用基因工程方法生产红细胞刺激因子/粒细胞集落刺激因子融合蛋白

摘要

本发明涉及用基因工程方法生产红细胞生长因子/粒细胞集落刺激因子融合蛋白。通过对红细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子的亚克隆和末端改造以及用聚合酶链反应方法,把两个基因通过一段多肽连接起来,使之形成表达质粒,将其转化进入哺乳动物细胞并得到了高效表达。该融合蛋白具有红细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子的双重活性,与相同剂量的EPO和G－CSF单体相比,融合蛋白具有较高的生物活性。本发明EPO的生物活性为1×10

说明书

本发明涉及基因工程，特别是涉及一种用基因工程方法生产红细胞刺激因子/粒细胞集落刺激因子融合蛋白(EPO/G-CSF)。

红细胞刺激因子和粒细胞集落刺激因子为两类重要的血细胞因子。在人类的造血系统中，每一位成年男性平均每年在体内生成大约4.5×10¹¹个粒细胞和红细胞，约相当于人的总体重(Dexteret al,Bioessay 2,154-158(1985))。血细胞生长因子是一组蛋白，产生于体内，并具有特异性刺激血细胞生长分化的功能。正常情况下，血液系统细胞的生长分化是靠造血生长因子(Hemotopoietic Growth Factor)调节的，它们包括：多功能性集落因子(Multipotent-CSF)，白细胞介素3(IL-3)，粒巨噬细胞集落因子(GM-CSF)，粒细胞集落因子(G-CSF)，红细胞生长因子(EPO)，血小板生成素(TPO)，干细胞因子(SCF)等。这些因子协调或单独地调节造血前阶段细胞的增殖分化活动。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是选择性和特异性地刺激中性粒细胞的增殖和分化，其作用机理是：作用于细胞表面的特异性受体，通过结合后引起一系列信号传递，促使细胞生长和发育。在临床上，用于提高病人的中性粒细胞数目及病人抵抗感染的能力。

红细胞刺激因子(EPO)能促使幼稚红细胞生长分化。对晚期BFU-E(Burst Forming Units-Erythrocytes)及CFU-E(C010ny Forming Units-Erythrocyte)有促进分化作用，并使其合成血红蛋白变成成熟红细胞。EPO能促进网质红细胞的提前释放，并能刺激骨髓巨核细胞。

对爱滋病和肿瘤化疗患者，药物和化疗常常会对患者的造血系统产生严重影响。因在临床上已有EPO和G-CSF合用，使之增加患者自身的免疫功能和红细胞计数，加快病人的恢复的例子，同时因为世界范围内的供血紧张，且会有病毒污染血源的可能，如爱滋，肝炎等，所以正如文献：Strauss et al,J.Clin.Apheresis,1995,10:145 Vamavakas et al,J.Clin.Apheresis,1997,12:945 Strauss etal,B100d,1993,81:1675中指出的：生产复合性的血细胞生成因子具有非常重要的临床意义。

世界上已有几种构建复合性血液刺激因子的例子，如IL3/EPO,EPO/IL3,IL3/G-CSF(WO92/06116，专利申请)。实验证明，IL3/EPO和FPO/IL3具有刺激BFU-E和CFu-E的作用。复合因子的构建和产生是根据其自身的功能，同时又具有双重的协同作用；最新一例证明是有协同作用的生产红细胞刺激因子/粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(EPO/GM-CSF)如文献：Antonio Metal,US Patent 5916773。

本发明的目的在于：为了克服已有的红细胞刺激因子或粒细胞集落刺激因子作用单一的缺点，为了寻找一种与单体EPO与C-CSF相比具有较高的生物活性的、同时具有刺激红细胞和粒细胞的双重作用，EPO与G-CSF连成一体，既有协同作用，又不产生抗体的，在临床上具有实用价值的刺激血细胞生长功能的复合性的血细胞生成因子(一种融合蛋白)，从而提供一种用基因工程方法生产红细胞刺激因子/粒细胞集落刺激因子融合蛋白。

本发明的目的是这样实现的：本发明提供的用基因工程方法生产红细胞刺激因子/粒细胞集落刺激因子融合蛋白(以下简称：EPO/G-CSF融合蛋白)，该EPO/G-CSF融合蛋白，具有其EPO的生物活性为1×10⁵U/mg，和其G-CSF的生物活性为1×10⁷U/mg；具有如下结构：

红细胞生长因子-连接片段-粒细胞集落刺激因子

EPO————LINKER————G-CSF所述的融合蛋白具有图8的EPO/G-CSF融合蛋白示意图(一级结构)。所述的融合蛋白包括：EPO/G-CSF结构(1)通过连接片段把红细胞生长因子尾与粒细胞集落刺激因子的头连接，即C端——N端连接；还包括G-CSF/EPO结构(2)通过连接片段把粒细胞集落刺激因子的尾与红细胞生长因子的头连接，即C端——N端连接；

所述的EPO/G-CSF融合蛋白是在其两蛋白中间有一小段连接片段，该连接片段是连接肽，连接肽顺序的一级结构用以连接EPO和G-CSF蛋白顺序，连接肽具有如图3的序列，连接肽是10-20个有相同的或不相同的氨基酸连接顺序，具有这些连接顺序的氨基酸都可以是连接肽，图3所示的一种序列是最佳的例子。

所述的融合蛋白具有EPO和G-CSF蛋白自然顺序，并具有双重活性，其EPO的生物活性为1×10⁵U/mg，其G-CSF的生物活性为1×10⁷U/mg。

EPO/G-CSF的质粒构建，其待征在于构建中使用设计合成的引物寡聚脱氧核苷酸P1,P2,P3,P4,P5,P6,P7,P8,它们的核苷酸序列是：

P1: 5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’

P2: 5, TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’

P3: 5’ATGGCTGGACCTGCCACCCAGAGCC 3’

P4: 5, TCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3’

P5: 5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’

P6: 5’AGCTAGAATCCA CCCGCGGATCCA CCTCCTGATCCA

       CCGCTGGACCTG CCACCCAGAGCC 3’

P7: 5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCG

       GACACCCCCCTGGGCCCTGCCA 3’

P8: 5’AGCTAAAGCTTT CAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3’

本发明提供的用基因工程方法生产红细胞刺激因子/粒细胞集落刺激因子融合蛋白，按以下步骤进行：

(1)为了获得FPO/G-CSF融合基因质粒，首先从细胞中抽取信使核糖核酸(mRNA)，然后利

   用逆转录酶-DNA聚合酶链反应(RT-PCR)方法制备单链和双链互补脱氧核糖核酸(cDNA)；

(2)经过分离纯化，将FPO的cDAN及G-CSF的cDNA分别克隆到载体上，以此为基础进行融

   合蛋白的构建(见图1和2)；

(3)利用聚合酶链反应(PCR)我们对二者进行了亚克隆和末端改造，以及增加了一小段连接体

  (见图3和4)，通过限制性内切酶，我们构建成了能够表达EPO/G-CSF融合蛋白的质粒，

  并将其质粒转化进入细胞株CHO或COS细胞。转化后的CHO细胞能生产分泌EPO/G-CSF

  融合蛋白。

该方法详细描述如下：材料与方法

一．细胞株：包括CHO细胞株，COS细胞株。

    菌株：包括菌株DH5α，菌株HB101等

    质粒：包括pTA连接质粒(3.9Kb,Ampr),pBR322。

    真核细胞表达质粒：包括pBS1(4.6Kb,DHFRr),pMCM(5.6Kb,Ampr)。

二．酶类：DNA聚合酶(Clonetech)；限制性内切酶(Promega,Biolab)；T4 DNA连

    接酶(Life Technologies)；mRNA纯化Kit(Invitrogen)；cDNA合成Kit(Strategen)。

主要生化试剂和材料：FPO标准品(Amgen)；dNTP(Perkin Elmer)；琼脂糖(BRL)；氨卞青霉素(Sigma)；蛋白分子量标准(Bio-Rad)；DNA分子量标准(Life Technologies)；EPO ELISAKit(R&D)。

三．质粒的制备：

    1．质粒筛选

将含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(OD600约0.6)，将含有相应抗生素的LB培养液(预温到37℃)放入烧瓶内，加入对数晚期培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时，所得培养物的OD600值约0.4，于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清；将细菌沉淀重悬于用冰预冷的STE溶液中(STE溶液：0.1mol/L NaCl,10mmol/L Tris·Cl,pH8.0,1mmol/L EDTA,pH8.0)，离心收集细菌细胞。将收集细菌的细胞重悬于用冰预冷的溶液中含10％蔗糖，50mmol/LTris·Cl,pH8.0溶液中，加溶菌酶溶液，混匀，在冰上放10分钟，再加10％SDS，混匀，立刻加5mol/LNaCl(终浓度为1mol/L)混匀，在冰上放1小时，离心，将上清用酚：氯仿和氯仿各提一次，将水相于室温加入2倍体积乙醇混匀，于室温放1-2小时，离心，回收质粒。

2．DNA片段的放大

用PCR方法将EPOcDNA(以及其它DNA片段)放大，放置在PCR仪中进行扩增：94℃,45秒，55℃,45秒，72℃,1-2分钟，循环35次后，72℃,7-10分钟。(详见实施例)。

3．DNA片段的连接

用相同限制性内切酶切质粒和EPOcDNA(以及其它DNA片段)，37℃,30-60分钟，经琼脂糖电泳纯化后，用T4 DNA连接酶连接，形成重组质粒的构造。(详见实施例)。

4．限制性内切酶分析

用限制性内切酶切重组质粒，经琼脂糖电泳纯化后，得到EPOcDNA(以及其它DNA片段)，由此证明连接的正确性。

5．DNA 序列分析

用Sanger双脱氧链终止法，将dNTP,DNA模板，Klenow，等量加在4个管中，55℃,30分钟，分别加入ddA,ddG,ddT,ddC，保存于室温15-20分钟，按常规方法处理，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测序。

6．SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳等采用常规方法，均参照文献(Sambrook Jet al,ALaboratory Methods-Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,2nd Edition,1989；Current Protocol of Molecular Biology,John Wiley & Sons)。

五．细胞培养：从液氮中取出冷冻细胞，置37℃水浴中迅速融化，将细胞悬液移入离心管内，加入培养基，离心10分钟，用含10％小牛血清(Life Technologies)的α-MEM(α-Dullbecco’sModified Fagle Medium,Life Technologies)培养基重悬细胞，然后移入培养瓶内，接种3×104cells/cm²，将细胞置于CO2培养箱内，37℃,5％CO₂，至活细胞比例＞85％(48-72小时)。

六．样品蛋白含量测定：1．染色液的配制：100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95％乙醇中，然后与100ml 85％(W/V)磷酸混合，用水稀释至1000ml；

2．测定方法：若蛋白量为＞0.2mg/ml，取0.1ml样品与5ml染色液均匀混合，静置10-30分钟后测定A600nm；若蛋白量为5-100mg/ml，取0.8ml样品与0.2ml染色液均匀混合后进行测定；以BSA测得曲线为标准曲线。

本发明的优点在于：本发明为一种利用基因工程方法生产红细胞生长因子(EPO)/粒细胞集落刺激因子(G-CSF)融合蛋白(EPO/G-CSF)。通过对红细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子的亚克隆和末端改造以及用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的方法，把两个基因通过一小断多肽连接起来，使之形成表达质粒，将其转化进入哺乳动物细胞并得到了高效表达，融合蛋白具有红细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子的双重活性。经过生物活性鉴定，与相同剂量的EPO和G-CSF单体相比，融合蛋白具有较高的生物活性；同时本发明也提出了连接肽顺序，此顺序致关重要，既能将EPO/G-CSF连成一体且有生物活性，同时又不产生抗体。融合蛋白具有EPO和G-CSF蛋白自然顺序，并具有双重活性，其EPO的生物活性为1×10⁵U/mg，其G-CSF的生物活性为1×10⁷U/mg。本发明在用于相关患者的血细胞生长发育中具有临床应用的实际价值。

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明：

图1是EPO cDNA的合成及重组质粒的构建。

图2是G-CSF cDNA的合成及重组质粒的构建。

图3是中间连接片段的结构一种图例。

图4A是通过PCR方法修饰和构建的FPO和图4B是通过PCR方法修饰和构建的G-CSF质粒，两个cDNA序列的两端都得到了修饰，既末端改造。

图5是构建pTrm-EPO-LINKER-G-CSF质粒的流程图。

图6是重新改造构建的pTrm-EPO-LINKER-G-CSF质粒。

图7是pmNAD EPO-LINKER-G-csF质粒的构建流程图。

图8是本发明的EPO/G-CSF融合蛋白的示意图(一级结构)。

图9是蛋白纯化图：1．标准样品；2．EPO；3.0。CSF；4．融合蛋白。

表1是EPO/G-CSF融合蛋白生物化学特征测定。

表2是EPO/G-CSF融合蛋白动物实验数据。

实施例1．引物寡聚脱氧核苷酸的设计与制备：

P1: 5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’

  P1是从EPO基因起始因子开始，包括信号肽链。

P2: 5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3，

P2是互补于3，末端的寡聚脱氧核苷酸，与P1一起，通过PCR，放大并克隆全长(蛋白编码)EPOcDNA。

P3: 5’ATGGCTGGACCTOCCACCCAGAGCC 3，

P3是从起始因子开始的G-CSF寡聚脱氧核苷酸。

P4: 5’TCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGA 3，

P4是互补于3，末端的引物，它与P3一起放大并克隆全长(蛋白编码)的G-CSF cDNA。

P5: 5,AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3,

P5的后部分与EPO的起始密码之后的脱氧核苷酸序列一致。在起始密码之前，我们加7一个BamHⅠ位点。

P6:5,AGCTAGAATCCA CCC6CGGATCCA CCTCCTGATCCA

     CCGCTGGACCTG CCACCCAGAGCC 3’

P6是与EPO cDNA终止密码之前的序列互补(不包括终止密码)，并额外加了一段连接肽的核苷酸序列，其中含有一个SacⅡ。在SacⅡ位点之后又加了一个EcoRⅠ位点。

P7: 5,AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCG

      GACACCCCCCTGGGCCCTGCCA 3,

P7是与G-CSF成熟蛋白的5’脱氧核苷酸的起始序列一致(在信号下游不包括信号肽)，在上游加了一段连接肽的脱氧核苷酸序列，其中包括了SacⅡ位点，同时在SacⅡ位点前插入了一个EcoRⅠ位点。

P8: 5,AGCTAAAGCTTT CAGGGCTGGGCAAGGTGGCOTAGA 3,

P8与G-CSF cDNA的末端互补(包括终止密码)，并带有一个HindⅢ位点。

实施例2．人EPO、G-CSF和EPO／G-CSF融合基因全长核苷酸序列的测定：

为了获得EPO、G、CSF基因以及EPO/G-CSF融合基因，我们对每一cDNA及改造后序列进行了亚克隆和末端改造，并利用常规方法对每一段cDNA及改造后的融合基因进行了核苷酸序列测定详见实施例1和图1-7)。

实施例3．EPO和G-CSF cDNA的制备：

用1μg mRNA为起始物，将mRNA溶入20μl去离子的水中，加热65℃,10-20分钟，置于冰浴中备用；然后加入cDNA合成缓冲混合液和AMV逆转录酶，其中含有1μM mRNA,50mM Tris.HCl(pH8.3),40mM KCl,6mM MgCl2,4mM DTT,0.5mM dNTP,0.1mM poly(dT)12-18,0.1mg/ml BSA。在37℃反应一小时。从上面的反应液中，取5μl，放入DNA聚合酶链反应(PCR)的试管中，依次加入100pmol P1和P2的上下游引物，克隆放大EPO基因(见实施例1),5μl PCR缓冲液(10X)，2.5mmol／L的dNTp和5单位的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)，最终体积为50μl；放置PCR仅中进行扩增：94℃,45秒，55℃,45秒，72℃,1-2分钟，循环35次后，72℃,7-10分钟；反应完成后立刻取出，放置冰浴中待用。P3和P4克隆放大G。CSF基因，除P引物外，G-CSF的克隆和放大过程与EPO一样。

实施例4．EPO和G-CSF重组质粒的构建：

按照图1和图2,PCR反应后，分别从两个装有EPO基因和G-CSF基因试管中，各取5μl反应液，加入另一试管中，其中含有pTa载体以及T4 DNA连接酶，形成EPO和G-CSF的基本构造，成为以后基因改造的基础。对所有质粒均进行了限制性内切酶的分析以保证序列的正确性。

实施例5．FPO/G-CSF表达重组质粒的构建：

按照图3-6流程，经过改建和亚克隆后形成EPO/G-CSF重组质粒。经过对其最后表达质粒的限制性内切酶分析和序列测定后，证明其结构与所设计的结构一致。

实施例6．EPO/G-CSF融合基因在真核细胞中的高效表达：

用于表达EPO/G-CSF蛋白的真核细胞株为CHOdhfr-(CHO,DUKXBl)(Urlaub G,et al,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.77:1216)。利用Lipofectin(Life Technologies)将EPO/G-CSF融合基因进行转化；转化克隆生长于氨甲蝶吟(Methotrexate,Sigma)中；逐渐增加氨甲蝶吟浓度以选择出高效表达细胞株。本实施例用免疫杂交试剂盒EPO ELISA KIT(R&D)和G-CSF ELISA KIT(R&D)对其融合蛋白的活性进行了测定。

实施例7．EPO/G-CSF融合蛋白的分离纯化：

收集无血清细胞培养液(CHO-S-SFMII,Life Technologies)将其浓缩，然后在(20mMTris.HCl,pH6.0,50mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT)溶液中进行透析，温度：40℃，透析时间24小时；将透析后的溶液上样于已平衡后的DEAE-Sepharose柱(5×20cm)用20mMTris.HCl,pH 6.0,50mM NaCl的缓冲液平衡5-10倍柱体积)。用梯度洗脱方法(洗脱液为0.05-1MNaCl)洗脱融合蛋白。分管收集各洗脱峰，经活性测定后，收集有活性部份，将其浓缩后，用高压气相色谱(HPLC)分离纯化，得到纯化的融合蛋白。

实施例8．EPO/G-CSF融合蛋白生物化学特征的测定：

为了鉴别EPO/G-CSF融合蛋白的生化特征，本实施例做了免疫杂交实验，其结果为蛋白分子量在预定范围之内。生物活性测定方法用Broxmeyeretal(Exp.hemat015,87(1971))和Luetal(Blood 61,250(1983))的方法，测定CFU-GM(C010ny FormingUnits。Granulocyte Macrophage)以及BFU-E的集落数目；对CFU-GM和BFU-E的集落数目进行比较和分析，EPO/G-CSF融合蛋白具有双重活性以及协同作用(见表1)：表1中所列四组实验结果为一组5只小鼠。

                表1

   CFU-GM(Colonles)   BFU-E(Colonies)Medium      0±0              0±0对照组G-CSF       75±5.4           3±1EPO(1U)     0±0              26±1EPO/G-CSF   85±5             83±7

其测定方法为：利用低密度粘著于培养皿的骨髓细胞，对所有集落进行测定。低密度细胞在IMDM(Iscov’s Modifled Dulbecco’s Media)培养液中(含有小牛血清)，37℃，生长1-2小时，按Ficoll-Hypague方法分离(Pharmacia)。

对CFU-GM的测定：在1ml琼脂培的培养皿中(含有McCoy’s培养液和10％加热处理后的小牛血清)，放置1×10⁵细胞，培养七天后，检测其集落数目和形态，通过系列稀释后与标准品对照。

对BFU-E的测定：在1ml IMDM培养液中(含有0.8％甲基纤维素，methylcellulose,20％小牛血清，0.05mM巯基乙醇，β-Mercaptoethanol,1U EPO或者EPO/G-CSF融合蛋白)，放置1×10⁵细胞，培养十四天后，检测其集落数目和形态，通过系列稀释后与标准品对照。以上为五组独立实验结果的平均值。从结果看G-CSF能够协同红细胞增殖及分化。纯化后的EPO/G-CSF，测得其EPO的活性为1×10⁵U/mg,G-CSF的活性为1×10⁷U/mg。

实施例9．动物实验

将24只小老鼠分成4组，每组6只。A组为对照组，皮下注射生理盐水；B组注射单体EPO(300U/每公斤体重)；C组注射单体G-CSF(5μg/每公斤体重)；D组为实验组，注射本发明的融合蛋白(5μg/每公斤体重)。每天注射一次，连续七天后，检测血沉和中性细胞数量。其结果如下(表2)：

                 表2实验组       红细胞压积         中性拉细肥数目A            无变化             无变化B            增加1.5％          无大变化C            无大变化           增加4-6倍D            增加1％            增加约4倍