受体酪氨酸激酶抑制剂和可与α1－酸性糖蛋白结合的有机化合物的联合形式

摘要

本发明涉及ab1－、PDGF－受体－和/或Kit受体酪氨酸激酶抑制剂和一种能够结合到α1－酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物的联合形式，并且涉及其药物制剂和/或疗法，它们与对抑制ab1－、PDGF－受体－和/或Kit－受体酪氨酸激酶有应答的疾病状况有关。具体地讲，本发明涉及含有ab1－、PDGF－受体－和/或Kit受体－酪氨酸激酶抑制剂和一种能够结合到α1－酸性糖蛋白上的有机化合物的产品或联合形式，它们可以是固定的联合形式，或者用于按时间先后顺序交错或同时施用，并且本发明还涉及两种类型的化合物以固定的联合形式或者按时间先后顺序交错或同时施用联合用于治疗增殖性疾病、特别是肿瘤疾病、尤其那些能够通过抑制ab1－、PDGF－受体－和/或Kit受体酪氨酸激酶活性进行治疗的疾病的用途。

说明书

本发明涉及abl-、PDGF-受体-和/或Kit受体酪氨酸激酶抑制剂和一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物的联合形式，并且涉及药物制剂和/或疗法，其与对抑制abl-、PDGF-受体-和/或Kit-受体酪氨酸激酶有应答的疾病状况有关。具体地讲，本发明涉及含有abl-、PDGF-受体-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白上的有机化合物的产品或联合形式，它们可以是固定的联合形式，或者用于按时间先后顺序交错或同时施用，并且还涉及两种类型的化合物以固定的联合形式或者按时间先后顺序交错或同时施用联合用于治疗增殖性疾病、特别是肿瘤疾病、尤其那些能够通过抑制abl-、PDGF-受体-和/或Kit受体酪氨酸激酶活性进行治疗的疾病的用途。

发明背景

已知许多化合物可以通过抑制abl-、PDGF-受体和/或Kit受体酪氨酸激酶来抑制细胞的增殖。例如，在国际申请号WO97/02266、国际专利申请WO98/35958、特别是欧洲专利申请EP 0 564 409-A以及国际申请号WO99/03854中提到了是至少上述一种酪氨酸激酶抑制剂的化合物，所有这些专利或专利申请均引入本文作为参考。其它有关的化合物有TyrphostinAG957(参见Kaur等，抗癌药(Anticancer Drugs)，5，213-222页(1994)、Herbimycin A(Okabe和Uehara，白血病和淋巴瘤(Leukemia andLymphoma)，12，2156-2162(1994)，血液(Blood)，80，1330-1338页(1994)和白血病研究(Leuk.Res.)18，213-220页(1994)，以及Rioran等，癌基因(Oncogene)，16，133-1542页(1998))；Tyrphostins AG 1295、AG 1296(参见Kovalenko等，癌研究(Cancer Res.)54，6106-6114页(1994)，Lipson等，药理学和实验治疗学(Pharmacol & Exp-Therap.)285，844-852页(1998)，Krystal等，癌研究57，2203-2208页(1997))；SU 101(来氟米特)及其代谢物(参见Shawer等，临床癌研究(Clin.Cancer Res.)3，1167-1177页(1997)，Mattar等，FEBS Lett.334，161-164页(1993)，Cherwinskyi等，Inflamm.Res.，3，1167-1177页(1997)和Strawn等，Exp.Opin.Invest.Drugs，7，533-573页(1998))；和吡啶并嘧啶类化合物(参见例如Hamby等，医学化学杂志(J.Med.Chem.)40，2296-2303页(1997)，Dahring等，药理学和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)281，1446-1456页(1997)，Klutcho等，生命科学(Life Sci.)，62，143-150页(1998)，Panek等，药理学和实验治疗学杂志283，1433-1444页(1997)，Boschelli等，医学化学杂志41，4365-4377页(1998))。上面提到的所有参考文献均引入本文作为参考。

在提到的专利申请和其它出版物中描述的这些化合物，已显示对预防、特别是对治疗由刚提到的酪氨酸激酶的磷酸化和/或活性的失调所引起的疾病有效。

长期以来已知蛋白质的磷酸化在细胞分化和分裂中是一个必不可少的步骤。磷酸化由细分为丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶的蛋白激酶催化。酪氨酸激酶包括PDGF(血小板衍生的生长因子)受体酪氨酸激酶＝PDGF-RTK、abl酪氨酸激酶(abl)和kit受体酪氨酸激酶(kit RTK)。当这些酪氨酸激酶失调时，例如通过用可与它们结合的化合物(内在的天然化合物例如PDGF或外界的化合物)等外部因素使其突变或激活时，将会引起细胞生长的失调。

PDGF(血小板衍生的生长因子)是一种经常出现的生长因子，它在正常生长和病理性的细胞增殖例如癌形成和血管平滑肌细胞的紊乱例如动脉粥样硬化和血栓形成中起重要作用。它的抑制能够用类似于在上面提到的EP0 564 409中描述的方法测定(也可参见E.Andrejauskas-Buchdunger和U.Regenass，癌研究，52，5353-5358页(1992))。

v-abl-酪氨酸激酶等abl激酶的抑制根据N.Lydon等，癌基因研究(Oncogene Research)，5，161-173页(1990)和J.F.Geissler等，癌研究，52，4492-4498页(1992)的方法测定。在这些方法中使用[Val⁵]-血管紧张肽II和[γ-³²p]-ATP作为底物。

kit受体酪氨酸激酶的抑制可以通过例如体外c-Kit激酶试验来测定：

体外c-Kit激酶试验是一种滤膜结合试验，它在96-孔板中进行，使用在杆状病毒中表达并经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶纯化的重组GST(谷胱甘肽S转移酶)-融合的c-Kit激酶结构域。将GST-融合蛋白在存在或不存在药物的条件下在最佳条件下保温且通过测定多聚(谷氨酸酪氨酸)(4∶1)肽P-275的磷酸化的降低测定激酶的抑制作用。使用γ-[³³P]-ATP作为磷酸盐的供体。或者，也可以用细胞测定方法测定c-Kit：将过度表达c-Kit的细胞在无血清的条件下和药物一起于37℃保温90分钟，然后用重组人类干细胞因子进行刺激。使用抗-磷酸酪氨酸抗体通过蛋白质印迹法分析细胞裂解物中的等量蛋白质来测定对c-Kit磷酸化的抑制。

由于所描述的特征，对以上提到的酪氨酸激酶之一显示抑制作用的化合物可以用作治疗剂，特别是用于治疗增殖性疾病，例如癌症、特别是肿瘤和白血病。

另一方面，这些化合物不仅能用作肿瘤-抑制活性成分而且能用作抗非恶性增殖性疾病例如动脉粥样硬化、血栓形成、牛皮癣、硬化性皮炎和纤维样变性的药物。它们也适于上面提到关于蛋白激酶C-调节剂的其它应用，特别是可用于治疗对PDGF-受体激酶抑制有应答的疾病。

上述的酪氨酸激酶抑制剂也可抑制BCR/Abl激酶(参见NatureMedicine，2，561-566页(1996))，因此适于治疗BCR/Abl-阳性的癌和肿瘤疾病，例如白血病(特别是慢性骨髓白血病和急性淋巴母细胞白血病，在这些疾病中发现了细胞凋亡的作用机制)，并且还显示对白血病干细胞亚组的效果，以及显示在去除所说的细胞后(例如，骨髓去除)对这些细胞的体外纯化和一旦它们被清除癌细胞后对这些细胞的再移植(例如，纯化的骨髓细胞的再移植)的潜力。

另外，以上描述的酪氨酸激酶抑制剂在治疗由诸如同种异体移植等移植引起的紊乱、特别是组织排斥，例如特别是闭塞性细支气管炎(OB，一种同种异体肺移植的慢性排斥)中能够显示出有益的效果。与未患OB的病人相反，那些患OB的病人常在支气管肺泡的洗出液中显示出高的PDGF浓度。酪氨酸激酶抑制剂在与血管平滑肌细胞迁移和增殖有关的疾病(其中PDGF和PDGF-R常起作用)例如再狭窄和动脉粥样硬化中也有效。它们还能够抑制血管生成。

所有这些用途详细地记载于EP 0 564 409、WO97/02266、WO99/03854和WO98/35958或上面提到的其它参考文献中。

对上述酪氨酸激酶显示出抑制活性的化合物的一个例子是名为4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基]苯基]苯甲酰胺的化合物，它记载于EP 0 564 409中，其甲磺酸盐的形式(以下称为STI571)、优选β-晶体形式记载于WO99/03854中。

该化合物是bcr/abl(一种引起慢性骨髓白血病(CML)的致肿瘤融合蛋白)的有效的抑制剂。然而，在进行的临床试验中观察到，呈现未成熟细胞危象的CML病人和复发的费城染色体阳性急性淋巴母细胞白血病(Ph+-ALL)病人只暂时地显示对STI571的应答，接着在短时期内产生抗药性。

我们以前已证实，只要这种化合物能够维持对bcr/abl激酶活性的持续抑制，则其可治愈注射了人类BCR/ABL+白血病细胞的小鼠。该模型被用于研究可能的对STI571的抗药性的出现。当对负载大肿瘤(＞400毫克)的动物进行治疗时，在所有动物中均观察到了肿瘤缩小，并在一些动物中消失。然而，没有动物被治愈，复发动物对进一步的治疗无反应，并且体内施用STI571不能抑制bcr/abl激酶活性，虽然已达到了活性血浆浓度(≈10μM)。从复发的、抗药性动物中切下肿瘤，进行培养，在24小时内检测对STI571的体外敏感性。5/5被检查的肿瘤显示出其IC₅₀(0.1-0.3μM)与亲代KU812系的无显著不同。

抗药性的产生可由在细胞水平或只在体内起作用的多种因素引起。抗药性的产生可因例如靶基因的突变/扩增、代谢的诱导，以及，似非而可能是地，由靶蛋白的翻译后降解升高等因素而引起。

令人惊讶地，已发现药物代谢动力学数据显示，复发动物达到与对照相似的峰浓度，但它们显示ST1571浓度随时间的降低显著变慢。我们现在发现这是由于在复发动物的血浆中存在结合因子，能够减少STI571的组织分布和清除。在体外测定了许多蛋白质抑制STI571的生物学活性的能力。在生理浓度下，白蛋白不影响STI571对KU812增殖的抑制作用，而α-酸性糖蛋白(AGP)确实影响STI571对KU812增殖的抑制作用，使STI571的IC₅₀增加到高达90倍。AGP还在体外抑制STI571对bcr/abl磷酸化的效果。计算了与STI571特异性结合的缔合常数(Ka)，发现在AGP中比在白蛋白中高60倍。用免疫测定方法测定小鼠中的AGP水平。在肿瘤负载和AGP浓度两者中发现了强的相关性。另外，在体内用STI571预处理也增加了AGP血浆水平。因此，用STI571预处理，接着注射KU812细胞且在24小时后用STI571处理的动物比对照动物对处理具较小的应答(治愈动物：8/16对16/16，p＜0.01)。这些结果提示，不论来自肿瘤的诱导还是来自处理本身，升高的AGP水平均可导致对STI571抗药性的产生。

本发明的目的是提供一种克服在用STI571或上述任何其他酪氨酸激酶抑制剂治疗上面提到的疾病时在温血动物中产生抗药性的方法。

对酪氨酸激酶抑制剂、特别是STI571的抗药性可能是由于AGP结合并因此降低了在血浆中的活性药物的游离浓度所引起的这一令人惊讶的结果构成了寻找解决方案的基础，所述解决方案可以是，阻止调节分子例如调节蛋白所允许的AGP基因转录的激活、阻止AGP基因的扩增、抑制编码AGP的mRNA的基因转录、抑制所说的mRNA翻译成成熟的蛋白质、影响它的分布和加工成最终的糖蛋白、抑制它分泌进入血浆、使用大剂量的酪氨酸激酶抑制剂、用例如抗体中和AGP、激活其代谢或从血浆中清除、激活AGP或其前体的翻译后的降解，等等。

意想不到地是，鉴于对联合药物疗法中药物置换的恰当性存在怀疑的报道(参见例如Kremer等，药理学评论(Pharmacological Rev.)40(1)，1-47页(1988年))，现已经发现，通过将一种或多种AGP结合化合物与abl-、PDGF-受体-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂相联合可以克服这种类型的抗药性。

所以本发明考虑在对患有本发明所提到的疾病之一的病人的治疗中作重要改进。

发明概述

本发明涉及(a)abl-、PDGF-受体-和/或Kit受体酪氨酸激酶抑制剂(组分(a))和(b)能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物(组分(b))的联合形式，并且涉及药物制剂和/或疗法，其与对抑制abl-、PDGF-受体-和/或Kit-受体酪氨酸激酶有应答的疾病状况有关。具体地讲，本发明涉及含有(a)abl-、PDGF-受体-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物的产品或联合形式，它们可以是固定的联合形式，或者用于按时间先后顺序交错或同时施用，并且还涉及两种类型的化合物以固定的联合形式或者按时间先后顺序交错或同时施用联合用于治疗增殖性疾病、特别是肿瘤疾病、尤其那些能够通过抑制abl-、PDGF-受体-和/或Kit受体酪氨酸激酶活性进行治疗的疾病的用途。

附图描述

图1A和B显示起始肿瘤负载和STI571处理时间长短的影响。

图1A：对两组的15只裸鼠注射以50×10⁶KU812白血病细胞。STI571的处理(每8小时一次，口服160毫克/公斤，处理11天)于1天后开始(I组；正方形)或在8天后(II组；菱形)在存在平均肿瘤重量276±97毫克下开始。圆括号中的数字表示无肿瘤动物的数量。

图1B：注射有KU812细胞的裸鼠在1天后(I组)、8天后(II组，平均肿瘤重量253±122毫克)或15天后(III组，平均肿瘤重量1054±258毫克)用STI571处理(每8小时一次，160毫克/公斤口服，处理11天)。结果代表三个连续试验的平均值。

图1C：属于II组的动物不进行处理(对照)或用STI571(每8小时一次，160毫克/公斤口服)处理11或18天。

图2显示在对STI571起始应答后用STI571再处理对肿瘤复发的影响。破折号线指未对肿瘤进行处理时的生长状况(参见实施例中的方法部分)。

图3显示两种体内抗性肿瘤对STI571的体外敏感性。数值表示成对照(129’362±6329cpm)的％值。

图4显示STI571对Bcr/Abl激酶活性的体内抑制。负载肿瘤的小鼠用STI571急性口服给药(160毫克/公斤)然后在不同时间点宰杀。抽取肿瘤试样并用抗-磷酸酪氨酸(pTyr)或抗-Abelson(Abl)作蛋白质印迹分析。在处理2和4小时时(经光密度分析，80％和50％抑制)，与未被处理的动物(n.t.)相比，STI571在对照中(Ctrl)可以有效地抑制BCR/ABL酪氨酸激酶的磷酸化，而复发动物(Rel)的抽提物对STI571处理具有抗性。

图5显示在用或不用STI571预处理的负载肿瘤小鼠的血浆和肿瘤中STI571的浓度。将动物用STI571急性处理(160毫克/公斤，口服)被并在0.5、2和5小时后宰杀。血浆样品和肿瘤抽提物中的STI571以HPLC测定。对照小鼠从不接受STI571预处理，而经预处理小鼠接受STI571的两轮(每轮各11天)的处理(如在图2中)。平均肿瘤重量在对照中是450±129毫克而在预处理小鼠中是684±283毫克。

图6显示在α₁-酸性糖蛋白(A)和白蛋白(B)的存在下KU812细胞对STI571的体外敏感性(参见方法部分中的³H-胸苷摄取)。

图7显示含有不同量AGP的两种血清样品对于STI571对KU812细胞体外活性的影响。

图8A和B显示在正常和负载肿瘤的小鼠中AGP的测定。

图8A：在具有不同疾病或处理情形的小鼠中的平均AGP血浆浓度。1组(n＝11)指正常小鼠，2组(n＝8)指用STI571处理11天的小鼠(且在处理中止3天后取样)，3组(n＝6)指负载8天久的肿瘤(平均重量304±116毫克)的小鼠，4组(n＝7)指负载15天久的肿瘤(平均重量1184±295毫克)的小鼠。

图8B：在正常和负载肿瘤的小鼠中用等电聚焦直接测定AGP：1-2泳道指正常小鼠，3-4泳道指负载大的(＞1克)肿瘤的动物。不同的AGP同种型被指示出并在pH3.4和4.0之间进行比较。

图9显示AGP(1毫克/毫升)和红霉素对STI571(1μM)对KU812细胞活性的影响。

图10显示AGP和红霉素对由STI571诱导的bcr/abl自体磷酸化的抑制的影响。

每孔3×10⁶细胞在37℃与红霉素碱(100μM)、STI571(3μM)、AGP(2毫克/毫升)一起保温。1小时以后，将细胞用冷磷酸盐缓冲液盐水(PBS)洗涤两次，然后在500微升的1×Laemmli′s缓冲液中裂解。将相当于90,000个细胞的细胞裂解物于7.5％聚丙烯酰胺上进行SDS电泳分析。用相应的小鼠单克隆抗体检测内源bcr/abl和酪氨酸-磷酸化的bcr/abl。

图11A和B显示红霉素与STI571的共同施用于负载肿瘤小鼠的体内效果。负载11天久的肿瘤的动物被随机地分配到两不同的组。15只小鼠用STI571和红霉素处理(平均肿瘤重量385±53毫克)，而另15只小鼠只接受STI571(平均肿瘤重量390±114毫克)。对照组只单独接受重悬浮于5％甲基纤维素中的红霉素(5只小鼠)或只接受5％甲基纤维素(6只小鼠)。

图11A：处理期间(第0-20天)的平均肿瘤重量。

图11B：负载肿瘤小鼠的百分比：计算在每一时间点负载可触及的肿瘤的小鼠对该时间点活着的小鼠总数的百分率。在一定的时间点活着的小鼠数量用圆括号中的数字表示(在实验过程中，在只接受STI571的组和接受联合处理的组中分别有2只和3只动物偶尔被宰杀)。

图12显示预处理对STI571的抗-白血病效果的影响。两组裸鼠从注射白血病细胞1天开后始用STI571(160毫克/公斤，每8小时一次)处理11天。破折号线指对照的、未进行预处理的动物。实线指在注射KU812 bcr/abl+白血病细胞之前已经接受了相同的STI571处理14天的动物。

发明详述

令人惊讶地，在裸鼠的异种移植模型中，在abl-、PDGF-R-和/或Kit受体酪氨酸激酶抑制剂和能结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物之间观察到了相加的和甚至更为优选的协同效果。这表明酪氨酸激酶抑制剂不仅可以作为单一的物质使用，而且能够用于和能结合到AGP上的有机化合物的联合疗法来治疗癌症疾病。

这种组合提供了许多优点：第一，酪氨酸激酶抑制剂可能显示明显的副作用直至实在的毒效，因而用酪氨酸激酶抑制剂剂量的增加来简单地补偿AGP结合以在治疗用途和副作用两者中获得可靠的平衡常常是很困难或者是不可能的。然而，在这里描述的新的组合中，可能减少所需的酪氨酸激酶抑制剂的量从而减轻副作用。第二，可以用作能结合到AGP上的化合物的有机化合物能够从具有很高的耐受性的化合物中挑选，从而在对癌症病人的治疗中可以有很大的灵活性。第三，由于在血浆中药物活性酪氨酸激酶抑制剂从AGP结合中的释放开辟了一条全新的治疗途径的事实，对那些已经很难治疗或者甚至用常规的化疗药物治疗时几乎不受影响的癌症类型进行治疗也成为可能。最重要的是，可能克服在体内增殖性细胞对酪氨酸激酶抑制剂的脱敏(抗药性)，它可能在治疗开始时就已经存在(例如可能是由于在血浆中高的AGP水平引起的)或在用本发明描述的abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂治疗的过程中出现。

本发明优选涉及含有(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物的联合制剂；或者如果存在至少一种成盐基团时任何组分(a)、(b)或(a)和(b)的可药用盐。

本发明还涉及治疗可以通过施用abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的增殖性疾病的方法，其中，将(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物以对可以通过施用abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的增殖性疾病联合治疗有效的量向哺乳动物联合给药，其中，如果存在至少一种成盐基团时，组分(a)和/或(b)还可以以可药用盐的形式存在。

本发明还涉及一种产品，它包含(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物，其中如果存在至少一种成盐基团时组分(a)和/或(b)还可以以可药用盐的形式存在，该产品可以不含或含有一种或多种可药用载体物质，其为用于同时使用或在一段时间内按时间先后顺序交错使用的联合制剂形式，所述的时间段对于组分(a)和组分(b)的两种活性化合物来说应足够小以增进化合物(a)对增殖性细胞的抗增殖活性、特别是在病人中，以治疗对这种化合物有应答的增殖性疾病。

本发明还涉及一种药物制剂，它包含联合有效量的用于治疗可以通过施用abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的增殖性疾病的(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白上的有机化合物以及一种或多种可药用载体物质，其中如果存在至少一种成盐基团时组分(a)和/或(b)还可以以可药用盐的形式存在。

本发明还涉及(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α-酸性糖蛋白上的有机化合物的联合形式在生产用作对抗可以通过施用abl-、PDGF-R-和/或Kit受体酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的增殖性疾病的组合物中的用途，其中如果存在至少一种成盐基团时组分(a)和/或(b)还可以以可药用盐的形式存在。

其中包括用于抑制细胞过度增殖的方法，包括将过度增殖的细胞与上两段中描述的药物制剂或产品接触，特别是治疗增殖性疾病的方法，包括将怀疑患有过度增殖性疾病的个体、所述个体的细胞、组织或体液与上两段中描述的药物制剂或产品接触。

在上文和下文中所使用的常规术语，如果不另外指明，优选具有下列含义：

关于a)abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂或b)能够结合到α₁-酸性糖蛋白上的有机化合物的术语“至少一种”是指一种或多种、特别是1至5种a)组或b)组的成员，优选指一种a)组的化合物和一种或多种、特别是1至5种、尤其是1或2种b)组的化合物。

术语“abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂”优选意指下列化合物的一种：

国际申请号WO97/02266、国际专利申请WO98/35958、特别是欧洲专利申请EP 0 564 409-A以及国际申请号WO99/03854中提到的化合物，所有这些专利或专利申请均引入本文作为参考；Tyrphostin AG957(参见Kaur等，抗癌药，5，213-222页(1994)、Herbimycin A(Okabe和Uehara，白血病和淋巴瘤，12，21 56-21 62(1994)，血液，80，1330-1338页(1994)和白血病研究18，213-220页(1994)，以及Rioran等，癌基因，16，133-1542页(1998))；Tyrphostins AG 1295、AG 1296(参见Kovalenko等，癌研究54，6106-6114页(1994)，Lipson等，药理学和实验治疗学285，844-852页(1998)，Krystal等，癌研究57，2203-2208页(1997))；SU 101(来氟米特)及其代谢物(参见Shawer等，临床癌研究3，1167-1177页(1997)，Mattar等，FEBS Lett.334，161-164页(1993)，Cherwinskyi等，Inflamm.Res.，3，1167-1177页(1997)和Strawn等，Exp.Opin.Invest.Drugs，7，533-573页(1998))；和吡啶并嘧啶类化合物(参见例如Hamby等，医学化学杂志40，2296-2303页(1997)，Dahring等，药理学和实验治疗学杂志281，1446-1456页(1997)，Klutcho等，生命科学，62，143-150页(1998)，Panek等，药理学和实验治疗学杂志283，1433-1444页(1997)，Boschelli等，医学化学杂志41，4365-4377页(1998))。上面提到的所有参考文献均引入本文作为参考。从这些参考文献中可以了解到酪氨酸激酶抑制剂、它们的合成及其用途。

在“abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂”中使用的术语“和/或”意指或者一种或者多种提到的酪氨酸激酶被这种表达所包含的化合物所抑制。

更可取地，术语“abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂”意指下列化合物中的一种：

(A)式IV化合物或其盐，(IV)其中r是0-2；n是0-2；m是0-4；R₁和R₂(i)是低级烷基，特别是甲基，或者(ii)合在一起形成子式I*的桥(I*)结合通过两个末端的碳原子完成，或者(iii)合在一起形成子式I**的桥(I**)

其中环成员T₁、T₂、T₃和T₄中的一个或两个是氮，其它的环成员在每种情况下是CH，且通过T₁和T₄进行结合；

A、B、D和E彼此独立地是N或CH，条件是这些基团中至多有2个是N；

G是低级亚烷基、被酰氧基或羟基取代的低级亚烷基、-CH₂-O-、-CH₂-S-、-CH₂-NH-、氧杂(-O-)、硫杂(-S-)或亚氨基(-NH-)；

Q是低级烷基，特别是甲基；

R是H或低级烷基；

X是亚氨基、氧杂或硫杂；

Y是芳基、吡啶基或未取代或取代的环烷基；和

Z是单-或二取代的氨基、卤素、烷基、取代的烷基、羟基、醚化或酯化的羟基、硝基、氰基、羧基、酯化的羧基、链烷酰基、氨基甲酰基、N-单或N，N-二取代的氨基甲酰基、脒基、胍基、巯基、磺基、苯硫基、苯基低级烷硫基、烷基苯硫基、苯基亚磺酰基、苯基-低级烷基亚磺酰基、烷基苯基亚磺酰基、苯基蟥酰基，苯基-低级烷基蟥酰基或烷基苯基蟥酰基，其中--如果存在1个以上的基团Z(m＝≥2)的话--取代基Z彼此间是相同的或不同的；

且其中以波浪线标出的键，如果存在的话，可以是单键或双键；

或者所限定的化合物的N-氧化物，其中有1个或多个N原子携带氧原子；

条件是，如果Y是吡啶基或未取代环烷基、X是亚氨基并且剩下的基团是所限定的基团，则G选自低级亚烷基、CH₂-O-、-CH₂-S-、氧杂和硫杂。

优选以上给出的取代基的定义具有在国际专利申请WO98/35958中描述的含义、特别是其优选的含义。最优选的这些化合物是式V化合物(V)

其名为1-(4-氯-苯氨基)-4-(4-吡啶基-甲基)-2，3-二氮杂萘，或其可药用的盐；

(B)式VI的7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶化合物或其盐，(VI)

其中q是0或1，

当q是0时n是1到3，或者当q是1时n是0到3，

R是卤素、低级烷基、羟基、低级链烷酰氧基、低级烷氧基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基-氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基-氨基甲酰基、氰基、氨基、低级链烷酰基氨基、低级烷基氨基、N，N-二-低级烷基氨基或三氟甲基，当分子中存在多个基团R时，这些基团可以相同或不同；

a)R₁和R₂彼此独立地是

α)苯基，它被下列基团取代：氨基甲酰基-甲氧基、羧基-甲氧基、苯甲酰氧基羰基甲氧基、低级-烷氧基羰基-甲氧基、苯基、氨基、低级链烷酰基氨基，低级烷基氨基、N，N-二-低级烷基氨基、羟基、低级链烷酰氧基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基-氨基甲酰基、氰基或硝基；

β)氢；

γ)未取代或卤代-或低级烷基-取代的吡啶基；

δ)N-苄基-吡啶-2-基；萘基；氰基；羧基；低级烷氧基羰基；氨基甲酰基；N-低级烷基氨基甲酰基；N，N-二-低级烷基氨基甲酰基；N-苄基-氨基甲酰基；甲酰基；低级链烷酰基；低级链烯基；低级链烯氧基；或

ε)低级烷基，它被下列基团取代：

εα)卤素、氨基、低级烷基氨基、1-哌嗪基、二-低级烷基氨基，

εβ)未取代的或在苯基部分被下列基团取代的苯氨基：卤素、低级烷基、羟基、低级链烷酰氧基、低级烷氧基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基氨基甲酰基、氰基、氨基、低级链烷酰基氨基、低级烷基氨基、N，N-二-低级基氨基或三氟甲基，

εγ)羟基、低级烷氧基、氰基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基氨基甲酰基、巯基，或

εδ)式R₃-S(O)_m-的基团，其中R₃是低级烷基且m是0、1或2，或者

b)当q是1时，基团R₁和R₂之一是未取代的低级烷基或未取代的苯基而基团R₁和R₂中的另一个具有在上述段落a)中给出的含义之一，但不包括氢，或者

c)R₁和R₂合在一起是C₄-C₁₀-1，4-亚二烯基，它被下列基团取代：氨基、低级链烷酰基氨基、低级烷基氨基、N，N-二-低级烷基氨基、硝基、卤素、羟基、低级链烷酰氧基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基氨基甲酰基或氰基，或者是具有最多9个碳原子的氮杂-1，4-亚二烯基，或者

d)当q是1时，R₁和R₂彼此独立地是未取代的低级烷基或未取代的苯基或具有在上述段落a)中给出的含义之一，并且R₆是氢、低级烷基、低级烷氧羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基或N，N-二-低级烷基氨基甲酰基。

优选以上给出的取代基的定义具有在国际专利申请WO97/02266中描述的含义、特别是其优选的含义。最优选的这些化合物是式VII化合物(VII)

其名为(R)-6-(4-羟基-苯基)-4-[(1-苯乙基)-氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶；或者最优选的

(C)式I的N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物(I)

其中

R₁是吡嗪基、1-甲基-1H-吡咯基、氨基-或氨基-低级烷基-取代的苯基(其中的氨基在每种情况下是游离的、烷基化的或酰化的)、通过5元环碳原子连接的1H-吲哚基或1H-咪唑基或通过环碳原子连接的在氮原子上未取代或被氧取代的未取代或低级烷基取代的吡啶基，

R₂和R₃彼此独立地是氢或低级烷基，

基团R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或两个分别是硝基、氟取代的低级烷氧基或式II的基团

      -N(R₉)-C(＝X)-(Y)_n-R₁₀    (II)，

其中

R₉是氢或低级烷基，

X是氧代、硫代、亚氨基、N-低级烷基-亚氨基、肟基或O-低级烷基-肟基，

Y是氢或NH基团，

n是0或1并且

R₁₀是至少有5个碳原子脂族基团，或是芳族的、芳族-脂族的、环脂族的、环脂族-脂族的、杂环的或杂环-脂族的基团，剩余的基团R₄、R₅、R₆、R₇和R₈彼此独立地是氢、未取代的的或被下列基团取代的低级烷基：游离的或烷基化的氨基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基或吗林基，或是低级链烷酰基、三氟甲基、游离的、醚化或酯化的羟基、游离的、烷基化或酰化的氨基或游离的或酯化的羧基，或含有至少一个成盐基团的该化合物的盐。

优选以上给出的取代基的定义具有在欧洲专利申请EP 0 564 409中描述的含义、特别是其优选的含义。最优选的这些化合物是式III化合物(III)，

其名为4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基]苯基]苯甲酰胺，优选WO99/03854中所描述的甲磺酸盐的形式，最优选WO99/03854中所描述的β-晶体形式的甲磺酸盐。该化合物(甲磺酸盐形式)在下文中被称为STI571。

“能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物”通常是一种碱性或中性的药物，但也可以是酸性药物，特别是选自以下药物：

α-阻滞剂，特别是，麦尼角林或哌唑嗪；

麻醉剂/镇痛药，特别是阿芬他尼、氯胺酮或Ethidocaine；

镇痛药，特别是芬太尼、哌替啶、美沙酮或保泰松；

麻醉剂，特别是布比卡因、依替卡因或苯环己哌啶；

麻醉剂/抗心律失常药，特别是利多卡因或苯环己哌啶；

抗心律失常药，特别是安博律定、丙吡胺、奎尼丁或维拉帕咪；

抗生素，特别是红霉素；

抗凝剂，特别是醋硝香豆素、双嘧达莫、PCR2362(噻吩并吡啶衍生物)、噻氯匹定或华法林；

镇痫剂，特别是苯妥英或卡马西平；

抗炎剂，特别是萘普生；

β-阻滞剂，特别是阿普洛尔、美托洛尔、氧烯洛尔，吲哚洛尔和相关化合物、普萘洛尔或噻吗洛尔；

类固醇，例如黄体酮、去氧皮质酮、氢化可的松、睾酮、雌二醇或泼尼松龙；

神经肌肉的阻滞剂，特别是甲筒箭毒或d-筒箭毒碱；

精神病治疗剂，特别是阿米替林、氯丙嗪、Cyclazindol、去甲丙咪嗪、地西泮、多塞平、氟西泮、氟奋乃静、氟哌啶醇、丙咪嗪、洛沙平、米安舍林、去甲替林、去甲齐美利定、培拉嗪、奋乃静、苯巴比妥、吩噻嗪衍生物、普马嗪、乙酰普马嗪、Protipendyl、硫利达嗪、替沃噻吨、三唑仑、三氟吡啦嗪或齐美利定；

维生素和前维生素，特别是维生素B₁₂或叶酸；

荧光探针，特别是DAPN(普萘洛尔衍生物)、1，8-苯氨基-萘磺酸盐；

其它药物，特别是氨基比林、阿莫沙平、安非他酮、马替普林、诺米芬新、曲唑酮、含有季铵基的药物、利托君、多沙唑嗪、曲马唑嗪、苯奈达林、安吖啶、阿扎丙宗、SKF 525A、苯嘧吲哚、PCR 2362、吲哚美辛、丙磺舒、视黄酸、磺吡酮、托美丁、苯卓洛芬、肝素、舒芬太尼、洛芬太尼、甲氧氯普胺、尼卡地平、吡美诺、米非司酮、RU 42 633、Aprindil、金胺O、苄普地尔、地昔帕明、Desmethyclomipraine、莫沙律定、奎宁、劳卡尼、丙硫喷地、普罗替林、苯海索、比哌立登、甲喹酮、苯海拉明、苯乙哌啶酮、利眠宁、L-色氨酸、甲哌卡因、左旋美沙酮、奥匹派醇、三氟丙嗪或曲米帕明；

增塑剂，例如三-丁氧基乙基磷酸盐(TBEP)；

星形孢菌素(参见US 4,107,297)或星形孢菌素衍生物，优选公开于欧洲专利申请EP 0 296 110和/或EP 0 238 011中的那些，特别是N-苯甲酰星形孢菌素(PTK412-参见欧洲专利申请号EP0 296 110)或7-羟基星形孢菌素(UCN-01-参见欧洲专利申请号EP 0 238 011)；

以及这些化合物的任何一个的代谢物；

或其盐、特别是其可药用盐。

将EP0 238 011、US 4,107,297和EP 0 296 110引入本文作为参考，下列出版物也引入作为参考：Kremer等，Pharmacol.Rev.40卷(1期)，1-47页(1988年)；Cancer Res.58卷，3248-3253页(1998年)；Br.J.Clin.Pharmacol.22卷，499-506页(1986年)；Physio.Functions，和Pharmacol.，321-336页：F.Bree等，“与α₁-酸性糖蛋白的结合以及相关的表观体积分布”，Alan R.Liss Inc.，1989年；蛋白质结合和药物运输(Tillement和Lindenlaub编)：“结合于人类α₁-酸性糖蛋白的药物-聚焦于单一结合位点”，Stuttgart 1986年。在所有这些出版物中均提到了能够结合于AGP的化合物，它是本发明的优选的实施方案。

最优选的是上面提到的非类固醇化合物。对于第二医药用途(例如在已经出现抗药性的病人中，尤其是呈现未成熟细胞危象的CML病人和复发Ph+-ALL病人)，类固醇也是有用的。

除了abl-、PDGF-R-或Kit受体-酪氨酸激酶外，在本发明的联合形式中使用的能够结合到AGP上的有机化合物也可选自一种或多种另外的abl-、PDGF-R-或Kit受体-酪氨酸激酶，也就是说在本发明的实施方案中的组分(b)也可以是这样的化合物。

更可取地，abl-、PDGF-R-和/或kit受体-酪氨酸激酶(组分(a))选自如下化合物：1-(4-氯-苯氨基)-4-(4-吡啶基-甲基)-2，3-二氮杂萘、(R)-6-(4-羟基-苯基)-4-[(1-苯乙基)-氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶和更优选的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基]苯基]-苯甲酰胺；或其盐；更优选4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基]苯基]-苯甲酰胺的甲磺酸盐，最优选记载于WO99/03854中的β-晶体形式。

能够结合到α₁-酸性糖蛋白的有机化合物(组分(b))优选抗生素，特别是红霉素，或星形孢菌素或星形孢菌素衍生物，特别是N-苯甲酰-星形孢菌素(PKC412)或7-羟基-星形孢菌素(UCN-01)或其盐，特别优选红霉素或它的一种可药用盐。

根据本发明，一种或多种酪氨酸激酶抑制剂和能够结合到AGP上的有机化合物能够用在本发明的联合形式或联合治疗中。

结合特别指竟争性结合，但也可能是导致减少abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂结合到AGP上的任何其它形式的结合(例如结合于显示变构效应的结合位点，组分(a)结合于该位点)。该结合可在体外用类似于描述在下面的实施例中的方法测定。

结合可以是不可逆的(例如通过共价的或离子的结合)或优选可逆的。

“能够结合”指该化合物具有对AGP的亲和力，允许进行如上所述的结合，优选半数-最大结合的浓度在毫摩尔到纳摩尔的范围内，特别是在100μM至1nM的范围。

术语“能够通过施用abl-、PDGFR-和/或Kit受体-酪氨酸激酶进行治疗的增殖性疾病”是指文中提到的任何疾病；优选意指对这种化合物有应答的任何疾病；特别是指选自癌症疾病，特别是肿瘤疾病或白血病的增殖性疾病，或非恶性的增殖性疾病，例如动脉粥样硬化、血栓形成、牛皮癣、硬化性皮炎或纤维变性。更优选是指选自CML(慢性骨髓白血病)和ALL(急性淋巴母细胞白血病)或实体瘤的疾病，特别是选自肺癌、特别是非小细胞肺癌和选自前列腺癌的疾病。

术语“对能够通过施用abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的增殖性疾病的联合治疗有效量”优选是指可以在联合时减少引起所提到的任何增殖性疾病的细胞增殖(例如减少肿瘤生长)或，优选地，甚至导致这种细胞的消退，更优选甚至部分或完全消失(例如肿瘤消退，优选治愈)的联合形式中各组分的量。

优选在本发明的实施方案中对联合形式中各组分(组分(a)和(b))的剂量进行选择，从而在组分(a)、即abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂存在时的至少一部分时间内能够在体内达到高于组分(b)、即能够结合于AGP上的有机化合物的半数最大结合浓度的血浆水平。该浓度可以在体外根据标准的步骤确定，例如用类似于实施例中描述的对Ka的测定方法，然而在温血动物(特别指人类病人)中组分(a)和(b)的血浆浓度也可根据常规方法确定。

优选对于组分(b)的剂量进行选择以使在所治疗个体的血浆中，至少在组分(a)也存在的部分时间内，组分(b)的浓度大于0.05μM，更优选大于0.1μM，并且最优选在0.5和100μM之间，特别是1和50μM之间。最优选在所治疗个体的血浆中，至少在组分(a)或组分(b)存在的部分时间内，任何组分(a)和(b)的浓度大于0.1μM，更优选大于1μM，并且最优选在0.5和100μM之间，特别是1和50μM之间。

血浆浓度可以根据标准方法测定，例如根据标准步骤用HPLC测定。

术语“一种产品，它包含(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物，其中如果存在至少一种成盐基团时组分(a)和/或(b)还可以以可药用盐的形式存在，该产品可以不含或含有一种或多种可药用载体物质，其为用于同时使用或在一段时间内按时间先后顺序交错使用的联合制剂形式，所述的时间段对于组分(a)和组分(b)的两种活性化合物来说应足够小以增进化合物(a)对增殖性细胞的抗增殖活性、特别是在病人中，以治疗对这种化合物有应答的增殖性疾病”特指“试剂盒”或“成套的试剂盒”，其中，联合形式中的有效组分(a)和(b)可以彼此独立地给药或者通过使用不同的含有特定量的组分(a)和(b)的固定的联合形式在不同的时间点给药。因此，试剂盒中的各部分可以同时给药，或者按照时间顺序交错给药，也就是说将试剂盒中的各部分在不同的时间点以相同或不同的时间间隔给药，条件是对时间间隔进行选择，从而使各部分的联合使用能够在治疗增殖性疾病时产生大于单独使用组分(a)时所能达到的效果，也就所说，可以观察到比单独施用同样剂量的组分(a)时更强烈的对增殖的抑制作用，或者，优选地，更强烈地引起增殖性疾病的消退甚至治愈。术语“以增进对增殖性细胞的抗增殖活性、特别是在病人中”表达了该意思；更优选地，它的意思是指组分(b)对效果的增强，尤其是增殖性疾病对一种或多种组分(a)型化合物的抗药性的部分或完全地逆转和/或引起增殖性细胞的消退，直至并包括它们的完全消灭。

术语″增殖性细胞″优选意指异常增殖的细胞，例如癌细胞。

优选与单一组分(a)相比较显示增强的抗增殖活性的联合形式，特别是显示协同作用的联合形式(协同的联合形式)或导致增殖性组织的消退和/或增殖性疾病的治愈的联合形式，最优选可以部分或完全克服温血动物、特别是人中的增殖性疾病对一种或多种组分(a)型化合物的抗药性(指在治疗开始时已存在抗药性，或者用组分(a)治疗或长或短的时间所引起的抗药性)的联合形式。

″可药用的载体材料″将在以下药物制剂的定义中进行解释。

在本发明所描述的任何联合形式或联合治疗中，优选使用联合形式来在体内、特别是在温血动物、尤其是人中完全或部分逆转增殖性疾病对用包含一种文中所限定的组分(a)的药物治疗时的抗药性(在治疗前就已存在，或在用包含文中所限定的组分(a)的药物进行治疗的过程中产生或正在产生的)。

完全或部分抗药性尤其是指阻止或延缓增殖、引起肿瘤或白血病的消退或者甚至是治愈等效力低于在未显示抗药性的动物，例如人类中的效力，例如较弱的增殖抑制作用或需要较长的治疗持续时间来达到不存在抗药性时预期能够达到的响应，或者在开始治疗时获得的成功(特别是在仅在用组分(a)治疗的过程中才出现抗药性的患者中)在后来的治疗阶段不再出现，特别是在呈未成熟细胞危象的CML病人和复发的Ph+-ALL病人中。

应当理解，本发明还涉及如上面和下文中所限定的组分(a)组分(b)的联合形式在抑制细胞过度增殖的方法中的应用，包括将过度增殖的细胞与药物制剂或试剂盒形式的产品接触，尤其是治疗增殖性疾病的方法，包括将怀疑患有过度增殖性疾病的个体、所述个体的细胞、组织或体液进行接触。这包括例如在体外处理细胞以便用正常细胞代替有过度增殖性细胞的个体体内的过度增殖性细胞；例如，可以从受治疗者中取出含有免疫系统细胞的血液，在体外用组分(a)和组分(b)进行处理以选择出非过度增殖性细胞，通过例如辐射或化疗破坏掉受治疗者的干细胞和免疫系统的剩余的血细胞，然后将选择出的正常细胞通过例如注射等重新植入到受治疗者体内。在这种处理中用到的方法是本领域技术人员已知的。

在本说明书中提到的任何参考文献均引入本文作为参考，特别是那些在文中标记为优选的段落。

假如存在一种或多种成盐基团，对应于组分(a)和/或(b)的药物也可以盐的形式存在。

盐是尤其为可药用的，例如基本无毒的盐。

这些盐由例如有酸性基团例如羧基、磷酸二酯或硫代磷酸酯基团的化合物形成，并且是例如与合适的碱形成的它们的盐，例如由元素周期表中的Ia、Ib、IIa和Iib族的金属衍生的无毒的金属盐，特别是适宜的碱金属盐，例如锂、钠或钾盐，或碱土金属盐，例如镁或钙盐，还有锌或铵盐，还有那些与有机胺例如未取代或羟基取代的一-、二-或三-烷基胺，特别是一-、二-或三-低级烷基胺形成的盐，或与季铵化合物例如与N-甲基-N-乙胺、二乙胺、三乙胺、一-、二-或三-(2羟基-低级烷基)胺例如一-、二-或三-(2-羟基乙基)胺、2-羟基-叔-丁胺或三(羟甲基)甲胺、N，N-二-低级烷基-N-(羟基-低级烷基)-胺例如N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)-胺或三-(2-羟乙基)-胺或N-甲基-D-葡糖胺形成的盐，或季铵盐，例如四丁铵盐。有碱性基团例如氨基或亚氨基基团的化合物能够形成酸加成盐，例如与无机酸如氢卤酸，例如盐酸、硫酸或磷酸，或与有机羧酸、磺酸、硫代酸或膦酸或N-取代氨基磺酸例如乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、葡糖酸、葡糖二酸、葡糖醛酸、乌头酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、2-苯氧基苯甲酸、2-乙酸基苯甲酸、扑酸、烟酸或异烟酸形成盐，也可与氨基酸例如α-氨基酸形成盐，也可与甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙烷-1，2-二磺酸、苯磺酸、4-甲基苯磺酸、萘-2-磺酸、2-或3-磷酸甘油酸盐、葡萄糖-6-磷酸盐、N-环己氨基磺酸(形成环磺酸盐)或其它酸性有机化合物例如抗坏血酸形成盐。含有酸性和碱性基团的化合物也能形成内盐。如果存在一种以上的成盐基团，也可能存在混合盐。

为分离或纯化目的，也可能使用药用不可接受的盐，例如苦味酸盐或高氯酸盐。

术语″化合物″、″组分″和″盐″也包括单个的化合物或单个的盐。

从本说明书中可以理解，在先前段落中、特别是在以下描述更具体的和更优选的本发明的改变形式的段落中的术语″联合形式″是指

(i)一种联合制剂，它含有(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物；或者，如果存在至少一种成盐基团时，任何组分(a)、(b)或(a)和(b)的可药用盐；

(ii)治疗可以通过施用abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的增殖性疾病的方法，其中，将(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物以对可以通过施用abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的增殖性疾病联合治疗有效的量向哺乳动物联合给药，其中，如果存在至少一种成盐基团时，组分(a)和/或(b)还可以以可药用盐的形式存在。

(iii)一种产品，它包含(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物，其中如果存在至少一种成盐基团时组分(a)和/或(b)还可以以可药用盐的形式存在，该产品可以不含或含有一种或多种可药用载体物质，其为用于同时使用或在一段时间内按时间先后顺序交错使用的联合制剂形式，所述的时间段对于组分(a)和组分(b)的两种活性化合物来说应足够小以增进化合物(a)对增殖性细胞的抗增殖活性、特别是在病人中，以治疗对这种化合物有应答的增殖性疾病。

(iv)一种药物制剂，它包含联合有效量的用于治疗可以通过施用abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的增殖性疾病的(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白上的有机化合物以及一种或多种可药用载体物质，其中，如果存在至少一种成盐基团时，组分(a)和/或(b)还可以以可药用盐的形式存在。

(v)(a)至少一种abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂和(b)至少一种能够结合到α-酸性糖蛋白上的有机化合物的联合形式在生产用作对抗可以通过施用abl-、PDGF-R-和/或Kit受体酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的增殖性疾病的药物制剂中的用途，其中，如果存在至少一种成盐基团时，组分(a)和/或(b)还可以以可药用盐的形式存在；

或本发明的这些主题的任何组合，只要在各自的专利法下是允许的即可；

或以下给出的它们的更具体的和优选的改变形式；

其中，如果存在至少一种成盐基团时，组分(a)和/或(b)也可以以可药用盐的形式存在；

如果不作另外的限定或明显与上下文不同的话。

在下列更优选的本发明实施方案中，更概括的的限定可被上文中或以下给出的(特别是关于药物组合物和使用方法的限定)的更具体的限定所取代。

优选下列物质的联合形式：

(a)至少一种，优选一种选自下列的abl-、PDGF-受体-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂：

(i)式VI的7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶化合物(VI)其中q是0或1，当q是0时n是1到3，或者当q是1时n是0到3，

R是卤素、低级烷基、羟基、低级链烷酰氧基、低级烷氧基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基-氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基-氨基甲酰基、氰基、氨基、低级链烷酰基氨基、低级烷基氨基、N，N-二-低级烷基氨基或三氟甲基，当分子中存在多个基团R时，这些基团可以相同或不同；

a)R₁和R₂彼此独立地是

α)苯基，它被下列基团取代：氨基甲酰基-甲氧基、羧基-甲氧基、苯甲酰氧基羰基甲氧基、低级-烷氧基羰基-甲氧基、苯基、氨基、低级链烷酰基氨基，低级烷基氨基、N，N-二-低级烷基氨基、羟基、低级链烷酰氧基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基-氨基甲酰基、氰基或硝基；

β)氢；

γ)未取代或卤代-或低级烷基-取代的吡啶基；

δ)N-苄基-吡啶-2-基；萘基；氰基；羧基；低级烷氧基羰基；氨基甲酰基；N-低级烷基氨基甲酰基；N，N-二-低级烷基氨基甲酰基；N-苄基-氨基甲酰基；甲酰基；低级链烷酰基；低级链烯基；低级链烯氧基；或

ε)低级烷基，它被下列基团取代：

εα)卤素、氨基、低级烷基氨基、1-哌嗪基、二-低级烷基氨基，

εβ)未取代的或在苯基部分被下列基团取代的苯氨基：卤素、低级烷基、羟基、低级链烷酰氧基、低级烷氧基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基氨基甲酰基、氰基、氨基、低级链烷酰基氨基、低级烷基氨基、N，N-二-低级基氨基或三氟甲基，

εγ)羟基、低级烷氧基、氰基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基氨基甲酰基、巯基，或

εδ)式R₃-S(O)_m-的基团，其中R₃是低级烷基且m是0、1或2，或者

b)当q是1时，基团R₁和R₂之一是未取代的低级烷基或未取代的苯基而基团R₁和R₂中的另一个具有在上述段落a)中给出的含义之一，但不包括氢，或者

c)R₁和R₂合在一起是C₄-C₁₀-1，4-亚二烯基，它被下列基团取代：氨基、低级链烷酰基氨基、低级烷基氨基、N，N-二-低级烷基氨基、硝基、卤素、羟基、低级链烷酰氧基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基氨基甲酰基或氰基，或者是具有最多9个碳原子的氮杂-1，4-亚二烯基，或者

d)当q是1时，R₁和R₂彼此独立地是未取代的低级烷基或未取代的苯基或具有在上述段落a)中给出的含义之一，并且

R₆是氢、低级烷基、低级烷氧羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基或N，N-二-低级烷基氨基甲酰基，

优选以上给出的取代基的定义具有在国际专利申请WO97/02266中描述的含义、特别是其优选的含义，最优选的这些化合物是式VII化合物(VII)

其名为(R)-6-(4-羟基-苯基)-4-[(1-苯乙基)-氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶；

以及

(ii)式I的N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物(I)

其中

R₁是吡嗪基、1-甲基-1H-吡咯基、氨基-或氨基-低级烷基-取代的苯基(其中的氨基在每种情况下是游离的、烷基化的或酰化的)、通过5元环碳原子连接的1H-吲哚基或1H-咪唑基或通过环碳原子连接的在氮原子上未取代或被氧取代的未取代或低级烷基取代的吡啶基，

R₂和R₃彼此独立地是氢或低级烷基，

基团R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或两个分别是硝基、氟取代的低级烷氧基或式II的基团

     -N(R₉)-C(＝X)-(Y)_n-R₁₀    (II)，

其中

R₉是氢或低级烷基，

X是氧代、硫代、亚氨基、N-低级烷基-亚氨基、肟基或O-低级烷基-肟基，

Y是氢或NH基团，

n是0或1并且

R₁₀是至少有5个碳原子的脂族基团，或是芳族的、芳族-脂族的、环脂族的、环脂族-脂族的、杂环的或杂环-脂族的基团，剩余的基团R₄、R₅、R₆、R₇和R₈彼此独立地是氢、未取代的的或被下列基团取代的低级烷基：游离的或烷基化的氨基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基或吗林基，或是低级链烷酰基、三氟甲基、游离的、醚化或酯化的羟基、游离的、烷基化或酰化的氨基或游离的或酯化的羧基，或含有至少一个成盐基团的该化合物的盐(优选以上给出的取代基的定义具有在欧洲专利申请EP 0 564 409中描述的含义、特别是其优选的含义。最优选的这些化合物是式III化合物(III)，

其名为4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基]苯基]苯甲酰胺，优选WO99/03854中所描述的甲磺酸盐的形式，最优选WO99/03854中所描述的β-晶体形式的甲磺酸盐的形式)；

和(b)至少一种(优选一种)选自下列的能够结合到α₁-酸性糖蛋白(AGP)上的有机化合物：

麦尼角林、哌唑嗪、阿芬他尼、氯胺酮、Ethidocaine、芬太尼、哌替啶、美沙酮、苯基保泰松、布比卡因、依替卡因、苯环己哌啶、利多卡因盐酸盐、苯环己哌啶，安博律定、丙吡胺、奎尼丁、维拉帕咪、红霉素、醋硝香豆素、双嘧达莫、PCR2362、噻氯匹定、杀鼠灵、苯妥英、卡马西平、萘普生、阿普洛尔、美托洛尔、氧烯洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、噻吗洛尔、黄体酮、去氧皮质酮、皮质醇、睾酮、雌二醇、脱氢皮醇、甲筒箭毒、d-筒箭毒碱、阿米替林、氯丙嗪、Cyclazindol、去甲丙咪嗪、地西泮、多塞平、氟西泮、氟奋乃静、氟哌啶醇、丙咪嗪、洛沙平、米安舍林、去甲替林，去甲齐美利定、培拉嗪、奋乃静、苯巴比妥、吩噻嗪衍生物、普马嗪、乙酰丙嗪、Protipendyl、硫利达嗪、替沃噻吨、三唑仑、三氟吡啦嗪、齐美利定、维生素B12、叶酸、DAPN、1，8-苯氨基-奈磺酸盐、氨基比林、阿莫沙平、安非他酮、马替普林、诺米芬新、曲唑酮、利托君、多沙唑嗪、曲马唑嗪、苯奈达林、安吖啶、阿扎丙宗、SKF 525A、苯嘧吲哚、PCR 2362、吲哚美辛、4-苯甲酸、视黄酸、磺吡酮、托美丁、苯卓洛芬、肝素、舒芬太尼、洛芬太尼、甲氧氯普胺、尼卡地平、吡美诺、米非司酮、RU 42 633、Aprindil、金胺O、苄普地尔、地昔帕明、Desmethyclomipraine、莫沙律定、奎尼丁、劳卡尼、丙硫喷地、普罗替林、苯海索、比哌立登、甲喹酮、苯海拉明、苯乙哌啶酮、利眠宁、L-色氨酸、甲哌卡因、左旋美沙酮、奥匹派醇、三氟丙嗪、曲米帕明、三-丁氧基乙基磷酸盐、星形孢菌素、N-苯甲酰基-星形孢菌素和7-羟基星形孢菌素；以及这些化合物的代谢物；

其中，如果存在至少一种成盐基团时，组分(a)和/或(b)可以以可药用盐的形式存在。

最优选如下物质的联合形式：(a)至少一种、优选一种abl-、PDGF-受体和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂，它选自：1-(4-氯-苯氨基)-4-(4-吡啶基-甲基)-2，3-二氮杂萘、(R)-6-(4-羟基-苯基)-4-[(1-苯乙基)-氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶和优选的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基]苯基]苯甲酰胺；或一种或多种这些化合物的可药用盐；更优选4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2基氨基)苯基]苯甲酰胺的甲磺酸盐，最优选β-晶体形式；与

(b)至少一种、优选一种能够结合到α₁-酸性糖蛋白上的化合物，它优选是一种抗生素，特别是红霉素，或星形孢菌素或星形孢菌素衍生物，特别是N-苯甲酰基-星形孢菌素或7-羟基-星形孢菌素，或其可药用的盐，尤其是红霉素或其可药用盐。

优选在上述所有实施方案中所治疗的疾病是癌症疾病，特别是白血病或实体瘤，优选选自CML(慢性骨髓白血病)和ALL(急性淋巴母细胞白血病)的疾病，或实体瘤，特别是选自肺癌、尤其是非小细胞肺癌和前列腺癌。

更优选地，本发明的联合形式被用于治疗患有增殖性疾病的温血动物，特别是人类，所述疾病(特别是由于高于正常的AGP水平)是，或者在用abl-、PIDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂治疗的过程中正变得或已变得对这种治疗具有完全或部分的抗药性，这种温血动物代表了一组特殊的受试者。

在本发明的另一优选实施方案中，该联合形式的应用对象是温血动物，特别是人类，以预防性地避免在用abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂治疗增殖性疾病的过程中出现部分或完全的抗药性。

药物组合物(＝制剂)和制作法：

当下文中提到″组分(a)和/或(b)″时，是指以上作为组分(a)和组分(b)定义的一种或多种化合物或一种或多种各自组分的可药用盐。

能够用于本发明的联合形式的药物组合物含有一种或多种具有作为本发明的活性成分特征的组分(a)和(b)。该联合形式能够单独使用(例如作为固定的联合形式)或者作为成套的试剂盒使用。特别优选的是用于肠内、尤其是口服施用的或胃肠外施用的组合物。该组合物含有一种或多种组分(a)和(b)它们的联合形式，或者，更优选地，还含有可药用载体。各活性成分的剂量取决于所治疗的疾病和物种、年龄、体重和个体条件以及施用方法。

优选的是这样的药物组合物或联合形式，它适于向患有文中所提到的任何疾病的温血动物，特别是人类给药；优选的任何疾病是指对abl-、PDGF-R-和/或Kit受体-酪氨酸激酶抑制剂有应答的疾病，特别是指增殖性疾病，其选自癌症、特别是肿瘤疾病或白血病，或非恶性的增殖性疾病，例如动脉粥样硬化、血栓形成、牛皮癣、硬化性皮炎或纤维变性；更优选指选自CML(慢性骨髓白血病)和ALL(急性淋巴母细胞白血病)或实体瘤的疾病，特别是选自肺癌，尤其是非-小细胞肺癌和前列腺癌；最优选是指刚提到的任何一种疾病，它已变得或正在变得对使用一种或多种所提到酪氨酸激酶抑制剂的治疗具有抗药性，或在用这种酪氨酸激酶抑制剂治疗之前就已经具有抗药性，特别是由于在所治疗的个体的血浆中存在高的AGP浓度。

药物组合物含有大约0.0001％到大约95％的组分(a)和/或(b)，单一剂量形式的剂型优选含有从大约10％到大约90％的组分(a)或(b)，而非单一剂量形式的剂型优选含有从大约10％到大约60％的每一组分。单位剂量形式，例如糖衣片、片剂、安瓿或胶囊，含有从大约5毫克到大约1.5克的组分(a)和/或组分(b)，优选从5毫克到大约1克。

药物组合物通过本身已知的方式制备，例如通过传统的混合、制粒、成型、溶解或冻干过程的方法。例如，用于口服给药的药物组合物可以通过将组分(a)和/或(b)与一种或多种固体或液体载体相混合而制得，如需要，将形成的混合物制粒并将混合物或颗粒分别加工成片剂或糖衣片芯或溶液，如果需要，可加入其它赋形剂。

适宜的载体是填充剂，例如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖醇，纤维素制备物和/或磷酸钙，例如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及粘合剂，例如淀粉，例如玉米、小麦、大米或马铃薯淀粉、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷酮，和/或，如果需要，崩解剂，例如上面提到的淀粉，以及羧甲基淀粉、交联的聚乙烯基吡咯烷酮或藻酸或它的盐，例如藻酸钠。另外的赋形剂是流动调节剂和润滑剂，例如硅酸、滑石、硬脂酸或它的盐，例如硬脂酸镁或钙盐，和/或聚乙二醇，或它的衍生物。

糖衣片芯可以带有合适的、肠溶或非肠溶的包衣，可以使用包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛的浓缩糖溶液、或在合适的有机溶剂或溶剂混合物中的包衣溶液，或者，用于制备肠溶包衣的适宜的纤维素制备物例如邻苯二甲酸乙酰纤维素或邻苯二甲酸羟丙甲基纤维素的溶液。在片剂或糖衣片的包衣中可以添加染料或色素，例如，用于辨别的目的或者用于指示活性成分的不同剂量。

口服给药的药物组合物还可以是干法填充的由明胶组成的胶囊，也可以是由明胶和增塑剂例如甘油和山梨醇组成的软的密封胶囊。干法填充的胶囊可以包含粒状的组分(a)和/或(b)，例如与填料如玉米淀粉、粘合剂和/或助流剂例如滑石或硬脂酸镁，以及，如果适当的话，稳定剂(参见上面的″适宜的载体″)的混合物。在软胶囊中，活性成分优选被溶解或悬浮在合适的液体赋形剂中，例如脂肪油、^Lauroglycol(GattefosséS.A.，SaintPriest，法国)、^Gelucire(GattefosséS.A.，Saint Priest，法国)或芝麻油、石蜡油或液体聚乙二醇，例如PEG 300或400(Fluka，瑞士)或聚丙二醇，也可向其每一个中添加稳定剂或洗涤剂，也可以溶解或悬浮在含有其它上述可溶性载体例如甲基纤维素或甘露糖醇的水中。

其它口服给药形式是，例如，以常规方式制备的溶液或糖浆，其含有悬浮形式的组分(a)和/或(b)，其浓度大约为0.001％至20％、优选大约0.001％至大约2％，或是在给药时(例如，0.5至10毫升的量计)可以提供适宜的单一剂量的类似浓度。还可以是用于在牛奶中制备振摇剂的粉末或液体浓缩物。这种浓缩物还可以以单一剂量的量进行包装。

还可以采用经皮给药系统，特别是对于中性的活性成分。适宜的制剂包含例如，大约0.0001％至大约2％重量的组分(a)和/或(b)。在一个优选的方面，本发明提供了包含大约2％至99.9999％(或用于达到100％的余量)短链脂族醇的制剂。适宜的醇包括乙醇、异丙醇、丙二醇和甘油。在一更优选的方面，这些制剂还可另外含有助流动剂。合适的助流动剂包括，例如，癸基甲基亚砜、二甲基亚砜以及环酮、内酯、酐和酯。其中的一些助流动剂还能增加组分(a)和/或(b)的滞留，从而增加其在皮肤本身的浓度。对用于直接(局部)治疗、例如局部应用于皮肤的制剂，优选使用不仅可以使透皮流量最大化而且还能增加组分(a)和/或(b)在皮肤中滞留的助流动剂。已报道了一些环酮和内酯增强剂也可以增加局部滞留，从而构成了一类优选的用于组分(a)和/或(b)局部给药的增强剂。在用于全身性治疗的制剂中，优选使用能使活性成分的流量最大化并具有最小的局部滞留作用的助流动剂。

适宜的直肠给药的药物组合物是，例如，由活性成分的联合形式和栓剂基质组成的栓剂。适宜的栓剂基质是，例如天然的或合成的甘油三酯、石蜡烃、聚乙二醇或高级链烷醇。

适于胃肠外给药的是水溶性形式、例如水溶性盐形式的活性成分的水溶液，其中可以含不不含盐例如氯化钠和/或糖醇，例如甘露糖醇，或是含有增加粘度的物质例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖以及适宜的稳定剂的含水注射悬浮液。组分(a)和/或(b)，如果合适的话和赋形剂一起，还可以是冻干物的形式，并可以在胃肠外给药前通过添加合适的溶剂制成溶液。

用于例如胃肠外给药的溶液也可用作输注液。

包含组分(b)的优选制剂是那些常规用于属于本领域已知化合物的一种或多种物质的各自的临床应用的制剂。

组分(a)的优选制剂是那些在实施例中提到的制剂。

本发明还涉及治疗上面提到的病理状况的方法。为此，将组分(a)和/或(b)或其可药用盐以上文中描述的联合形式向需要这种治疗的温血动物，例如人预防性地或治疗性地给药，优选以对所提到疾病有效的量给药，并且优选以药物组合物的形式给药。组分(a)和/或(b)的剂量取决于所治疗的温血动物的种类、其体重、年龄和个体状况、个体药物动力学情况、所治疗的疾病和给药途径。优选地，对于大约70公斤的体重，组分(a)和/或(b)的任何一种的每日给药剂量为10毫克至2500毫克，优选大约50毫克至大约2000毫克，首选大约100毫克至大约1500毫克。儿童接受相应较低的剂量，这取决于他们的皮肤表面积(一个70公斤的成年人的皮肤表面积的参考值为1.73m²)。

本发明可通过下列实施例加以阐明，该实施例不是意图限制本发明的范围而是只作为例证的实施方案：

实施例：

引言

由于其增强的和组成的酪氨酸激酶活性，BCR/ABL致癌融合基因编码引起三种不同疾病的杂种bcr/abl蛋白：慢性骨髓白血病(CML)、部分急性淋巴母细胞白血病(ALL)和部分急性骨髓白血病(AML)。

对bcr/abl激酶活性的阻断代表了一种革新的和理性的策略，它用于治疗CML和这种致癌融合蛋白引起的其它癌症(Druker BJ等：Abl酪氨酸激酶选择性抑制剂对Bcr/Abl阳性细胞生长的影响。Nat.Med.2卷：561-6页，1996年)。

STI571(以前称为CGP57148)代表一种有活性的和相对特异性的bcr/abl激酶活性抑制剂。STI571可以阻止增殖和在体外诱导BCR/ABL+细胞的细胞凋亡；它抑制从CML病人中获得的克隆源性骨髓细胞的生长，并能在体内根除白血病细胞的生长。在体内STI571的活性被调节以达到稳定的和连续的bcr/abl抑制，这需要在被研究的小鼠模型中每天多次给药(leCoutre等，国家癌研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)91卷，163-168页，(1999))。

基于这个和其他的信息，STI571目前正在起始临床试验中在CML和其它BCR/ABL-相关疾病中进行测试。关于可能出现对STI571的抗药性的信息非常有限。已选择两种细胞系来研究在体外对STI571的抗药性(leCoutre P等，血液90卷：496a页，1997)。一方面虽然它的抗药性机制未知，但另一方面它涉及到BCR/ABL的扩增和蛋白质的过量表达。然而这些体外选择的亚系的生物学相关性有待于建立，因为体外选择条件是不同的而且通常比在体内的情况更严格。

无法得到关于在体内对STI571抗药性的产生和特征的信息。在我们先前描述的小鼠模型中(le Coutre P等，国家癌研究所杂志91卷，163-168页，1999年)，当在白血病细胞注射后延迟一周进行治疗并且显著的肿瘤团已经存在时，在有些动物中观察到治疗的失败。所以这种模型能够可用于研究和刻划在体内可能出现的对STI571抗药性的特征。

这里，建立了在体内对STI571的抗药性的模型。这种模型的分子特征以及克服出现抗药性策略也被识别并以试验证实。

材料和方法

STI571

STI571(以前称为CGP57148B)按照EP 0 564 409和WO 99/03854中的描述制得。用蒸馏水制备成1和10mM的用于体外试验的该化合物的储备溶液，过滤并于-20℃下存放，在试验开始前将储备溶液融化并以0.1-10μM的浓度使用。用于动物试验的制剂每天以16毫克/毫升的浓度制备并溶解于水或5％甲基纤维素溶液(Methocell，Fluka)中并于4℃下保存。

红霉素

使用红霉素碱(Sigma)进行体外试验。在每次试验之前制备浓度为20mM新的储备溶液并以1-100μM的浓度应用。将红霉素溶解于乙醇并进一步用蒸馏水稀释。对于体内试验，使用浓度为35毫克/毫升5％甲基纤维素溶液的无味红霉素(供货商：Gist-Brocades Italy SPA，Capua，Italy)，STI571的浓度为16毫克/毫升。

体内施用STI571

将购自Chales River Breedin实验室(Calco，Italy)的7至9周龄的雌性CDl nu/nu小鼠根据意大利米兰的国家癌症研究所的实验准则在标准实验条件饲养。这项研究被研究所伦理委员会批准在试验研究中使用实验动物。将KKU812 bcr/abl阳性细胞系皮下注射(每一动物50×10⁶细胞)于动物的左肋腹。通过连接于导入食管的软塑料管注射器进行口服给药(管饲法)。每3-4天监测肿瘤重量(TW)和总重量。通过公式TW[毫克]＝(d²×D)计算TW，其中d和D分别是肿瘤的最短的和最长的直径，测量单位为毫米。治疗开始于白血病细胞注射1-15天后。

细胞系

使用Bcr/Abl阳性人类白血病细胞系KU812(参见Kishi K.一种费城染色体具有嗜碱性前体特征的新的白血病细胞系。白血病研究9卷：381-90页，1985年)。KU812系从呈现未成熟细胞危象的CML病人中获得，且在标准细胞培养条件下维持于补充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640(Bio Whittaker Europe)中。

细胞系KU812可以通过德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlungfur Mikroorganismen undZellkul turen，DSMZ)，Mascheroder Weg，Braunschweig，德国得到，登记注册号为DSMZ No：ACC 378。

在下面描述的试验中可能使用的其它类似细胞系是

细胞系：BV-173(细胞型：人类B细胞前体白血病)DSMZ No：ACC 20；

细胞系：K-562(细胞型：呈现未成熟细胞危象的人类慢性骨髓白血病)DSMZ No：ACC 10；

细胞系：LAMA-84(细胞型：呈现未成熟细胞危象的人类慢性骨髓白血病)DSMZ No：ACC 168；

细胞系：EM-3(细胞型：  呈现未成熟细胞危象的人类慢性骨髓白血病)DSMZ No：ACC 134；

细胞系：MEG-01(细胞型：呈现巨核细胞危象的人类慢性骨髓白血病)DSMZ No：ACC 364；或

细胞系：NALM-1(细胞型：呈现未成熟细胞危象的人类慢性骨髓白血病)DSMZ No：ACC 131。

体外增殖活性的测定(氚标记的胸苷[³HtdR]摄取法)

将200微升含有104个细胞的各细胞系(KU 812，LAMA 84)在从0至10μM的不同浓度的STI 571下一式六份接种在96孔微量滴定板(CorningCostar Corp.，Cambrige，MA)中。37℃下54小时后，向各孔中加入20μl含有氚标记的胸苷(1μCi/孔)的RPMI 1640+10％FCS。再经18小时后，收获细胞并转移到一过滤器(Spot-on filtermat，Pharmacia BiotechEurope，布鲁塞尔，比利时)中。通过1205β平板液体闪烁计数器(WallacInc.，Turku，芬兰)测定氚标记的胸苷摄取。IC₅₀(抑制浓度50)定义为与未处理的对照相比使增殖降低50％所需的化合物浓度。

蛋白质印迹分析

如以前所述进行免疫印迹分析(Gambacorti-Passerini C等：血液细胞、分子与疾病(Blood Cells，Molecules，and Diseases)，23卷，380-94页，1997年)。用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次并接着在200μl的1×Laemmli′s缓冲液(50mM Tris-HCI pH6.8，2％SDS，0.1％溴酚蓝、10％甘油、5％β-巯基乙醇)中裂解。将相当于90,000-150,000个细胞的细胞裂解物在95℃煮10分钟，超声处理1分钟然后用7.5％聚丙烯酰胺凝胶进行SDS凝胶电泳分析。用相应的小鼠单克隆抗体或兔抗血清检测内源的bcr/abi、酪氨酸磷酸化的bcr/abi和内源肌动蛋白，然后用辣根过氧化物酶联山羊抗-小鼠或抗-兔免疫球蛋白G作为二级抗体(AmershamCorp.)增强化学发光检测(ECL，Amersham Corp.)进行显示。单克隆抗-abl抗体(克隆Ab-3)购自Calbiochem公司。单克隆抗-磷酸酪氨酸抗体(克隆4G10)购自Upstate Biotechnology公司。兔多克隆抗-肌动蛋白购自Sigma公司。用Eagle Eye 11光密度计(Stratagene公司)进行光密度分析，用bcr/abl和肌动蛋白表达水平将酪氨酸-磷酸化的bcr/abl带的强度标准化。

AGP测定

α₁-酸性糖蛋白(AGP)血清水平通过免疫扩散或等电聚焦方法检测。对于免疫扩散，将5.0μl的各样品被置于入含有AGP抗血清的琼脂平板(SRID，单一辐射免疫扩散平板试验，Cardiotech Services JINICLouisville，1 KY，美国)的小孔中。将该平板在37℃保温24小时。通过沉淀素环的大小测定样品中AGP的特异量，并通过与随每一试验试剂盒供应的1000、250和125μg/ml的标准相比较进行测定。进行重复测定。对于等电聚焦，将pH2.5-5范围的IPG(固定化pH梯度)(Gianazza，E.，Celentano，F.，Ettori，C.，Righetti，P.G.，固定化pH梯度：理论和方法论。电泳(Electrophoresis)，1989年，10卷，806-808页)投到含有固定化电介质pK1，3mM，pK3.6，11.83mM，pK9.3，0.76mM和12.9mM Tris的酸性溶液和含有固定化电介质pK3.6，9.28mM，pK4.6，9.50mM和pK9.3，16.13mM(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)的碱性溶液两者之间。聚合以后，将该凝胶用1％甘油洗涤3次，干燥然后在8M脲-0.5％载体两性电解质、pH范围2.5-5(Pharmacia)中再水化。接着，将7.5μl血清等分试样用2％2-巯基乙醇稀释到25μl，然后在阴极附近上样。以55V/cm电泳过夜后，将样品以165V/cm聚焦90分钟。将蛋白带型用考马斯亮蓝染色。

结合参数的估计

将血浆或纯化的人类AGP(Sigma)或白蛋白(用PBS稀释)在室温下与不同浓度的STI571保温30分钟。STI571浓度通过HPLC测定，其检测的下限为0.1μM。通过截止值为30KD的超滤测定游离的STI571。构建改进的Scatchard图。缔合常数(Ka)按以前的描述进行计算(Fuse E，Tanii H，Kurata N等，癌研究，58卷，3248-53页，1998年)。

统计分析

用Fisher精确试验或T Student、使用Prism分析程序进行统计分析。对残存分析，将数据用logrank试验进行比较。P值＜0.05被认为具有统计学意义并且由双侧的统计试验得到。

实施例1：STI571效能与起始肿瘤负载有关

向裸鼠皮下注射5千万个KU812细胞。治疗分别于1、8和15天后、在存在大约5千万、3亿和10亿白血病细胞的条件下开始(I至III组)。虽然在所有的组中均观察到肿瘤消退，但只在前两组获得治愈。图1A显示代表性试验的结果。虽然组I中的所有动物均能可重现地治愈，而II组的小鼠发生了复发，复发率在33％和40％之间；在III组中未观察到治愈。复发通常发生在治疗中断1至3周后。图1B代表3种不同试验的联合结果。在治疗开始时肿瘤的存在量和治疗结果两者间存在明确的相关性。对这些结果一种可能的解释是在II和III组中STI571施用的时间不够长。为检验该假设，对III组中的小鼠治疗11或18天。代表性试验的结果显示于图1C，它指出增加治疗持续时间不会改善治愈率。这些结果指出在这种模型中用STI571的治疗只能治愈在治疗的最初11天内便能根除肿瘤的动物。如果这不出现，便不能达到治愈，即使较长时间地接触该化合物也是如此。也就是说：一些类型的抗药性已经出现。

实施例2：复发肿瘤显示出体内抗药性但保留对STI571的体外敏感性

将显示复发肿瘤的动物用同样的STI571治疗程序(11天的给药方案)再进行治疗。在当肿瘤又变明显时即开始治疗。图2显示了一种代表性的试验。明显的，复发肿瘤对新的处理微弱响应、并最终开始了与未治疗动物的肿瘤(破折号线)相似的生长。虽然白血病细胞在体内对STI571具抗药性，但它们对STI571的内在敏感性尚未知晓。为调查这个问题，将肿瘤从抗药性动物中切下，制备细胞悬浮液并将细胞置于培养液中并如以前描述的那样在24-48小时内测定对STI571的体外敏感性(le Coutre P等，国家癌研究所杂志91卷，163-168页，1999年)。图3代表从两个这样的肿瘤中获得的结果。显然，从抗药性动物中获得的白血病细胞保留了它们对STI571的敏感性，因为它们的IC₅₀与亲代KU812细胞系的IC₅₀没有不同。这些结果引导我们去评价施用STI571是否还可以抑制bcr/abl蛋白激酶活性。为了这个目的进行了分子药物动力学试验(描述于：le Coutre P等，国家癌研究所杂志91卷，163-168页，1999年)，以调查在未进行预处理动物体内或在开始治疗后复发并对第二轮施用STI571有抗药性的小鼠体内Bcr/Abl抑制的程度和持续时间。对负载肿瘤小鼠进行急性处理且在2和4小时宰杀。在一代表性试验中得到的Bcr/Abl激酶活性(以自体磷酸化作用进行测定)的水平示于图4中。虽然未进行预处理的小鼠在2和4小时(4和6泳道)其bcr/abl磷酸化显示前面报道的抑制，对STI571具抗药性的复发动物则不被处理所抑制(3和5泳道)。这些试验表明复发小鼠对进一步的治疗有抗药性且在这种情况下未达到对bcr/abl激酶活性的抑制。然而白血病细胞保留了其对STI571的体外敏感性。

实施例3：在复发的小鼠中STI571的血浆水平

对上述报道的结果的一种可能的解释存在于在预处理的动物中的增加的STI571的代谢，以及导致的低的STI571血浆水平。为调查这个问题，将用STI571预处理或未进行预处理(对照)的负载肿瘤小鼠在用STI571急性处理0.5、2.0和5.0小时后宰杀并用HPLC测定血浆STI571总浓度。结果呈现在图5中。对照和预处理动物在30分钟时达到相似的血浆水平，与预处理小鼠(p＜0.01)相比，STI571水平在对照动物中下降得更快。肿瘤内的浓度显示出相反的情况，预处理动物的肿瘤在所有时间点均含有较低的STI571浓度，这种现象在5小时的时间点达到统计学意义。这些结果不能证实我们的假设，并且甚至显示在其血液中抗药性动物维持高的STI571浓度达一较长的时间。这些数据与在抗药性小鼠的血液中存在一种能够结合和降低STI571清除率和生物活性的“因子”相一致。

实施例4：α₁-酸性糖蛋白(AGP)结合STI571并抑制它的效果

能结合药物的两种血浆蛋白是白蛋白和AGP。AGP倾向于结合碱性分子(Kremer等，在健康和疾病状态下结合于人类α₁-酸性糖蛋白的药物，药理学评论40卷，1-47页，1988年)。用KU812细胞在体外评价AGP对STI571的生物活性的影响。由于不能得到足够大量的用于该类型实验(Fuse E等，癌研究58卷，3248-53页，1998年)的小鼠AGP，因此使用了人类AGP。一个代表性试验的结果呈现在图6A中。显然AGP抑制了STI571的活性(以IC₅₀计量)；这种效果与AGP浓度成正比。IC₅₀从不存在AGP时的正常的0.05μM(Gambacorti-Passerini C等，血液细胞、分子与疾病23卷，380-94页，1997年)增加到AGP浓度为2mg/ml时的大于3.0μM。在另一个实验中，计算出在2.0mg/ml AGP下的IC₅₀值为4.5μM(数据未显示)。白蛋白并不明显地增加STI571的IC₅₀，甚至在50mg/ml时(图6B)。所以，是AGP而非白蛋白可以增加STI571的IC₅₀，使其比在对照中高90倍。

由于观察到了AGP的抑制效果，因此计算了STI571对AGP的和白蛋白的缔合常数(Ka)。为此，将固定量的AGP(5μM)与不同浓度的STI571一起保温并用超滤评估未结合药物的量(游离部分)。绘制AGP和白蛋白两者的Scatchard曲线。在AGP的情况下，测得的值为8.7升/摩尔，它比计算出的对白蛋白的Ka(0.15)高出大约60倍。这些结果指出虽然白蛋白和AGP两者均能结合STI571，但后者结合STI571的亲和力较高，结果抑制了STI571的生物活性。

为证实上面提到的结果，将KU812细胞在体外用含有不同量AGP的血清攻击。图7代表一代表性的实验，其中，分别向KU812培养物(对照：0％血清；菱形)中添加了含有130μg/ml AGP(三角形)和1150μg/ml AGP(正方形)的血清(终浓度15％)。显然，STI571活性的抑制与各血清样品中的AGP含量有关。培养物中存在的血清百分比的变化引起了其抑制活性成比例的增加或降低(未显示)。可推断出AGP能够结合STI571，这种结合有重要的生物结果并阻止STI571对Bcr/Abl激酶酶活性的抑制能力。

实施例5：AGP血清水平、肿瘤负载和STI571处理之间的关系

先前给出的结果指出，AGP，一种可诱导的血浆蛋白，强有力地在体外抑制STI571活性。通过免疫扩散在不同疾病阶段的裸鼠中测定AGP的血浆水平，以评价是否那些值能够与KU812白血病细胞对STI571治疗的体内敏感性有关。图8A显示了在不同疾病阶段小鼠中的AGP值。在小鼠中的AGP基值非常低(96±21μg/ml)。AGP浓度的升高与肿瘤负载的存在成正比。肿瘤负载量大约200毫克(相当于大约2亿个白血病细胞)的小鼠显示AGP值(383±131μg/毫升)增加四倍，而负载0.8-1克肿瘤的小鼠显示AGP值超过1毫克/毫升(1580±234μg/毫升)。存在被治愈的明显肿瘤的动物显示出在AGP浓度上逐渐地减小且在4-8周内恢复到正常水平。用纯化的AGP进行的实验指出在正常的小鼠和负载大肿瘤的动物两者中观察到的AGP浓度的变化导致AGP-结合的STI571部分从42％变到大于99％(未显示)。有趣的是，用STI571治疗(160毫克/公斤，口服11天)也产生低的但具有统计学意义的AGP值的增加(213±43μg/ml)。在负载肿瘤小鼠中增加的AGP水平也可通过等电聚焦得到证明(图8B)。这些结果合在一起显示肿瘤负载(以及STI571预处理，但程度较小)可以诱导AGP，一种血浆蛋白，的合成，反过来，它能结合并灭活STI571。

实施例6：红霉素，一种AGP的结合剂，能够在体外解除AGP-介导的对STI571活性的阻断

(a)已知包括红霉素(Kremer等，药理学评论40卷，1-47页，1988年)在内的几种药物能够结合AGP。如果AGP阻断STI571的机制是通过AGP结合到STI571所介导的，那么能够结合AGP的第三个分子便可以与STI571对AGP的结合相竞争，这样使得更多的STI571可以发挥生物学活性。为证实这一假设，将红霉素以5至30μM添加到含有STI571(1μM)、AGP(1毫克/毫升)、或STI571(1μM)和AGP(1毫克/毫升)的KU812培养物中。一个代表性实验的结果示于图9中(STI单独：正方形；AGP单独：三角形；STI和AGP：菱形)。红霉素以明确的剂量响应关系恢复对STI571的敏感性。在不存在AGP时红霉素不改变STI571的IC₅₀，因此排除了对STI571抗-白血病效果的直接影响(未显示)。

(b)红霉素对STI571-介导的阻断bcr/abl激酶活性的影响也进行评估(图10)。将KU812细胞在体外用STI571、AGP和红霉素进行处理，在37℃保温1小时然后裂解；接着用抗-磷酸酪氨酸抗体评估激酶的活性。图10显示AGP抑制STI571的活性。STI571活性能够通过添加红霉素得到恢复。

试验(a)和(b)用两不同的试验提供了红霉素能在体外恢复STI571敏感性的证据。

实施例7：施用红霉素和用STI571预处理的体内效果

(a)已经证实了AGP的抑制效果和它可以在体外被红霉素逆转，我们以实验证实在体内AGP值的或其结合能力的调节。向小鼠注射KU812细胞并在11天后、在存在肿瘤负载大约400毫克时开始治疗。在这种情况下，标准的STI571治疗的治愈希望很小或没有希望。将小鼠用STI571(160毫克/公斤，口服，每8小时一次)单独治疗或与无味红霉素(350毫克/公斤，每8小时一次)联合治疗18天。选择无味红霉素制剂是因为以前证实它在小鼠中具有良好的口服生物利用度，选择的剂量预期可以产生高于20μM的峰浓度。如在图11A中所举例说明的，联合治疗在第6天和从第16天往后产生了明显较高的肿瘤减小。值得注意的是，在接受联合治疗的小鼠中肿瘤的消退是渐进的，在治疗的最后几天在只用STI571治疗的组中有些肿瘤开始再生长。当比较两组的治愈率时(图11B)，添加红霉素对STI571的影响更为明显。在单独接受STI571的组中，5/15动物显示肿瘤的消失。然而有4只动物在第25天和第40天之间复发，只有1/13的动物在120天时被治愈(随访的最后一天)。在接受红霉素/STI571联合治疗的组中，在第30天14/15小鼠变得无肿瘤，并且只有1只动物复发。所以，10/12的动物被联合治疗治愈；该值与在只经STI571治疗的组中获得的值(1/13)显著不同的(p＜0.01)。单独接受红霉素的对照组未显示任何肿瘤消退的迹象(未显示)。

(b)STI571预处理的生物学效果也进行了评估。不对小鼠进行预处理或用STI571预处理14天，注射KU812细胞然后用STI571(160毫克/公斤，每8小时一次，治疗11天)进行治疗，治疗开始于白血病细胞注射24小时后。在这些情况下，预期100％的动物可被STI571治愈。结果呈现在图12中。在对照组(未进行预处理的小鼠)中0/14的动物发生了肿瘤生长。在预处理的组中，在7/14的动物中出现了肿瘤生长(p＜0.05)，这表明与预先用STI571处理有关的AGP增加也能产生显著的生物学效果。这些结果加在一起支持AGP对STI571的治疗活性呈现负性影响的实验证据；它们也提示并通过实验部分证实了通过使用能够和STI571竞争性地与AGP结合的分子来避免由AGP介导的体内抗药性的策略。

实施例8：含有4-[(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐β-晶体形式的片剂

含有100毫克标题中所命名的活性物质的片剂通常按下列组成制备：

    组成

    活性成分            100mg

    晶体乳糖            240mg

    Avice               l80mg

    PVPPXL              20mg

    Aerosil             2mg

    硬脂酸镁            5mg

                        447mg

制备物：将活性物质与载体材料混合并用压片机(Korsch EKO，冲压直径10mm)压成片剂。

Avicel是微晶纤维素(FMC，Philadelphia，美国)。

PVPPXL是交联的聚乙烯基聚吡咯烷酮(BASF，德国)。

Aerosil是二氧化硅(Degussa，德国)。

实施例9：含有4-[(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐β-晶体形式的胶囊

含有100毫克标题中所命名的化合物作活性物质的胶囊通常按下列组成制备：

    组成

    活性成分           100mg

    Avicel             200mg

    PVPPXL             15mg

    Aerosil            2mg

    硬脂酸镁        1.5mg 

                     318.5mg

胶囊的制备：将各组分混合然后将混合物填入1号硬明胶胶囊中。PVPPXL＝交联聚维酮XL(参见实施例10)。

实施例10：含有4-[(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐β-晶体形式的胶囊

交联聚维酮XL：交联的聚维酮＝水不溶性交联的N-乙烯基-2-吡咯烷酮均聚物。

Aerosil 200：纯硅胶(表面积按BET 200±25m²/g。平均颗粒大小12nm)。

Avicel：微晶纤维素。

用于填充100、50和25mg胶囊的胶囊填料的组成是相同的。不同的剂量大小仅仅是通过改变胶囊的填充重量来达到的。所用的胶囊大小是，100mg为1号，50mg为3号，25mg为4号。表1：胶囊的组成(每批的用量[kg])

赋形剂百分比100mg 50mg 25mgβ-晶体形式的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐51.96119.50 59.75 29.875Avicel PH 10240.0092.00 46.00 23.000交联聚维酮XL6.5215.00 7.50 3.750Aerosil 2000.872.00 1.00 0.500硬脂酸镁0.651.50 0.75 0.375总计100.00230.00 115.00 57.50胶囊大小1 3 4表2：成分  百分比100mg50mg  每批的量(％)每批的量(kg)每批的量(kg)β-晶体形式的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐  51.9618.2249.112纤维素MK GR  40.0014.0307.015交联聚维酮XL  6.522.2881.144Aerosil 200  0.870.3050.153硬脂酸镁  0.650.2280.114总计  100.0035.07517.538胶囊大小13胶囊量152｀500152｀500实施例11：典型的红霉素制剂的组成

在这里可以使用红霉素的任何已知的标准制剂。

表3中列出了无味红霉素制剂的一个例子。表3：(每批的用量[kg])

赋形剂百分比 100mg 50mg 25mg无味红霉素51.96 119.50 59.75 29.875Avicel PH 10240.00 92.00 46.00 23.000交联聚维酮XL6.52 15.00 7.50 3.750Aerosil 2000.87 2.00 1.00 0.500硬脂酸镁0.65 1.50 0.75 0.375总计100.00 230.00 115.00 57.50实施例12：可能的含有红霉素和STI571的复方组合物表4：(每批的用量[kg])赋形剂百分比 100mg 50mg 25mgβ-晶体形式的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐25.98 59.75 29.875 14.9375无味红霉素25.98 59.75 29.875 14.9375Avicel PH 10240.00 92.00 46.00 23.000交联聚维酮XL6.52 15.00 7.50 3.750Aerosil 2000.87 2.00 1.00 0.500硬脂酸镁0.65 1.50 0.75 0.375总计100.00 230.00 115.00 57.50