枇杷叶总三萜酸组分及其在制备抗炎、止咳药物中的应用

摘要

本发明涉及从中药枇杷叶中提取分离的一种总三萜酸组分，其化学成分包括乌苏酸、齐墩果酸、2α－羟基乌苏酸、2α－羟基齐墩果酸、坡模酸和蔷薇酸等；它具有式(1)化学结构通式和抗炎、镇咳活性，本发明还涉及该总三萜酸组分在制备药物方面的用途，特别是在制备抗炎、止咳等药物方面的用途。

说明书

技术领域：

本发明涉及从中药枇杷叶中提取分离的一种总三萜酸组分及其在制备药物方面的应用，特别是在制备抗炎、止咳药物方面的应用。

背景技术：

枇杷叶系蔷薇科Rosaceae枇杷属植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lind1.的干燥叶。在我国分布很广，主要分布于华东、中南、西南地区。枇杷叶是我国的一味常用中药，收载于历版中国药典供中医临床使用，其性苦，微寒，归肺、胃经，清肺止咳、降逆止呕。用于肺热咳嗽，气逆喘急，胃热呕逆，烦热口渴。

充分发掘我国丰富的中药资源，利用现代科学技术手段，研制临床有效的治疗药物是很有必要的。然而，从中药枇杷叶中提取分离一种总三萜酸组分用于制备药物特别是制备抗炎、止咳药物方面，目前尚未见有报道。

本发明的目的之一是，提供一种总三萜酸组分，其化学成分主要包括乌苏酸、2α-羟基乌苏酸、2α-羟基齐墩果酸，另外还含有齐墩果酸、坡模酸和蔷薇酸等成分。该总三萜酸组分，其含量达50％以上，其中乌苏酸、2α-羟基乌苏酸和2α-羟基齐墩果酸所占比例分别为30-60％，5-20％和5-20％。

本发明的目的之二是，提供一种总三萜酸组分在制备药物方面的应用，特别是在制备抗炎、止咳药物方面的应用。

发明内容：

本发明所述的总三萜酸组分配方中的化学成分包括乌苏酸、齐墩果酸、2α-羟基乌苏酸、2α-羟基齐墩果酸、坡模酸和蔷薇酸等，它具有式(1)化学结构通式，

                          式(1)

式中：R₁R₃，R₄为H或OH；R₂为α-OH或β-OH。

为了探讨其药效作用的物质基础，寻找与该中药功能主治相吻合的有效成分，本实验室对其进行了化学成分和抗炎、镇咳药理活性研究。初步药理筛选实验表明，枇杷叶乙醇提取物对二甲苯引起的小鼠耳肿胀有明显抑制作用，对柠檬酸喷雾引起的豚鼠咳嗽有明显的止咳作用。继而对其乙醇提取物进行分离精制，经过大孔树脂除杂，氧化铝脱色，甲醇或丙酮结晶，得到总三萜酸组分；对其进行分离得到6个三萜酸类化合物，分别鉴定为乌苏酸(ursolic acid，I)，2α-羟基乌苏酸(2α-hydroxyursolic acid，II)，2α-羟基齐墩果酸(maslinic acid，III)，齐墩果酸(oleanolic acid，IV)，坡模酸(pomolic acid，V)和蔷薇酸(euscaphic acid，VI)；其中，坡模酸系首次从该植物中分离得到。本发明用分离得到的6种成分作为标准品，对总三萜酸进行了HPLC分析，结果表明：总三萜酸中含化合物I-VI的总量达86.8％；各成分乌苏酸、齐墩果酸、2α-羟基乌苏酸、2α-羟基齐墩果酸、坡模酸和蔷薇酸比例依次为47.9％，1.5％，10.0％，11.1％，3.6％和12.7％。

深入的药效学实验研究表明：总三萜酸组分，乌苏酸和2α-羟基齐墩果酸对二甲苯引起的小鼠耳肿胀显示很强的抗炎活性；前二者对柠檬酸喷雾引起的豚鼠咳嗽显示了止咳作用。

本发明的技术方案依此包含如下步骤：一、总三萜酸的制备：

以枇杷叶[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lind1.]为原料，用95％乙醇回流提取2次，每次两小时，合并提取液，回收溶剂，得浸膏。将浸膏用适量水溶解，用D101大孔吸附树脂进行处理，先用水洗脱，再用95％EtOH洗脱，后者洗脱部分回收溶剂得棕色洗脱物，用乙醇溶解，三倍量中性氧化铝拌样，挥干溶剂后用一倍量中性氧化铝柱层析，甲醇洗脱，回收溶剂得无定型粉末，经甲醇或丙酮处理，即得总三萜酸。二、药效学试验：

1、实验材料：

小鼠，昆明种，雌雄各半，体重25～30g，二级动物(合格证号：SCXK1100-0006)；豚鼠，普通级；均购自中国医学科学院实验动物中心。

2、实验方法与结果

1)、口服枇杷叶乙醇提取物的萃取部位对二甲苯引起小鼠耳肿胀的影响取小鼠，体重25～30g，随机分为4组，每组14只，雌雄各半，第1组给生理盐水，第2～4组，分别灌服枇杷叶各萃取部位浸膏的悬浮状水溶液，各组每日灌胃给药1次，连续3次，于末次给药45分钟后，分别以二甲苯棉球接触小鼠右耳5秒钟，15分钟后拉颈椎处死小鼠。以直径8mm打孔器将小鼠双耳同部位切下，测定左右耳重量差，统计处理各组数据并计算抑肿率。结果表明EJ-02和EJ-03部分对二甲苯引起的小鼠耳肿胀有明显的抑制作用，显示抗炎活性(表1)。表1  口服枇杷叶乙醇提取物的萃取部位对二甲苯引起小鼠耳肿胀的影响

                  (X±SD，n＝14)组别                  剂量(mg/kg)    两耳片重量差(mg)    抑肿率生理盐水组            20ml           21.29±3.45EJ-02组               0.435          15.29±5.98^*       28.2％EJ-03组               1.515          15.21±4.76^*       28.6％EJ-04组               0.107          17.57±6.95注：与生理盐水组比较^*P＜0.05

2)、口服枇杷叶乙醇提取物的萃取部位对豚鼠的止咳作用

采用柠檬酸喷雾引咳法，取豚鼠，体重190～220g，随机分为5组，每组8只，雌雄各半。第1组口服生理盐水，第2～4组，分别口服枇杷叶各萃取部位浸膏的悬浮状水溶液，第5组口服可待因水溶液，灌胃给药1小时后，将豚鼠放入实验装置内，用超声波医用雾化器，喷入17.5％柠檬酸溶液的雾化气体，喷雾40秒钟，记录5分钟内每只豚鼠的咳嗽潜伏期及咳嗽次数。结果表明，EJ-02和EJ-03部分对豚鼠均有明显的止咳作用(表2)。表2.  口服枇杷叶乙醇提取物的萃取部位对豚鼠的止咳作用(X±SD，n＝8)组别              剂量(mg/kg)       咳嗽潜伏期(s)       咳嗽次数/5min生理盐水组        5ml               43.50±16.45        24.13±5.36EJ-02组           435               75.13±41.86^*      15.88±6.27^*EJ-03组           1515              82.25±28.15^*      13.63±5.22^*EJ-04组           107               48.75±11.70        21.75±7.31可待因组          30                120.38±16.09^***   7.38±1.70^***注：与生理盐水对照组比较^*P＜0.05，^***P＜0.001.

3)、口服乌苏酸、2α-羟基齐墩果酸和总三萜酸对二甲苯

                引起小鼠耳肿胀的影响

昆明种小鼠，体重28～30g，随机分为9组，每组14只，雌雄各半。第1组口服生理盐水，第2组口服阿司匹林水溶液，第3～5组，分别口服乌苏酸高、中、低三个剂量组的水溶液，第6组口服2α-羟基齐墩果酸水溶液，第7～9组，分别口服总三萜酸高、中、低三个剂量组的水溶液，其它方法同4.1所述。结果表明乌苏酸、2α-羟基齐墩果酸和总三萜酸均对二甲苯引起的小鼠耳肿胀有明显抑制作用(表3)。表3  口服乌苏酸、2α-羟基齐墩果酸和总三萜酸对二甲苯

       引起小鼠耳肿胀的影响(X±SD)组别                剂量(mg/kg)      两耳片重量差(mg)       抑肿率生理盐水组          20ml             22.29±7.18阿司匹林组          150              12.24±6.01^***        44.7％乌苏酸组            240              10.35±3.56^***        53.3％乌苏酸组            120              9.78±5.82^***         55.8％乌苏酸组            60               12.98±8.14^**         41.4％2α-羟基齐墩果酸    90               13.16±7.29^**         40.6％总三萜酸组          400              12.99±7.38^**         41.3％总三萜酸组          200              14.05±6.15^*          36.6％总三萜酸组          100              17.17±6.59            22.5％注：与生理盐水对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001.

4)枇杷叶中乌苏酸、总三萜酸对豚鼠的止咳作用

取豚鼠，体重200～230g，随机分为9组，每组8只，雌雄各半。第1组口服生理盐水，第2组口服可待因水溶液，第3组口服磷酸苯丙哌林水溶液，第4～6组，分别口服乌苏酸高、中、低三个剂量组的水溶液，第7～9组分别口服总三萜酸高、中、低三个剂量组的水溶液，其它方法同上。结果，枇杷叶中乌苏酸、总三萜酸对豚鼠显示了止咳作用(表4)。表4  服枇杷叶中乌苏酸、总三萜酸对豚鼠的止咳作用(X±SD，n＝8)组别              剂量(mg/kg)      咳嗽潜伏期(s)       咳嗽次数/5min生理盐水组        5ml              42.75±19.15        26.00±5.87可待因组          30               107.75±21.89^***   12.50±6.61^**磷酸苯丙哌林组    20               95.50±47.95^*      13.25±7.04^**乌苏酸组          240              79.75±25.45^*      13.75±5.44^**乌苏酸组          120              46.00±22.36        17.50±5.41^*乌苏酸组      60              42.25±20.19         23.50±10.89总三萜酸组    400             73.00±30.68^*       14.25±6.75^**总三萜酸组    200             70.00±31.32^*       17.75±6.77^*总三萜酸组    100             64.25±35.01         21.75±10.16注：与生理盐水对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001.三、总三萜酸的组成成分分析

以上药效学实验结果表明，乌苏酸具有很强的抗炎作用，其活性强于阿司匹林对照组，2α-羟基齐墩果酸和总三萜酸也显示较强的抗炎作用；乌苏酸和总三萜酸还显示相应的止咳作用。本发明的研究表明，枇杷叶在不同产地、同一产地的不同采集期，或从药店采购的商品(蜜炙)中测定乌苏酸含量在0.59-0.76％范围。

1、仪器与材料

本发明采用了美国Waters 600型高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，2010数据处理软件；TCQ-250超声波清洗器(北京医疗设备二厂)；甲醇为色谱纯，水为重蒸蒸馏水；磷酸为分析纯。

2、色谱条件

色谱柱：Nova-pakC₁₈(3.9mm×150mm，4μm)；流动相：CH₃OH-H₂O-H₃PO₄(80∶20∶0.075)；流速：1ml/min；柱温：25℃；检测波长：205nm。

3、三萜酸样品及化合物1-6标准品溶液的制备

取总三萜酸或化合物1-6标准品0.70mg，精密称定至0.01mg，置1ml量瓶加甲醇溶液并稀释至刻度，摇匀即得。

4、枇杷叶样品液的制备

取样品枇杷叶(过3号筛)约0.8g，精密称定至0.0001g，置于25ml容量瓶中，加入氯仿20ml，称量，封口膜封口。浸泡30min，超声提取20min，间歇10min后，继续超声提取20min，称重，补重，使前后重量一样。过滤，取续滤液5ml挥干，甲醇溶解，少量多次转移至5ml容量瓶中，甲醇定容。

5、总三萜酸的组成成分分析

取化合物1-6标准品溶液分别进样20μl，按上述色谱条件测定各自的保留时间；总三萜酸样品液同法进样，其色谱图和化合物1-6的峰位如(图1)所示。用归一化法测定峰面积积分值，总三萜酸中含化合物1-6的总量达86.8％；各成分乌苏酸、齐墩果酸、2α-羟基乌苏酸、2α-羟基齐墩果酸、坡模酸和蔷薇酸比例依次为47.9％，1.5％，10.0％，11.1％，3.6％和12.7％。发明优点：

本发明的优点在于，与现有技术相比，克服了传统中药多为复方或以简单提取粗提物制成口服颗粒或稠膏导致缺乏可靠质量控制以及服用、携带和运输不便等缺陷，采用现代科学技术可以制备更加安全、有效、稳定、可控和服用方便的药物制剂。

附图说明：图1：总三萜酸样品高压液相色谱图

 其中：1-乌苏酸；      2-齐墩果酸；      3-2α-羟基乌苏酸；

       4-2α-羟基齐墩果酸；      5-坡模酸；      6-蔷薇酸。