ml，每次8-16小时)。然后将溶液冷冻干燥，得到白色蓬松固体。质谱测得的环化DSPE-NHC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-醇(c-OPD₆₀₀)的中心分子量2351与计算分子量2351相符。¹H-NMR(MeOH)δ(ppm)：0.90(6H，t，CH₃-(CH₂)_n-)，1.29(56H，br.s，-(CH₂)_n-)，1.59(4H，m，CH₂-CH₂CH₂-C(O)O-)，2.31(4H，t，-CH₂CH₂-C(O)O-)，3.64(268H，s，-O-(CH₂CH₂)_n-O-)，5.22(1H，s，甘油sn2质子)，6.85-8.50(15H，苯基和吲哚的芳环质子)。实施例10：肽-PEG-DSPE缀合物的其它合成

环-DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-醇(c-OPD₂₀₀₀)的合成.通过与合成DSPE-NHC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-醇-树脂相似的程序合成DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-醇-树脂。简言之，根据实施例2中描述的程序制备肽基树脂。将HOC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)OH缀合于肽基树脂通过在45℃下搅拌HOBt(0.8mmol)、DIPCDI(0.8mmol)、羧基-PEG₂₀₀₀(0.4mmol)和肽基树脂(0.13mmol)的5ml DMF溶液过夜来进行。反应完成后，在55℃下用NHS(0.4mmol)和EDC(0.4mmol)的2ml DMF溶液来活化HOC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-醇-树脂(0.13mmol)。将脂质缀合于PEG-肽基树脂通过在混合溶剂(4ml氯仿和0.2mlTEA)中向活化的PEG-肽基树脂(0.13mmol)中加入DSPE，并且在60℃油浴中加热过夜来进行。将缀合物从树脂上裂解如实施例8中所述进行。将获得的混合物在体积比为1/1的甲醇/水溶剂中溶解，然后用Spectra/Por膜(MWCO：25000道尔顿)渗析，从而除去不想要的成分，如肽-间隔基、肽和其它游离小分子。使用实施例9中所述的方法形成二硫键，从而进一步环化DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-醇。环化的缀合物采用交联葡萄糖(Sephadex)LH-20柱色谱纯化，并用¹H-NMR(MeOH)确认获得的环-DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-醇的结构。δ(ppm)：0.90(6H，t，CH₃-(CH₂)_n-)，1.29(56H，br.s，-(CH₂)_n-)，1.59(4H，m，CH₂-CH₂CH₂-C(O)O-)，2.32(4H，t，-CH₂CH₂-C(O)O-)，3.60(180H，s，-O-(CH₂CH₂)_n-O-)，5.22(1H，s，甘油sn2质子)，6.85-8.50(15H，苯基和吲哚的芳环质子)。

环-DSPE-NHC(O)-PEG₃₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-醇-(c-OPD₃₀₀₀)的合成.除了所使用的羧基-PEG的平均分量为3000道尔顿外，通过与合成环-DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-醇相同的程序来合成环-DSPE-NHC(O)-PEG₃₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-醇。获得的环-DSPE-NHC(O)-PEG₃₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-醇的中心分子量约为4600，这与计算平均分量相符。

DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-醇的合成.如实施例2中所述，使用Fmoc化学中的2-氯三苯甲基氯树脂合成Gly-Arg(Pbf)-Gly-Asp(tBu)-Ser(tBu)-Gly-醇-树脂的肽基树脂。通过与制备DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-醇中描述的相同程序来进行随后的反应。获得的DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-醇的¹H-NMR(MeOH)谱显示如下：δ(ppm)：0.90(t，CH₃-(CH₂)_n-)，1.29(br.s，-(CH₂)_n-)，1.80(dd，Arg的γ碳上的H)，1.93(m，Arg的β碳上的H)，2.32(t，-CH₂CH₂-C(O)O-)，2.82(dd，Asp的β碳上的H)，2.92(dd，Asp的β碳上的H)，3.63(s，-O-(CH₂CH₂)_n-O-)，5.22(s，甘油sn2质子)；其它α碳和肽中残余的质子分布在δ1.5-4.7ppm之间。

DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-Gly-His-Lys-Gly-醇的合成如实施例2中所述，使用Fmoc化学中的2-氯三苯甲基氯树脂合成Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-Gly-醇-树脂的肽基树脂。通过与制备DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-醇中描述的相同程序来进行随后的反应。获得的DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Gly-醇的¹HNMR(MeOH)谱显示如下：δ(ppm)：0.90(t，CH₃-(CH₂)_n-)，1.29(br.s，-(CH₂)_n-)，2.32(4H，t，-CH₂CH₂-C(O)O-)，3.63(s，-O-(CH₂CH₂)_n-O-)，5.22(1H，s，甘油sn2质子)；α碳和肽中残余的质子分布在δ1.5-4.7ppm之间。

DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-Cys(Acm)-Met-His-Ile-Glu-Ser-Leu-Asp-Ser-Tyr-Thr-Cys(Acm)-Gly-醇的合成如同实施例2中所述，使用Fmoc化学中的2-氯三苯甲基氯树脂合成Cys(Acm)-Met-His(Trt)-Ile-Gly-Ser(tBu)-Leu-Asp(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Gly-醇-树脂的肽基树脂。通过与制备DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH--(D)Phe-Cys(Acm)-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-醇中描述的相同程序来进行随后的反应。获得的DSPE-NHC(O)-PEG₂₀₀₀-C(O)NH-Cys(Acm)-Met-His-Ile-Gly-Ser-Leu-Asp-Ser-Tyr-Thr-Cys(Acm)-Gly-醇的¹H-NMR(MeOH)谱显示如下：δ(ppm)：0.90(t，CH₃-(CH₂)_n-)，1.29(br.s，-(CH₂)_n-)，2.32(t，-CH₂CH₂-C(O)O-)，3.63(s，-O-(CH₂CH₂)n-O-)，5.22(s，甘油sn2质子)；α碳和肽中残余的质子分布在δ1.5-4.7ppm之间；肽中芳香环上的质子分布在δ6.5-8.6之间。实施例11：含脂质体的治疗剂的制备

在氯仿/甲醇(1∶1)中溶解HSPC(0.121mmol)/Chol/mPEG-DSPE(摩尔比为10∶7∶0.4)的脂质成分，并且蒸发除去任何有机溶剂，然后真空干燥得到脂质膜。使脂质膜在150mM硫酸铵缓冲液中接受剧烈涡动进行水化，并且进行冷冻-融化循环10次。使用来自Liposofast^TM(Ottawa，Canada)的挤出装置将混合物挤出通过双层聚碳酸酯膜(孔径为400到100nm)，从而产生脂质体。通过凝胶过滤柱后，脂质体外面的缓冲溶液变成300mM组氨酸溶液。通过在65℃下混合脂质体与10mg DOX在1ml 300mM组氨酸中的溶液1小时来装载DOX。然后，在25mM HEPES和150mM NaCl的缓冲液中(pH7.2)，将其通过凝胶过滤柱，从而除去游离DOX。脂质体的磷脂浓度通过它们的磷含量来确定，囊泡大小通过动力学激光散射确定，DOX含量通过UV来确定。脂质体具有135nm的平均囊泡大小，标准偏差＜25％并呈正态分布。脂质体中DOX含量达到0.28个药物/脂质摩尔比。实施例12：靶向治疗脂质体的制备

在3ml氯仿/甲醇(1∶1)中溶解DSPE-NHC(O)-PEG₆₀₀-C(O)NH-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol/mPEG-DSPE(0.004/0.012mmol)，并且蒸发得到干燥的脂质膜。在60℃下，在轻微搅动混合物下，将干燥的脂质膜在1ml 25mM HEPES和150mM NaCl的溶液中(pH7.2)水化。在脂质膜融化并且混合物转变成清澈的胶束溶液后，将胶束溶液转移入4ml含有DOX的脂质体(含有0.21mmol总量脂质和0.058mmol DOX·HCl)中，并在60℃保持4小时，直到完成插入。然后，使溶液通过凝胶过滤柱，如Sepharose^TM CL-4B(Pharmacia Biotech^TM)柱，从而分离胶束和靶向治疗脂质体。为了进行定量分析，将胶束和靶向治疗脂质体部分分别合并。在脂质体中插入的肽-PEG-脂质缀合物约为脂质体中脂质总量的1％。实施例13：c-OPD缀合物与促生长素抑制素受体2(SSTR2)的结合试验

根据文献中描述的方法进行c-OPD₆₀₀和c-OPD₂₀₀₀缀合物与SSTR2的结合试验，Patel，Y.C.和Srikant，C.B.，Endocrinology，135，2814-2817(1994)以及Liapakis，G.等，J.Biol.Chem.271，20331-20339(1996)。简言之，在结合试验中使用人促生长素抑制素SSTR2质粒转染的CHO-K1细胞膜。通过增加c-OPD的浓度来与0.03nM[¹²⁵I]促生长素抑制素-14竞争和细胞膜的结合，从而进行结合试验。非特异性结合定义为不加入c-OPD缀合物而放射活性低于1μM的[¹²⁵I]促生长素抑制素-14。通过在25℃下在含有25mM Hepes和5mMMgCl₂的缓冲液(pH7.4)中培养细胞膜、[¹²⁵I]促生长素抑制素-14和c-OPD缀合物4小时来进行结合反应。通过快速过滤通过GF/C玻璃纤维滤器来终止结合反应。然后，用4ml冰冷缓冲液洗涤滤器三次，并测量结合的[¹²⁵I]促生长素抑制素-14的放射活性。采用Cheng和Prusoff公式计算抑制常数(Ki)值，Cheng，Y.和Prusoff，w.H.，Biochem.Pharmacol.22，3099-3108(1973)。所得c-OPD₆₀₀的Ki值为25nM，c-OPD₂₀₀₀的Ki值为11nM。

本文显示并详细描述的信息足以实现本发明的上述目的，因此本发明的优选实施方案代表本发明的主题，该主题为本发明所广泛涵盖。本发明的范围完全涵盖其它对本领域技术人员来说显而易见的实施方案，因此，本发明的范围不被除所附权利要求之外的任何内容所限制，其中除了明确说明外，所用元素的单数形式并不是指“一个和唯一”，而是指“一个或更多”。对本领域一般技术人员来说，所有公知的上述优选的实施方案和附加实施方案部分的结构、组成和功能上的等价物因此引入本文作参考，而且试图被本发明的权利要求所涵盖。

此外，不需要某种设备或方法来表达本发明所解决的每个问题，因为它们都已包括在本发明的权利要求之内。另外，无论本发明公开事实中的所有部分、成分，或者方法步骤是否在权利要求中被明确叙述，它们都没有贡献给公众。但是，对本领域普通技术人员来说，很明显在不背离如所附权利要求中所阐明的本发明的实质和范围的前提下，可以在形式、试剂和合成细节上做出各种改变和修饰。