新型肿瘤凋亡素2配体基因、其表达的肿瘤凋亡素及其制法

摘要

本发明涉及医药生物工程技术领域,是从中国人外周血单个核细胞获得的一种新型肿瘤凋亡素2配体全基因,即Apo－2L I基因;并利用该基因制备人可溶性肿瘤凋亡素蛋白,即肿瘤凋亡素或称Apo－2L I100。与已有的肿瘤凋亡素2配体全基因Apo－2L基因相比,除了少了位于后者编码区5’端第271～313位的42个核苷酸外,其余部分基本相同,即使个别核苷酸不同,也不改变编码的相应氨基酸。其编码的蛋白Apo－2LI相应也少了14个氨基酸,但同样对肿瘤细胞有凋亡作用。而Apo－2L I100则与已有的人可溶性肿瘤凋亡蛋白Apo－2L114完全相同。本发明以Apo－2L I基因为模板,用pBV220构建原核表达载体pBV－Apo－2L I100,制备的Apo－2L I100可直接表现出生物学活性。本发明提供的制备方法简便,产量和质量高。

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物工程技术领域，是从中国人外周血单个核细胞中获得的一种新型的肿瘤凋亡素2配体基因，并利用该基因制备人可溶性肿瘤凋亡蛋白——肿瘤凋亡素的方法。

背景技术

1995年，国外报道从人表达标签序列文库(expressed sequence tag，EST)中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白的基因(GenBank No.：U57059；U37518；NM003810；XM 045049)，该基因编码的蛋白质称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又称肿瘤凋亡素2配体(apoptotin-2 ligand，简称Apo-2L)，是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成员之一，其可有效地诱导肿瘤和转化细胞凋亡，而对正常细胞无影响。人Apo-2L基因的编码序列有843个核苷酸，核苷酸序列见GenBank No.：U57059；U37518；NM 003810；XM 045049，编码的蛋白质Apo-2L由281个氨基酸组成。业已证明Apo-2L是典型的II型跨膜蛋白，其N-端第114位开始的胞外区可形成游离的可溶性肿瘤凋亡素蛋白Apo-2L₁₁₄，也称TRAIL₁₁₄，同样具有肿瘤凋亡作用。目前国内外对Apo-2L₁₁₄的制备都使用Apo-2L基因。然而由于进行原核重组表达Apo-2L₁₁₄时，所使用的是商品化表达载体，如pET(Novagen公司)或pEQ(Qiagen公司)等，重组蛋白呈包涵体，其必须经复性才有可能表现生物学活性，而复性过程是比较困难和不稳定的，且不是所有的包涵体都可复性的。

发明内容

本发明从中国人外周血单个核细胞中获得了一种新型肿瘤凋亡素2配体基因，称其为Apo-2L I基因。Apo-2L I基因的编码序列由801个核苷酸组成，与已有的Apo-2L基因相比，除了少了位于后者编码区5’端第271～313位的42个核苷酸外，其余部分基本相同，即使个别核苷酸不同，也不改变编码的相应氨基酸，Apo-2L I基因的核苷酸序列见表1。由Apo-2L I基因编码的蛋白相应也少了14个氨基酸，由267个氨基酸组成，氨基酸序列见表2。其与Apo-2L一样具有使肿瘤细胞凋亡的作用。

本发明用Apo-2L I基因来制备人可溶性肿瘤凋亡素。以Apo-2L I基因为模板，通过PCR扩增，从编码序列5’端第297-801位核苷酸得到人可溶性肿瘤凋亡素基因，其编码的氨基酸相当于Apo-2L I蛋白N-端第100～267位氨基酸，故称其为Apo-2L I₁₀₀基因，其与Apo-2L₁₁₄基因一样，由504个核苷酸组成。其编码的蛋白与Apo-2L I₁₁₄相同，也由168个氨基酸组成，称之为Apo-2L I₁₀₀或肿瘤凋亡素。

制备Apo-2L I₁₀₀所使用的表达载体为pBV220。pBV220由中国预防医学科学院病毒研究所提供，该载体是温控型的原核表达载体，其表达量较高。本发明通过合成寡聚核苷酸，置换原pBV220载体Bg1II与Xmn I之间的序列，所构建的表达载体命名为pBV-Apo-2L I₁₀₀，该质粒转化大肠杆菌，所得的工程菌能直接表达具有生物学活性的Apo-2L I₁₀₀。使Apo-2L I₁₀₀表达量占工程菌总蛋白的40％以上，占破碎后工程菌上清总蛋白的10％以上，大大提高了肿瘤凋亡素Apo-2L I₁₀₀的产量和质量，且制备方法简便。

本发明Apo-2L I基因的克隆，Apo-2L I₁₀₀的制备，具体包括如下步骤：

一、构建cDNA文库，制备Apo-2L I基因

1.制备人外周血单个核细胞总RNA

(1)按常规方法从中国人外周血中分离淋巴细胞，进而用贴壁法获得单个核细胞；

(2)用细菌内毒素激活单个核细胞以刺激细胞提高RNA的丰度，再用RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提总RNA。

2.筛选Apo-2L I基因

(1)构建cDNA文库

从上述总RNA中用Oligo-dT柱(Qiagen公司)纯化出总mRNA，以总mRNA为模板，用cDNA文库构建试剂盒(Clontech公司)建成cDNA文库。

(2)筛选出Apo-2L I基因

按常规用随机引物法制备基因探针，杂交筛选上述cDNA文库，筛选出克隆。这些克隆的插入部分亚克隆到pSPORT1的Not I位点。经序列分析，其中一个克隆的基因其DNA序列由1727bp组成，含87bp的5’非翻译区，801bp的开放阅读框(编码267个氨基酸，即全长Apo-2L I蛋白)，3’非翻译区(含多聚腺苷酸化信号或称polyA尾)。该基因命名为Apo-2L I基因，其核苷酸序列见表1，其编码的氨基酸序列见表2。该质粒命名为pSPORT1-Apo-2L I。含此质粒的菌株Escherichia coli K802(基因型：supE hard gal metB)已于2000年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏号：CCTCCNo.：200037；武汉大学)。

二、构建Apo-2L I₁₀₀的原核表达工程菌株

1.制备Apo-2L I₁₀₀基因

设计并合成引物，以Apo-2L I基因为模板，PCR扩增出编码序列Apo-2L I₁₀₀基因。

2.构建原核表达载体pBV-Apo-2L I₁₀₀

设计并合成两条寡聚核苷酸双链，置换pBV220载体的Bgl II与Xmn I之间的序列，置换的序列是：(1)将pBV220原启动子λP_L置换为λP_LP_R串联启动子；(2)引入序列为5’-AGGAATTCACAATG-3’的SD序列。然后与Apo-2L I₁₀₀基因和外源基因下游调控序列相连。这样所构建成的pBV-Apo-2L I₁₀₀载体，其核糖体结合序列与蛋白翻译起始密码子之间的距离为7个核苷酸，以利于Apo-2L I₁₀₀在细菌中的表达。

3.建立Apo-2L I₁₀₀表达工程菌

将上述pBV-Apo-2L I₁₀₀转化大肠杆菌，筛选得到含重组质粒的克隆即为Apo-2L I₁₀₀的工程菌。

三、制备Apo-2L I₁₀₀

1.发酵培养工程菌，使其表达Apo-2L I₁₀₀；

2.超声破碎所得菌体，上清行金属亲和层析、凝胶过滤进一步纯化，即得Apo-2L I₁₀₀。

附图说明

图1为本发明的表达载体pBV-Apo-2L I₁₀₀构建流程图

具体实施方式一、建立cDNA文库，筛选Apo-2L I基因

1.制备中国人外周血单个核细胞总RNA

按常规用淋巴细胞分离液分离中国人外周血淋巴细胞，用RPMI-1640培养基(GIBCO公司)，加10％新生小牛血清(杭州四季青生物公司)及青霉素和链霉素培养至贴壁，得单个核细胞，然后用10μg/L的大肠杆菌R595的内毒素(中国人民解放军第二军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室)刺激2小时，以激活单个核细胞，收集10⁷细胞，用总RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提总RNA，得单个核细胞总RNA。

2.建立cDNA文库，筛选Apo-2L I基因

按常规将上述所得的总RNA，用Oligo-dT柱(Qiagen公司)纯化得总mRNA，以总mRNA为模板，用cDNA合成试剂盒(Clontch公司)进行cDNA第一链和第二链的合成，加上EcoRI接头后连接到λgt10载体中，并用λ噬菌体包装试剂盒(Clontech公司)包装成λ噬菌体文库，建成λgt10 cDNA文库，文库的滴度为6×10⁶。

用随机引物法制备基因探针，杂交筛选此λgt10 cDNA文库(详见《分子克隆》第396～601页)。得到12个阳性噬菌斑。抽提其DNA，得12个纯化的λDNA，用Not I消化，1％琼脂糖凝胶电泳，Southern印迹确认与探针杂交。挑选杂交强度大的克隆，抽提其DNA，再把该DNA的插入部分亚克隆到pSPORTl(GIBCO公司)的Not I位点。测定质粒中插入部分的DNA序列。其中一个序列由1727bp组成，包含87bp的5’非翻译区，801bp开放阅读框和3’非翻译区(含多聚腺苷酸化信号或称polyA尾)，此片段即Apo-2L I基因，核苷酸序列如表1。含此基因的质粒即pSPORT1-Apo-2L I，含该质粒的菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏号：CCTCC No.：200037，中国武汉大学)。根据Kozak定义的翻译起始位点要求，第88-90位核苷酸(ATG，编码蛋氨酸)为翻译起始位点，由此得到的最大开放阅读框所编码的267个氨基酸序列如表2。二、构建Apo-2L I₁₀₀原核表达载体

以pBV220质粒为基础，构建可溶性肿瘤凋亡素Apo-2L I₁₀₀的原核表达载体pBV-Apo-2L I₁₀₀。具体步骤如下：

1.设计并合成引物P1、P2和寡聚核苷酸双链P3、P4

P1、P2为扩增编码Apo-2L I₁₀₀基因的引物。P1引入蛋白合成起始密码子ATG及EcoR I酶切位点GAATTC；P2引入BamH I酶切位点GGATCC。

合成寡聚核苷酸双链P3、P4：

P3、P4为置换原始pBV220载体Bg1 II与Xmn I之间的外源基因上游调控序列及下游序列。P3的斜体部分为λP_LP_R串联启动子，阴影部分为cI抑制蛋白结合位点，黑体部分为核糖体结合序列，5’端引入Bg1 II酶切位点AGATCT，3’端引入EcoR I酶切位点GGATTC；P4的5’端引入了BamH I酶切位点GGATCC，3’端引入Xmn I酶切位点GAANNNNTTC。

2.构建表达载体pBV-Apo-2L I₁₀₀

构建表达载体pBV-Apo-2L I₁₀₀的流程如图1，具体步骤如下：以P1、P2为引物，以质粒pSPORT1-Apo-2L I为模板，PCR扩增Apo-2L I₁₀₀基因编码序列，产物以EcoR I和BamH I酶切(NEB公司)。以Bg1 II和EcoR I酶切P3，BamH I和Xmn I酶切P4。以Bg1 II和Xmn I双酶切pBV220质粒。各酶切片段琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，用T4 DNA连接酶连接各片段，所得到的重组质粒即肿瘤凋亡素Apo-2L I₁₀₀的表达载体pBV-Apo-2L I₁₀₀。三、转化大肠杆菌，建立工程菌

按常规将pBV-Apo-2L I₁₀₀转化大肠杆菌BL21[基因型：hsdS gal(λcIts857indl Sam7 nin5lacUV5-T7)]，从氨苄抗性菌落中分离质粒，酶切鉴定，测序确认为pBV-Apo-2L I₁₀₀。所得的细菌即为本发明的工程菌。四、制备Apo-2L I₁₀₀

挑取一个工程菌菌落，接入含有氨苄青霉素(100μg/ml)的5ml LB培养液的试管中于32℃培养过夜。LB培养基配方(g/L)为蛋白胨∶酵母粉∶NaCl＝10∶5∶5。

把过夜培养的细菌按1∶100接入含有氨苄青霉素(100μg/ml)的2×YT培养基中，培养6小时。2×YT培养基配方(g/L)为蛋白胨∶酵母粉∶NaCl＝16∶10∶5。

再把培养的细菌按1∶40接入含有氨苄青霉素(100μg/ml)的半合成培养基中进行发酵。32C培养5-7小时；升温至42℃培养4-5小时。用恒流泵以0.2ml/min/L培养基添加补料，溶解氧控制在30～50％之间。得到约20-30克/升发酵液的湿菌体。半合成发酵培养基中配方(g/L)为蛋白胨∶酵母粉∶KH₂PO₄∶K₂HPO₄∶Na₂HPO₄·12H₂O∶(NH₄)₂SO₄∶NH₄Cl＝5∶5∶2∶4∶7∶1.2∶0.2；发酵补料配方(g/L)为葡萄糖∶酵母粉∶蛋白胨∶MgSO₄·7H₂O＝200∶70∶70∶5.7。

超声破碎发酵菌体，上清用0.22μm的滤膜过滤；再用3×20cm的TALON Metal AffinityRsins(Clontech公司)柱行金属亲合层析，10mmol/L咪唑，pH7.0，洗5个床体积以洗脱杂蛋白，再以100mmol/L咪唑，pH7.0，洗5个床体积以洗脱Apo-2L I₁₀₀；Sephacryl S-200进一步纯化Apo-2L I₁₀₀，即可得到高纯度Apo-2L I₁₀₀。

                   表1.Apo-2L I基因核苷酸序列表   1  CCT CAC TGA CTA TAA AAG AAT AGA GAA GGA AGG GCT TCA GTG ACC GGC TGC CTG GCT GAC   60  61  TTA CAG CAG TCA GAC TCT GAC AGG ATC ATG GCT ATG ATG GAG GTC CAG GGG GGA CCC AGC  120 121  CTG GGA CAG ACC TGC GTG CTG ATC GTG ATC TTC ACA GTG CTC CTG CAG TCT CTC TGT GTG  180 181  GCT GTA ACT TAC GTG TAC TTT ACC AAC GAG CTG AAG CAG ATG CAG GAC AAG TAC TCC AAA  240 241  AGT GGC ATT GCT TGT TTC TTA AAA GAA GAT GAC AGT TAT TGG GAC CCC AAT GAC GAA GAG  300 301  AGT ATG AAC AGC CCC TGC TGG CAA GTC AAG TGG CAA CTC CGT CAG CTC GTT AGA AAG GAA  360 361  AAG CAA CAA AAT ATT TCT CCC CTA GTG AGA GAA AGA GGT CCT CAG AGA GTA GCA GCT CAC  420 421  ATA ACT GGG ACC AGA GGA AGA AGC AAC ACA TTG TCT TCT CCA AAC TCC AAG AAT GAA AAG  480 481  GCT CTG GGC CGC AAA ATA AAC TCC TGG GAA TCA TCA AGG AGT GGG CAT TCA TTC CTG AGC  540 541  AAC TTG CAC TTG AGG AAT GGT GAA CTG GTC ATC CAT GAA AAA GGG TTT TAC TAC ATC TAT  600 601  TCC CAA ACA TAC TTT CGA TTT CAG GAG GAA ATA AAA GAA AAC ACA AAG AAC GAC AAA CAA  660 661  ATG GTC CAA TAT ATT TAC AAA TAC ACA AGT TAT CCT GAC CCT ATA TTG TTG ATG AAA AGT  720 721  GCT AGA AAT AGT TGT TGG TCT AAA GAT GCA GAA TAT GGA CTC TAT TCC ATC TAT CAA GGG  780 781  GGA ATA TTT GAG CTT AAG GAA AAT GAC AGA ATT TTT GTT TCT GTA ACA AAT GAG CAC TTG  840 841  ATA GAC ATG GAC CAT GAA GCC AGT TTT TTT GGG GCC TTT TTA GTT GGC TAA CTG ACC TGG  900 901  AAA GAA AAA GCA ATA ACC TCA AAG TGA CTA TTC AGT TTT CAG GAT GAT ACA CTA TGA AGA  960 961  TGT TTC AAA AAA TCT GAC CAA AAC AAA CAA ACA GAA AAC AGA AAA CAA AAA AAC CTC TAT 10201021  GCA ATC TGA GTA GAG CAG CCA CAA CCA AAA AAT TCT ACA ACA CAC ACT GTT CTG AAA GTG 10801081  ACT CAC TTA TCC CAA GAA AAT GAA ATT GCT GAA AGA TCT TTC AGG ACT CTA CCT CAT ATC 11401141  AGT TTG CTA GCA GAA ATC TAG AAG ACT GTC AGC TTC CAA ACA TTA ATG CAA TGG TTA ACA 12001201  TCT TCT GTC TTT ATA ATC TAC TCC TTG TAA AGA CTG TAG AAG AAA GCG CAA CAA TCC ATC 12601261  TCT CAA GTA GTG TAT CAC AGT AGT AGC CTC CAG GTT TCC TTA AGG GAC AAC ATC CTT AAG 13201321  TCA AAA GAG AGA AGA GGC ACC ACT AAA AGA TCG CAG TTT GCC TGG TGC AGT GGC TCA CAC 13801381  CTG TAA TCC CAA CAT TTT GGG AAC CCA AGG TGG GTA GAT CAC GAG ATC AAG AGA TCA AGA 14401441  CCA TAG TGA CCA ACA TAG TGA AAC CCC ATC TCT ACT GAA AGT GCA AAA ATT AGC TGG GTG 15001501  TGT TGG CAC ATG CCT GTA GTC CCA GCT ACT TGA GAG GCT GAG GCA GGA GAA TCG TTT GAA 15601561  CCC GGG AGG CAG AGG TTG CAG TGT GGT GAG ATC ATG CCA CTA CAC TCC AGC CTG GCG ACA 16201621  GAG CGA GAC TTG GTT TCA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAC TTC AGT AAG TAC GTG TTA TTT 16801681  TTT TCA ATA AAA TTC TAT TAC AGT ATG TCA AAA AAA AAA AAA AAA AA                  1727

                   表2.Apo-2LI氨基酸序列表  1   MAMMEVQGGP SLGQTCVLIV IFTVLLQSLC VAVTYVYFTN ELKQMQDKYS KSGIACFLKE DDSYWDPNDE      70 71   ESMNSPCWQV KWQLRQLVRK EKQQNISPLV RERGPQRVAA HITGTRGRSN TLSSPNSKNE KALGRKINSW     140141   ESSRSGHSFL SNLHLRNGEL VIHEKGFYYI YSQTYFRFQE EIKENTKNDK QMVQYIYKYT SYPDPILLMK     210211   SARNSCWSKD AEYGLYSIYQ GGIFELKEND RIFVSVTNEH LIDMDHEASF FGAFLVG                   267