表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)及EGFR单克隆抗体联合治疗非小细胞肺癌的研究

摘要

目的:
　　 肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌约占肺癌的80％，虽然手术、化放疗等治疗手段在肺癌的治疗中广泛应用，但其疗效仍然令人失望。近年来出现的以EGFR为靶点的靶向治疗使部分患者生存率明显提高，尤其对于EGFR外显子19、21突变阳性的非小细胞肺癌患者EGFR-TKI明显有效，但目前对于EGFR突变阴性和EGFRT790M突变的继发性耐药的非小细胞肺癌患者没有有效的治疗方法。本研究通过EGFR-TKI和EGFR单克隆抗体联合应用探讨治疗EGFR突变阴性和EGFRT790M突变继发性耐药的NSCLC的疗效。
　　 方法:
　　 体外实验：以EGFR-TKI和EGFR单克隆抗体单独或联合应用对EGFR突变阴性（A549，LTEP）和EGFRT790M突变继发性耐药（H1975）的非小细胞肺癌细胞系应用MTT法测定细胞增殖，同时应用流氏细胞仪Annexin V-FITC法检测EGFR-TKI和EGFR单克隆抗体单独和联合应用对EGFR突变阴性（A549，LTEP）和EGFRT790M突变继发性耐药（H1975）的非小细胞肺癌细胞系的凋亡率，体内实验：对于接种了EGFR突变阴性（A549，LTEP）和EGFRT790M突变继发性耐药（H1975）的非小细胞肺癌细胞系的裸鼠移植瘤给予EGFR-TKI和EGFR单克隆抗体单独和联合治疗。应用免疫组化法检测EGFRT790M突变继发性耐药的非小细胞肺癌细胞系（H1975）的裸鼠移植瘤中Ki-67、PCNA的表达情况，了解联合靶向治疗对EGFRT790M突变继发性耐药的非小细胞肺癌细胞系（H1975）的裸鼠移植瘤的增殖抑制性。同时应用Western blot检测EGFR突变阴性（A549，LTEP）和EGFRT790M突变继发性耐药（H1975）的非小细胞肺癌细胞系的裸鼠移植瘤中 EGFR下游信号蛋白 STAT3，P-STAT3，AKT，p-AKT，MAPK，p-MAPK等的表达水平。最后应用EGFR突变阴性和EGFRT790M突变继发性耐药的非小细胞肺癌原代培养及药敏技术验证EGFR-TKI和EGFR单克隆抗体联合应用的疗效。
　　 结果:
　　 1.应用MTT法检测西妥昔单抗联合特罗凯对EGFR突变阴性的NSCLC细胞系A-549、LTEP及L858R和T790M突变阳性的NSCLC细胞系H1975的增殖活性的影响，分别应用浓度为1.100μg/ml和0.1-10μM的西妥昔单抗和特罗凯抑制A-549，LTEP，H1975细胞系的生长，可以看出随着浓度的增加，这三种细胞系受到了抑制，对EGFR突变阴性的NSCLC细胞系联合应用特罗凯和西妥昔单抗并没有显示出比单一应用这两种药更强的抑制性，对L858R和T790M突变阳性的NSCLC细胞系H1975联合应用特罗凯和西妥昔单抗显示出比单一应用这两种药更强的抑制性。
　　 2.应用Annexin V-FITC法检测西妥昔单抗联合特罗凯对EGFR突变阴性的NSCLC细胞系A-549、LTEP及L858R和T790M突变阳性的NSCLC细胞系H1975的凋亡率的影响，分别应用浓度为1，10μg/ml和0.5，5μM的西妥昔单抗和特罗凯抑制A-549、LTEP、H1975细胞系的生长，可以看出对EGFR突变阴性的NSCLC细胞系联合应用特罗凯和西妥昔单抗并没有显示出比单一应用这两种药更强的凋亡率，而对L858R和T790M突变阳性的NSCLC细胞系H1975联合应用特罗凯和西妥昔单抗显示出比单一应用这两种药更强的凋亡率。
　　 3.通过抑瘤效应观察显示：对于EGFR突变阴性的非小细胞肺癌细胞系（A549、LTEP）移植瘤，对照组、特罗凯组或西妥昔单药组及联合应用组间的移植瘤进行性增大明显，瘤体较重，但各组间瘤重无显著性差异（P>0.05）；即联合用药不能使EGFR突变阴性的非小细胞肺癌细胞系（A549、LTEP）移植瘤变小。而对于L858R和T790M突变阳性的非小细胞肺癌细胞系（H1975）移植瘤，对照组、特罗凯组间的移植瘤进行性增大明显，瘤体较重，而西妥昔单药组的移植瘤增长缓慢，联合用药组移植瘤完全消失，联合用药组比单药组及对照组有显著性差异（P<0.05）；即联合用药使L858R和T790M突变阳性的非小细胞肺癌细胞系（H1975）移植瘤消失。
　　 4.提取EGFR突变阴性的非小细胞肺癌细胞系（A549、LTEP）及L858R和T790M突变阳性的非小细胞肺癌细胞系（H1975）移植瘤的组织蛋白，采用Westernblotting检测其中EGFR信号通路相关蛋白STAT3、AKT、MAPK等的表达水平及p-STAT3/STAT3、p-AKT/AKT、p-MAPK/MAPK等的蛋白磷酸化程度。在EGFR突变阴性的非小细胞肺癌细胞系（A549、LTEP）移植瘤中与对照组相比，单药组和联合组中上述所有EGFR下游信号蛋白的表达水平及磷酸化程度均分别没有大的差异，而在L858R和T790M突变阳性的非小细胞肺癌细胞系（H1975）移植瘤中，与对照组相比，特罗凯组中上述所有EGFR下游信号蛋白的磷酸化程度均分别没有大的差异；而在西妥昔单抗治疗组和联合治疗组中的组织中，p-STAT3/STAT3、p-AKT/AKT、p-MAPK/MAPK蛋白磷酸化程度较其它组低。显示在L858R和T790M突变阳性的非小细胞肺癌细胞系（H1975）移植瘤中，西妥昔单抗单药或西妥昔单抗联合特罗凯治疗可以部分抑制了EGFR下游信号的活化。
　　 5.在L858R和T790M突变阳性的非小细胞肺癌细胞系（H1975）移植瘤中免疫组化显示：与对照组相比，特罗凯组中Ki-67、PCNA表达水平无明显差别，而在西妥昔单抗组和联合用药组中，Ki-67、PCNA的表达明显降低，提示细胞增殖下降。
　　 6.我们检测特罗凯和西妥昔单抗联合应用对于15例EGFR突变阴性和8例T790M突变阳性的继发性耐药的NSCLC患者原代细胞的影响，应用浓度分别为50μg/ml和1μM的西妥昔单抗和特罗凯作用于EGFR突变阴性的NSCLC患者原代细胞，结果显示这三组间T/C值没有显著性差异（P>0.05），对于T790M突变阳性的继发性耐药的NSCLC原代细胞这三组间T/C值有显著性差异（P<0.05），联合用药组疗效明显好于单药组。进一步验证了特罗凯和西妥昔单抗联合应用对于EGFR突变阴性的NSCLC患者无效，但对于T790M突变阳性的继发性耐药的NSCLC患者有效。
　　 结论:
　　 对于T790M突变阳性的继发性耐药的非小细胞肺癌，西妥昔单抗和特罗凯联合应用可以抑制肿瘤细胞的增殖，促进凋亡，使裸鼠体内移植瘤缩小，同时抑制了EGFR下游信号蛋白p-STAT3/STAT3、p-AKT/AKT、p-MAPK/MAPK磷酸化程度，而对于EGFR突变阴性的非小细胞肺癌，西妥昔单抗和特罗凯联合应用不能抑制肿瘤细胞的增殖，促进凋亡，也不能使裸鼠体内移植瘤缩小，同时对EGFR下游信号蛋白磷酸化程度也无抑制作用