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法律状态
2017-05-24
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N9/24 授权公告日:20080528 终止日期:20160330 申请日:19990330
专利权的终止
2012-09-26
专利权人的姓名或者名称、地址的变更 IPC(主分类):C12N9/24 变更前: 变更后: 申请日:19990330
专利权人的姓名或者名称、地址的变更
2008-05-28
授权
授权
2001-07-18
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
2001-07-11
公开
公开
发明领域
本发明涉及蛋白质，尤其是能够降解淀粉的蛋白质。
具体地说，本发明涉及能够延迟有害的淀粉凝沉的蛋白质的应用。
有害的凝沉过程，诸如变陈，通常发生在淀粉介质、特别是水性淀粉悬浮液的加热和冷却之后，并且是由于糊化淀粉转化为越来越有序状态而引起的。
更具体地讲，本发明涉及能够延迟支链淀粉的有害凝沉的蛋白质的应用。
更具体地讲，本发明涉及制备烤面包制品的蛋白质的应用以及涉及所述烤面包制品本身。
更具体地讲，本发明涉及延迟焙烤面粉面包制品中的变陈。
更具体地讲，本发明涉及变陈延迟或减少的焙烤面粉面包制品的生产方法，包括将非生成麦芽糖的(non-maltogenic)外淀粉酶(exoamylase)加入发酵面团中。
本发明也涉及用于面团和焙烤面粉面包制品的包含非生成麦芽糖的外淀粉酶的增酵剂组合物。
发明背景
淀粉包括支链淀粉和直链淀粉。支链淀粉是高度分支的具有短α-(1→4)-D-葡聚糖链的糖聚合物，所述葡聚糖链在分支点通过α-(1→6)键连接在一起，形成分支的丛状结构。每20-25个α-(1→4)联葡萄糖残基平均有一个分支点。相反，直链淀粉是线性结构，主要由不分支的α-(1→4)-D-葡聚糖单位组成。通常，淀粉含有约75％的支链淀粉分子和约25％的直链淀粉分子。
更具体地讲，线性麦芽寡糖由2-10个通过α-(1→4)键连接的α-D-吡喃葡萄糖单位构成。由于其特性诸如甜度低、持水量高并且防止蔗糖结晶[1]，因此这些化合物在食品工业具有潜在的应用。然而，制备更大量的聚合度高于3(即DP＞3)的麦芽寡糖繁琐且昂贵。
作为背景资料，DP1=葡萄糖，DP2=麦芽糖，DP3=麦芽三糖，DP4=麦芽四糖，DP5=麦芽五糖，DP6=麦芽六糖，DP7=麦芽七糖，DP8=麦芽八糖，DP9=麦芽九糖，DP10=麦芽十糖。
产生特定长度的麦芽寡糖的微生物酶的发现，使得可以生产更大量的这些寡糖[2]。
淀粉酶是淀粉降解酶，分类为水解酶，它切割淀粉中的α-D-(1→4)O-糖苷键。一般而言，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1,α-D-(1→4)葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为内作用酶，以随机方式切割淀粉分子中的α-D-(1→4)O-糖苷键[3]。相反，外作用淀粉水解酶诸如β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2,α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和某些产物特异性淀粉酶从底物的非还原末端切割淀粉分子[4]。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(E.C.3.2.1 20,α-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3,α-D-葡聚糖葡糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可以由淀粉产生特定长度的麦芽寡糖。
先前已经鉴定出产生具有特定DP的麦芽寡糖的几种淀粉酶，包括得自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoma)[5,6]、枯草杆菌(Bacillussubtilis)[7]、环状芽孢杆菌(B.circulans)G-6[8]、环状芽孢杆菌F-2[9,10]和热速芽孢杆菌(B.caldovelox)[11,12]的产生麦芽六糖的淀粉酶。已经在地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)584[13]和种名待定的假单胞菌(Pseudomonas spp.)[14,15]中检测到产生麦芽五糖的淀粉酶。此外，已经报道了得自施氏假单胞菌(Pseudomona stutzeri)NRRL B-3389[16,171、芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)MG-4[18]和假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)IMD353[19]的产生麦芽四糖的淀粉酶以及得自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)NA-468[20]和枯草杆菌[21]的产生麦芽三糖的淀粉酶。
EP-B1-298,645描述了一种采用遗传工程技术制备施氏假单胞菌或嗜糖假单胞菌(P.saccharophila)的外麦芽四糖水解酶的方法。
US-5,204,254描述了天然的和遗传修饰的嗜碱细菌(DSM 5853)的外麦芽五糖水解酶。
已经鉴定了非常少的在高pH下有活性的产物特异性淀粉酶。已经鉴定的那些淀粉酶的实例包括得自芽孢杆菌属菌种H-167的产生麦芽六糖的淀粉酶[22,23]、得自细菌分离物(163-26,DSM 5853)的产生麦芽五糖的淀粉酶[24]、得自芽孢杆菌属菌种IMD370的产生麦芽四糖和更小的麦芽寡糖的淀粉酶[25]以及得自芽孢杆菌属菌种GM 8901的最初由淀粉产生麦芽六糖、然后在延长的水解期间将其转化为麦芽四糖的淀粉酶[26]。
在水存在下加热的淀粉粒经历其中液体被溶涨的淀粉粒吸收的称为凝胶化的有序-无序相转变。不同的淀粉凝胶化温度不同，且对于天然的未修饰的淀粉而言，凝胶化温度取决于其生物来源。
根据的淀粉浓度，冷却将凝胶化相转变为粘弹性糊或弹性凝胶。在此过程中，直链淀粉和支链淀粉链再缔合形成更加有序的结构。随着时间的推移，形成更多的缔合，并且它们甚至更加有序。人们认为，支链淀粉链DP 15-20的缔合导致热致可逆的准晶体结构。
有害凝沉的结果是所述糊或凝胶系统的持水量改变，这对凝胶结构和食用价值有重要关联。
已知烤面包制品的质量在贮藏期间逐渐变质。面包瓤丧失了柔软度和弹性，变得坚实并且碎屑多。这种所谓的变陈主要是因为淀粉的有害凝沉，人们认为这是糊化淀粉在焙烤期间从无定形状态转变为准结晶状态。面包瓤坚实度的增加通常用作衡量面包变陈过程的尺度。
当新鲜焙烤的面包冷却时，直链淀粉部分在数小时内凝沉产生网络。这一过程是有益的，因为它产生坚实度低且切片性能改善的所需的面包瓤结构。在焙烤后数天期间，在糊化淀粉粒内发生更多的支链淀粉逐渐结晶。在这一过程中，人们认为支链淀粉增强其中包埋淀粉粒的直链淀粉网络。这种增强导致面包瓤的坚实度增加。这种增强是面包变陈的主要原因之一。
支链淀粉有害凝沉或结晶的速率取决于支链淀粉侧链的长度。根据这一点，谷类支链淀粉的凝沉速率低于平均链长度比谷类支链淀粉长的豌豆或马铃薯的支链淀粉的凝沉速率。
以下对支链淀粉凝胶系统的观察支持这一点：具有DP(即聚合度)≤11的平均链长的支链淀粉根本不结晶。此外，存在DP 6-9的非常短的链似乎可能因为位阻而抑制周围较长侧链的结晶。因此这些短链似乎具有强的抗有害凝沉效应。根据这一点，支链淀粉凝沉与DP 14-24的侧链的摩尔份数成正比，而与DP 6-9侧链的摩尔份数成反比。
在小麦和其它谷类中，支链淀粉的外部侧链范围为DP 12-19。因此，支链淀粉侧链的酶促水解可以显著降低其结晶倾向。
本领域已知通过采用生成葡萄糖和生成麦芽糖的外淀粉酶诸如淀粉糖苷酶(通过释放葡萄糖水解淀粉)和生成麦芽糖的外淀粉酶或β-淀粉酶(通过从非还原链末端释放麦芽糖而水解淀粉)来延迟面包变陈。
在这方面，Jakubczyk等(Zesz.Nauk.Sck.Gl.Gospod Wiejsk.Warzawie,Technol.Reino-Spozyw,1973,223-235)报道，淀粉葡糖苷酶可以延迟焙烤的小麦粉面包的变陈。
JP-62-79745和JP-62-79746陈述，使用分别由嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothernophilus)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)产生的β-淀粉酶可以有效地延迟淀粉食品包括面包的变陈。
EP-A-412,607公开了通过将热稳定性外淀粉酶加入面团，生产具有变陈延迟特性的面包制品的方法，其中所述热稳定性外淀粉酶在凝胶化前不被失活。仅淀粉葡糖苷酶和β-淀粉酶列为待使用的合适的外淀粉酶。该外淀粉酶的量在焙烤期间，通过从直链淀粉或支链淀粉的非还原末端将葡萄糖或麦芽糖断开来选择性地改变支链淀粉组分的结晶特性。根据EP-A-412,607所述，所述外淀粉酶选择性地降低支链淀粉的结晶性能，而基本上不影响直链淀粉的结晶性能。
EP-A-494,233公开了使用生成麦芽糖的外淀粉酶以α-构型释放麦芽糖，所述麦芽糖在生产具有变陈延迟性能的焙烤制品的过程中在凝胶化之前不被失活。具体仅公开了得自芽孢杆菌属菌株NCIB 11837的生成麦芽糖的α-淀粉酶。显然，所述生成麦芽糖的外淀粉酶通过从多糖链的非还原末端以分步方式去除α-麦芽糖单位，水解淀粉(和相关多糖)的(1→4)-α-葡糖苷键。
因此，现有技术指出，某些生成葡萄糖的外淀粉酶和生成麦芽糖的外淀粉酶通过缩短支链淀粉侧链选择性地减小支链淀粉有害的凝沉倾向，可以提供抗变陈效应。
然而，仍需要提供不同且有效的、最好更有效的延迟淀粉制品(特别是焙烤制品，更特别为面包制品)有害凝沉(诸如延迟变陈)的方法。
发明概述
本发明提供有害凝沉延迟性能的淀粉制品的生产方法。
本发明也提供可用于本发明方法的酶。
本发明的酶为淀粉酶。更具体地讲，本发明的酶为非生成麦芽糖的外淀粉酶。
应该注意，非生成麦芽糖的外淀粉酶迄今尚未用以延迟淀粉制品有害凝沉，更不用说延迟焙烤制品的变陈了。
因此，按照本发明的第一方面，提供淀粉制品的生产方法，包括向淀粉介质中加入非生成麦芽糖的外淀粉酶，所述外淀粉酶能够通过从支链淀粉侧链的非还原末端切下主要由4-8个D-吡喃葡糖基单位组成的线性麦芽寡糖而水解淀粉。
将非生成麦芽糖的外淀粉酶加入淀粉介质中可以发生在所述淀粉制品加热期间和/或之后。
因此，按照本发明的第二方面，提供用按照本发明的方法获得的焙烤制品。
因此，按照本发明的第三方面，提供面团增酵剂组合物；其中所述组合物包含一种非生成麦芽糖的外淀粉酶和至少一种另一面团组分或面团添加剂。
因此，按照本发明的第四方面，提供非生成麦芽糖的外淀粉酶在淀粉制品中延迟淀粉制品有害凝沉方面的应用。
因此，按照方面的第五方面，提供一种新的非生成麦芽糖的外淀粉酶。
本发明的这些方面和其它方面陈述于所附的权利要求书中，另外，以下陈述并讨论本发明的这些方面和其它方面及其优选方面。一般定义
因此，本发明涉及能够延迟淀粉介质、尤其是淀粉凝胶有害凝沉的蛋白质的应用。
在一个优选方面，本发明涉及能够延迟淀粉变陈的蛋白质的应用。
另一方面，本发明涉及能够延迟淀粉介质诸如淀粉凝胶有害凝沉的蛋白质的应用。
按照本发明，术语“淀粉”是指淀粉本身或其组分，尤其是支链淀粉。
按照本发明，术语“淀粉介质”是指包含淀粉的任何合适的介质。
术语“淀粉制品”是指含有或基于或衍生自淀粉的任何制品。
所述淀粉制品最好含有或基于或衍生自得自小麦粉的淀粉。
本文所用的术语“小麦粉”是小麦或其它谷物的细磨粉的同义词。然而，该术语最好是是指得自小麦本身而不是得自另一种谷物的面粉。因此，除非另有说明，否则本文所用的术语“小麦粉”最好是指小麦粉本身以及存在于介质中时的小麦粉，诸如面团。
优选的面粉是小麦粉或黑麦粉或小麦粉和黑麦粉的混合物。然而，也设想了包含得自其它类型谷物诸如水稻、玉米、大麦和高粱的面粉的面团。
所述淀粉制品优选面包房产品。
所述淀粉制品更优选面包制品。
所述淀粉制品甚至更优选焙烤面粉面包制品。
术语“焙烤面粉面包制品”不用说是指这样的任何焙烤制品，所述制品基于磨碎谷物并对通过将面粉、水、发酵剂和在面团成形条件下混合可获得的面团焙烤而制成。然而，正是在本发明范围内的是，可以将另外的组分加入所述面团混合物中。
术语“淀粉酶”以其通常的意义使用-例如为特别是能够催化淀粉降解的酶。特别是，它们是能够切割淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。
术语“非生成麦芽糖的外淀粉酶”是指该酶最初不将淀粉降解为大量的麦芽糖。在一个高度优选的方面，该术语也是指该酶最初不将淀粉降解为大量的麦芽糖和葡萄糖。
在本发明之前，还没有人建议将非生成麦芽糖的外淀粉酶用于延迟淀粉介质、特别是淀粉凝胶的有害凝沉。
以下叙述用于测定按照本发明的淀粉酶活性的合适测定。为了方便起见，该测定被称为“淀粉酶测定方案”。
因此，术语“非生成麦芽糖的外淀粉酶”最好是指如按照本文叙述的“淀粉酶测定方案”中所述的产物测定程序所分析的、最初不将淀粉降解为大量麦芽糖的酶。
在一个优选方面，所述非生成麦芽糖的外淀粉酶可以表征为，如果于50℃的温度、pH6.0下，将0.7单位的所述非生成麦芽糖的外淀粉酶在每ml缓冲液含10mg预沸腾的蜡质玉米淀粉、含有50mM2-(N-吗啉代)乙磺酸和2mM氯化钙的4ml水溶液中温育15分钟，则该酶将产生水解产物，所述产物包含一种或多种2-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖和可选的葡萄糖；使得至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少85％(重量)的所述水解产物包含3-10个D-吡喃配葡糖基单位的线性麦芽寡糖，优选包含4-8个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖。
为了易于参考以及为了本发明目的，于50℃的温度、pH6.0下，将0.7单位的所述非生成麦芽糖的外淀粉酶在每ml缓冲液含10mg预沸腾的蜡质玉米淀粉、含有50mM2-(N-吗啉代)乙磺酸和2mM氯化钙的4ml水溶液中温育15分钟，可以将此特征称为“蜡质玉米淀粉温育试验”。
因此，换句话说，优选的非生成麦芽糖的外淀粉酶的特征为在蜡质玉米淀粉温育试验中有能力产生这样的水解产物，所述产物包含一种或多种2-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖和可选的葡萄糖；使得至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少85％(重量)的所述水解产物包含3-10个D-吡喃配葡糖基单位的线性麦芽寡糖，优选包含4-8个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖。
蜡质玉米淀粉温育试验中的水解产物包括一种或多种2-10个D-吡喃葡糖基单位和可选的葡萄糖的线性麦芽寡糖。蜡质玉米淀粉温育试验中的水解产物也可以包括其它水解产物。然而，3-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖的％(重量)基于由一种或多种2-10个吡喃葡糖基单位和可选葡萄糖组成的水解产物的量。换句话说，3-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖的％(重量)不基于除一种或多种由2-10个D-吡喃葡糖基单位和葡萄糖组成的麦芽寡糖以外的水解产物。
可以用任何合适的方法分析所述水解产物。例如，可以用配有脉冲电流测定的Dionex PA 100柱以及用例如由葡萄糖至麦芽七糖组成的已知线性麦芽寡糖作为标准，通过阴离子交换HPLC分析所述水解产物。
为了易于参考以及为了本发明的目的，用配有脉冲电流测定的Dionex PA 100柱以及用由葡萄糖至麦芽七糖组成的已知线性麦芽寡糖作为标准，通过阴离子交换HPLC分析所述水解产物，可以将此特征称为“通过阴离子交换分析”。当然，正如刚刚指出的，其它分析技术以及其它的特定阴离子交换技术能满足要求。
因此，换句话说，优选的非生成麦芽糖的外淀粉酶的特征为在蜡质玉米淀粉温育试验中有能力产生这样的水解产物，所述产物包含一种或多种由2-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖和可选葡萄糖组成，其中能够通过阴离子交换分析所述水解产物；使得至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少85％(重量)的所述水解产物包含3-10个D-吡喃配葡糖基单位的线性麦芽寡糖，优选包含4-8个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖。
关于本发明所用的术语“线性麦芽寡糖”以通常的含义使用，是指以α-(1→4)键连接的2-10个α-D-吡喃葡萄糖单位。
术语“可得自嗜糖假单胞菌的”是指该酶不需要一定得自嗜糖假单胞菌。而是该酶可以利用重组DNA技术制备。
关于可得自嗜糖假单胞菌的酶的术语“其功能等同物”，是指该功能等同物可以得自其它来源。功能等同的酶可以具有不同的氨基酸序列，但具有非生成麦芽糖的外淀粉酶活性。所述功能等同的酶可以具有不同的化学结构和/或分子式，但具有非生成麦芽糖的外淀粉酶活性。所述功能等同酶的非生成麦芽糖的外淀粉酶活性不需要一定与得自嗜糖假单胞菌的非生成麦芽糖的外淀粉酶相同。对于某些应用而言，所述功能等同酶具有的活性分布型最好至少与得到嗜糖假单胞菌的酶一样。
术语“可得自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的”是指该酶不需要一定得自克劳氏芽孢杆菌。而是该酶可以利用重组DNA技术制备。
关于可得自克劳氏芽孢杆菌的酶的术语“其功能等同物”，是指该功能等同物可以得自其它来源。功能等同的酶可以具有不同的氨基酸序列，但具有非生成麦芽糖的外淀粉酶活性。所述功能等同的酶可以具有不同的化学结构和/或分子式，但具有非生成麦芽糖的外淀粉酶活性。所述功能等同酶的非生成麦芽糖的外淀粉酶活性不需要一定与得自克劳氏芽孢杆菌的非生成麦芽糖的外淀粉酶相同。对于某些应用而言，所述功能等同酶具有的活性分布型最好至少与得到克劳氏芽孢杆菌的酶一样(诸如图7所示的反应性分布型)。一般评述
本发明基于这样一个惊人的发现，即非生成麦芽糖的外淀粉酶在延迟或减少淀粉制品、特别是焙烤制品的有害凝沉诸如变陈方面非常有效。
我们已经发现，按照本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶在延迟面包中的有害凝沉诸如变陈方面可以比生成葡萄糖和生成麦芽糖的外淀粉酶更有效。
有害凝沉的减少可以用本领域已知的标准技术测量。例如，以下在题为“用于测量凝沉的测定”一节中叙述了某些技术。
在我们的研究中，我们已经发现，通过在面团中加入足够量活性的非生成麦芽糖的外淀粉酶，象例如具有足够热稳定性的外麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)，提供诸如在贮藏条件下与对照面包相比，有害凝沉减少、在某些情况下显著减少的焙烤制品。相比之下，加入等量活性的、其热稳定性与所示非生成麦芽糖的外淀粉酶相当的生成麦芽糖的外淀粉酶对有害凝沉的减少作用显著降低。因此，非生成麦芽糖的外淀粉酶的抗凝沉效应比生成麦芽糖的外淀粉酶的抗凝沉效应更有效。我们相信，这种差异可能部分起因于支链淀粉侧链缩短的程度。我们也相信，当采用按照本发明的释放麦芽七糖和/或麦芽八糖和/或麦芽六糖的非生成麦芽糖的外淀粉酶时，所述抗凝沉效应可能甚至更显著。
在我们的研究中，我们也纯化并特征鉴定了于高pH下产生麦芽六糖的产物特异性淀粉酶活性。从克劳氏芽孢杆菌BT-21的耐碱菌株中分离出该淀粉酶。
此外，我们已经发现，通过采用按照本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶可获得的有害凝沉的延迟，在非常宽的范围内为剂量反应性的。这与得自生成麦芽糖的外淀粉酶的效应形成对比，生成麦芽糖的外淀粉酶的效应是相当有限的，并且具有强烈降低的剂量反应。淀粉酶
一方面，本发明提供某些淀粉酶制备淀粉制品诸如面包房产品的应用。在该方面，为非生成麦芽糖的外淀粉酶的淀粉酶延迟或减少淀粉制品、特别是焙烤面粉面包制品的变陈性能(即降低变陈速率)。
所述淀粉酶最好为分离的形成和/或大致纯形式。在此，术语“分离的”是指该酶不处于其天然环境中。
如上所述，本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶最初不将淀粉降解为大量的麦芽糖。
按照本发明，所述非生成麦芽糖的外淀粉酶能够从支链淀粉侧链的非还原末端切下主要是由4-8个D-吡喃葡糖基单位组成的线性麦芽寡糖。根据在淀粉酶测定方案(参见下文)中叙述的模型系统中其水解凝胶化蜡质玉米淀粉的能力，鉴定具有该特征并适用于本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶。
当在淀粉酶测定方案中于所需条件下温育15分钟时，适于按照本发明使用的非生成麦芽糖的外淀粉酶将产生这样的水解产物，所述水解产物包含一种或多种由2-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖和可选的葡萄糖组成，使得水解产物的产物类型包含至少60％(重量)、特别是至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的非麦芽糖和葡萄糖的淀粉水解降低产物。
关于本发明的一个优选方面，当在蜡质玉米淀粉温育试验描述的条件下温育15分钟时，适合按照本发明使用的非生成麦芽糖的外淀粉酶将提供所述水解产物，使得所述水解产物具有的产物模式为至少60％(重量)、特别是至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的3-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖，特别是由4-8个D-吡喃葡糖基单位构成的线性麦芽寡糖。
在本发明的一个更优选方面，所述试验中的所述水解产物具有的产物模式为至少60％(重量)、特别是至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少85％(重量)的4或6个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖。
在本发明的一个更优选方面，所述试验中的所述水解产物具有的产物模式为至少60％(重量)、特别是至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少85％(重量)的4个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖。
在本发明的一个更优选方面，所述试验中的所述水解产物具有的产物模式为至少60％(重量)、特别是至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少85％(重量)的6个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖。
较好的是，所述非生成麦芽糖的外淀粉酶基本上不水解其初级产物，以将其转化为葡萄糖、麦芽糖或麦芽三糖。如果是这种情况，则所述初级产物将作为底物与支链淀粉的非还原链末端竞争该酶，使得其抗凝沉效率降低。
因此，较好的是，当在类似于蜡质玉米淀粉温育试验的条件、但其中将15分钟延长至300分钟的条件下温育所述非生成麦芽糖的外淀粉酶300分钟时，as an aside，为了方便起见，对于这种情况，这种改进的蜡质玉米淀粉温育试验可以称为“延长的蜡质玉米淀粉温育试验”，仍将产生所述水解产物，其中所述水解产物具有的产物模式将为至少50％、特别是至少60％(重量)、更优选至少70％(重量)、最优选至少80％(重量)的4-8个D-吡喃葡糖基单位。
例如，可用于本发明方法的非生成麦芽糖的外淀粉酶可以表征为，它在蜡质玉米淀粉温育试验中能够产生包含一种或多种2-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖和可选葡萄糖的水解产物，使得至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少85％(重量)的所述水解产物包含3-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖，优选由4-8个D-吡喃葡糖基单位构成的线性麦芽寡糖；并且其中所述酶可得自嗜糖假单胞菌或为其功能等同物。
作为另一实例，可用于本发明方法的另一非生成麦芽糖的外淀粉酶可以表征为，它在蜡质玉米淀粉温育时间中能够产生包含一种或多种2-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖和可选葡萄糖的水解产物；使得至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少85％(重量)的所述水解产物包含3-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖，优选由4-8个D-吡喃葡糖基单位构成的线性麦芽寡糖；并且其中所述酶可得自克劳氏芽孢杆菌或为其功能等同物；并且其中所述酶的分子量约101,000Da(通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳估计)和/或所述酶于pH9.5和55℃下有最佳活性。
最好是，适合按照本发明使用的非生成麦芽糖的外淀粉酶在焙烤期间有活性，并且在于约55℃开始的淀粉粒凝胶化期间和之后水解淀粉。热稳定性越好，则所述非生成麦芽糖的外淀粉酶可以有活性的时间越长，因此，提供的抗变陈效应越大。然而，在于约85℃以上的温度焙烤期间，所述非生成麦芽糖的外淀粉酶优先逐渐被失活，使得在焙烤过程之后在成品面包中基本上无活性。因此，较好的是，当于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃下，在具有4ml溶液(10mg/ml蜡质玉米淀粉的50mMMES、2mM氯化钙的pH6.0，如上所述制备，并如上所述根据水解产物的释放进行分析)的试管中温育15分钟时，适合按照本发明使用的非生成麦芽糖的外淀粉酶的最适温度高于45℃并低于98℃。所述非生成麦芽糖的外淀粉酶的最适温度最好高于55℃并低于95℃，更优选高于60℃并低于90℃。
通过采用蛋白质工程可以改进发现热稳定性可以较低的非生成麦芽糖的外淀粉酶，使其变得热稳定性更强，因此更适合按照本发明使用。因此，本发明设想了使用通过蛋白质工程修饰而变得更加热稳定的非生成麦芽糖的外淀粉酶。
众所周知，某些非生成麦芽糖的外淀粉酶可以具有某种程度的内淀粉酶活性。在某些情况下，可以需要降低或消除这种类型的活性，因为内淀粉酶活性由于积累分支的糊精而产生坚硬或胶粘的面包瓤，而可能负面影响成品面包制品的质量。
因此，在一个优选方面，本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶每单位外外淀粉酶活性具有低于0.5内淀粉酶单位(EAU)。
适合按照本发明使用的非生成麦芽糖的外淀粉酶每单位外淀粉酶活性优选具有低于0.05EAU的内外淀粉酶活性，更优选每单位外淀粉酶活性低于0.01 EAU的内淀粉酶活性。
所述内淀粉酶单位可以利用下述内淀粉酶测定方案测定。
适合按照本发明使用的非生成麦芽糖外淀粉酶的实例包括外麦芽四糖水解酶(EC.3.2.1.60)、外麦芽五糖水解酶和外麦芽六糖水解酶(E.C 3.2.1.98),它们水解淀粉多糖中的1,4-α-糖苷键，以便从还原链末端分步去除连续的麦芽四糖、麦芽五糖或麦芽六糖残基。实例是嗜糖假单胞菌和施氏假单胞菌的外麦芽四糖水解酶(EP-0 298 645 B1)、嗜碱性革兰氏阳性细菌(US 5,204,254)和假单胞菌属菌种(Shida等Biosci.Biotechnol.Biochem.,1992,56,76-80)的外麦芽五糖水解酶以及芽孢杆菌属菌种#707(Tsmkamoto等，Biochem.Biophys.Res Commun.,1988,151,25-31)、环状芽孢杆菌F2(Taniguchi,ACS Symp.,1991,Ser.458,111-124)和产气气杆菌(Aerobacter aetogenes)(Kainuma等，Biochim,Biophys.Acta,1975,410,333-346)的外麦芽六糖水解酶。
适合按照本发明使用的非生成麦芽糖外淀粉酶的另一实例是嗜碱芽孢杆菌属菌株GM8901的外淀粉酶(28)。这是一种由淀粉产生麦芽四糖以及麦芽五糖和麦芽六糖的非生成麦芽糖的外淀粉酶。
此外，适合按照本发明使用的非生成麦芽糖外淀粉酶也包括水解淀粉多糖中1,4-α-糖苷键以从非还原链末端分别去除麦芽七糖或麦芽八糖的残基的外麦芽七糖水解酶或外麦芽八糖水解酶。或者通过筛选野生型菌株可以发现外麦芽七糖水解酶和外麦芽八糖水解酶，或者可以通过蛋白质工程从其它淀粉分解酶研制外麦芽七糖水解酶和外麦芽八糖水解酶。因此，通过蛋白质工程从其它淀粉分解酶研制而成为非生成麦芽糖的外淀粉酶的非生成麦芽糖的外淀粉酶，也适用于本发明。新的淀粉酶
一方面，本发明也提供适用于按照本发明制备淀粉制品诸如面包房产品的新的淀粉酶。本发明的新淀粉酶为非生成麦芽糖的外淀粉酶。在我们的研究中，我们已经特征鉴定了适用于制备食品、特别是用于制备面包房产品的面团的这种新淀粉酶。
因此，本发明也提供非生成麦芽糖的外淀粉酶，其中所述非生成麦芽糖的外淀粉酶的特征还在于，它在蜡质玉米淀粉温育试验中能够产生包含一种或多种2-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖和可选葡萄糖的水解产物；使得至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少85％(重量)的所述水解产物包含3-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖，优选由4-8个D-吡喃葡糖基单位构成的线性麦芽寡糖；并且其中所述酶可得自克劳氏芽孢杆菌或为其功能等同物；并且其中所述酶的分子量约101,000Da(通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳估计)和/或所述酶于pH9.5和55℃下有最佳活性。
所述淀粉酶最好为分离的形成和/或大致纯形式。在此，术语“分离的”是指该酶不处于其天然环境中。抗体
本发明的酶也可以用来产生抗体，诸如利用标准技术产生抗体。因此，可以产生针对按照本发明的每种酶的抗体。所述抗体或某种抗体可以用来筛选其它合适的按照本发明的淀粉酶。另外，所述抗体或每种抗体可以用来分离一定量的本发明的酶。
关于抗体的生产，通过注射抑制剂或其任何部分、变异体、同系物、片段或衍生物或保留免疫原性特性的寡肽，可以免疫各种宿主，包括山羊、兔子、大鼠、小鼠等。根据宿主的种类，可以用不同的佐剂增强免疫应答。这类佐剂包括但不限于氟氏佐剂、矿物质凝胶诸如氢氧化铝和表面活性物质诸如溶血卵磷脂、多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔戚血蓝蛋白和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)是可以使用的潜在有用的人用佐剂。
甚至可以采用提供用培养的连续细胞系生产抗体分子的任何技术，制备针对所述酶的单克隆抗体。这些技术包括但不限于最初由Koehler和Milstein描述的杂交瘤技术(1975 Nature 256:495-497)、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等(1983)Immunol Today 4:72；Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss INc，第77-96页)。另外，可以采用研制用于生产“嵌合抗体”、将小鼠抗体基因剪接至人抗体基因以获得具有合适抗原特异性和生物活性的分子的技术(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855；Neuberger等(1984)Nature 312:604-608；Takeda等(1985)Nature 314:452-454)。或者，可以采用描述用于生产单链抗体的技术(US-A-4946779)来生产抑制剂特异性单链抗体。
·通过在淋巴细胞群体中诱导体内生产，或通过筛选重组免疫球蛋白文库或如Orlandi等(1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837)和WinterG和Milstein C(1991；Nature 349:293-299)公开的多组(panels)高度特异性结合试剂，也可以生产抗体。增酵剂组合物
如上所述，本发明的一个方面涉及用于淀粉制品、特别是面团和/或由所述面团制作的焙烤面粉面包制品的增酵剂组合物。
所述增酵剂组合物包含按照本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶和至少一种另一面团组分或面团添加剂。
按照本发明，所述另一面团组分或面团添加剂可以是上述的任何面团组分和面团添加剂。
有利的是，所述增酵剂组合物为干粉组合物，包含与至少一种另一组分或添加剂混合的按照本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶。然而，所述增酵剂组合物也可以是液体制剂，包含溶解或分散于水或其它液体中的按照本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶和至少一种另一组分或添加剂。应该理解，所述增酵剂组合物中的酶活性的量将取决于形成所述增酵剂组合物的所述另一组分和添加剂的量和类型。
可选的是，所述增酵剂组合物可以为完全混合物的形式，即一种所谓的预混合物，含有用于制备特定焙烤制品的所有干组分和添加剂。淀粉制品的制备
按照本发明的一个方面，所述方法包括通过向淀粉介质中加入合适的非生成麦芽糖的外淀粉酶，诸如本文所述的新的非生成麦芽糖的外淀粉酶之一，形成所述淀粉制品。
如果所述淀粉介质为面团，则通过将面粉、水、按照本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶和其它可能的组分和添加剂混合在一起，制备所述面团。
作为另一实例，如果所述淀粉制品是焙烤面粉面包制品(这是高度优选的实施方案)，则所述方法包括以任何合适的顺序，将面粉、水和发酵剂在面团成形条件下混合，再加入合适的非生成麦芽糖外淀粉酶。
所述发酵剂可以是一种化学发酵剂，诸如碳酸氢钠或任何酿酒酵母(面包酵母)的任何菌株。
所述非生成麦芽糖的外淀粉酶可以与包括水或面团组分混合物在内的任何面团组分或与任何添加剂或添加剂混合物一起加入。
可以采用焙烤工业或制作基于面粉面团的制品的任何其它工业常用的常规面团制备方法，制备所述面团。
通常通过于180-250℃范围的烤炉温度下将发酵面团焙烤15-60分钟，完成面粉面包制品诸如白面包、由过筛黑麦粉和小麦粉制作的面包、面包卷等的焙烤。在焙烤期间在外层面团层经常为陡峭的温度梯度(200→120℃)，其中产生焙烤制品特征性的面包皮。然而，由于产生蒸汽引起的热的消耗，在焙烤过程结束时面包瓤中的温度仅接近100℃。
所述非生成麦芽糖的外淀粉酶可以作为液体制剂或作为干粉组合物加入，所述液体制剂或干粉组合物或者包含所述酶作为唯一的活性组分，或者包含与一种或多种额外的面团组分或面团添加剂混合的所述酶。
为了进一步改进焙烤制品的特性并赋予所述焙烤制品不同的质量，可以将另外的面团组分和/或面团添加剂掺入面团中。通常，这类另外加入的组分可以包括面团组分诸如盐、谷粒、油脂、糖、食物纤维物质、奶粉、谷蛋白和面团添加剂，诸如乳化剂、其它酶、水解胶体、食用香料、氧化剂、矿物质和维生素。
乳化剂可用作面团增强剂(strengthener)和面包瓤防硬剂。作为面团增强剂，所述乳化剂可以提供对面团发酵时间(resting time)的耐受和对醒发期间冲击的耐受。此外，面团增强剂将改善给定面团对发酵时间变化的耐受。大多数面团增强剂在烤炉中也改善面团在烤炉中鼓起，这意味着从醒发制品至焙烤制品的体积增加。最后，面团增强剂将乳化所述配方混合物中存在于的任何脂肪。
主要为甘油一酯特征的面包瓤的防硬归因于乳化剂和淀粉的直链淀粉部分之间的相互作用，这种相互作用导致与直链淀粉形成不溶性包含复合物，所述不溶性包含复合物在冷却时不再结晶且因此不导致面包瓤坚实。
可以用作另外的面团添加剂的合适的乳化剂包括卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乙酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乳酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的柠檬酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、食用脂肪酸蔗糖酯、硬脂酰-2-乳酸钠和硬脂酰-2-乳酸钙。
可以用作另外的面团添加剂的其它酶包括例如氧化还原酶，诸如葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶和抗坏血酸氧化酶；水解酶，诸如脂酶和酯酶；以及糖苷酶，如α-淀粉酶、支链淀粉酶和木聚糖酶。氧化还原酶诸如葡萄糖氧化酶和己糖氧化酶，可以用于面团增强和控制焙烤制品的体积，且可以加入木聚糖酶和其它半纤维素酶以改进面团处理性能、面包瓤的防硬和面包体积。脂酶可用作面团增强剂和面包瓤防硬剂，可以将α-淀粉酶和其它淀粉分解酶加入面团中以控制面包体积并进一步减小面包瓤坚实。
按照本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶的加入量通常为导致出现每kg面粉50-100,000单位、优选每kg面粉100-50,000单位的成品面团。在本发明的有用实施方案中，该量的范围为每kg面粉200-20,000单位。
在本文中，1单位的所述非生成麦芽糖的外淀粉酶定义为当于50℃在具有如下所述4ml含10mg/ml蜡质玉米淀粉的50mM MES、2mM氯化钙pH6.0的试管中每分钟释放相当于1μmol还原糖的水解产物的量。用淀粉酶制备的食品
本发明提供用于生产食品的合适的淀粉酶。也包括动物饲料在内的典型的食品包括乳制品、肉制品、禽产品、鱼制品和面包房产品。
所述食品最好是面包房产品，诸如上述面包房产品。加入本发明范围内的典型的面包房(焙烤)产品包括面包，诸如面包、面包卷、小奶油面包、馅饼基料等；椒盐卷饼、玉米粉煎饼、糕饼、曲奇饼、饼干、kracker等。淀粉酶分析方案
采用以下系统特征鉴定适合按照本发明使用的非生成麦芽糖的外淀粉酶。
作为原始背景资料，蜡质玉米支链淀粉(以WAXILYS 200可得自Roquette，法国)是支链淀粉含量非常高(高于90％)的淀粉。
在50mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、2mM氯化钙pH6.0的缓冲液中将20mg/ml蜡质玉米淀粉煮沸3分钟，随后于50℃温育并在半小时内使用。
1单位的所述非生成麦芽糖的外淀粉酶定义为当于50℃在具有如上所述4ml含10mg/ml蜡质玉米淀粉的50mM MES、2mM氯化钙pH6.0的试管中每分钟释放相当于1μmol还原糖的水解产物的酶。
用麦芽糖作为标准品，并采用Bernfeld,Methods Enzymol.,(1954),1,149-158的二硝基水杨酸法或本领域已知的用于定量分析还原糖的另一种方法，测定还原糖。
通过于50℃在具有4ml含10mg/ml蜡质玉米淀粉的上述缓冲液的试管中将0.7单位非生成麦芽糖的外淀粉酶温育15或300分钟，测定所述非生成麦芽糖的外淀粉酶的水解产物模式。通过将试管浸入沸水浴中3分钟终止反应。
采用配有脉冲电流测定的Dionex PA 100柱，采用乙酸钠、氢氧化钠和水作为洗脱剂，用从葡萄糖至麦芽七糖的已知线性麦芽寡糖作为标准品，通过阴离子交换HPLC分析并定量水解产物。用于麦芽八糖至麦芽十糖的反应因数为麦芽七糖的反应因数。内淀粉酶分析方案
将0.75ml酶溶液与6.75ml含0.5％(w/v)AZCL-淀粉酶(天青蛋白交联淀粉酶，可得自Megazyme，爱尔兰)的50mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、2mM氯化钙pH6.0于50℃一起温育。5、10、15、20和25分钟后，分别将1.0ml反应混合物转移至4.0ml包含4％TRIS(三(羟甲基)氨基甲烷)的终止溶液。
将终止的样品通过Whatman1号滤纸过滤，于590nm下对蒸馏水测量其光密度。应该稀释分析的酶溶液，使得获得的光密度为时间的线性函数。光密度对时间直线的斜率用来计算相对于标准品GRINDAMYLTM A1000(可得自Danisco Ingredients)的内淀粉酶活性，该标准品被定义具有1000内淀粉酶单位(EAU)/g。用于测量凝沉(包括变陈)的分析
关于本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶的抗变陈效应的评估，可以在利用Instron 4301通用食品结构分析仪或本领域相似的设备焙烤后1、3和7天，测量面包瓤的坚实度。
在本领域中传统使用的、用来评估按照本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶对淀粉凝沉效应的另一种方法基于DSC(示差扫描量热法)。由此测量得自用酶或不用酶(对照)焙烤的模型系统面团的面包瓤中凝沉支链淀粉的熔融熵。用于所述实施例的DSC设备为Mettler-ToledoDSC820，以每分钟10℃的温度梯度从20℃运行至95℃。为了制备样品，称量10-20mg面包瓤并将其转移到Mettler-Toledo铝盘中，然后密封。
所述实施例中所用的模型系统面团含有标准小麦粉和最适量的水或缓冲液，加入或不加入按照本发明的非生成麦芽糖的外淀粉酶。分别将它们在10g或50g Brabender Fainograph中混合6或7分钟。将面团样品置于带盖玻璃试管(15×0.8cm)中。将这些试管在水浴中进行焙烤：首先于33℃温育30分钟，然后以1.1℃/min的梯度从33℃加热至95℃，最后于95℃温育5分钟。随后，在DSC分析之前将试管贮藏于20℃的恒温箱中。概述
总之，本发明基于这样一个惊人的发现，即通过从支链淀粉的非还原链末端切下4-8个D-吡喃葡糖基单位的麦芽寡糖而水解淀粉、且具有足够程度的热稳定性的非生成麦芽糖的外淀粉酶，在延迟或减小焙烤制品有害凝沉方面非常有效。保藏
根据布达佩斯条约，于1999年3月12日将以下样品保藏于承认的保藏单位DSMZ(德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg lb,D-38124 Brauschweig)。BT-21 DSM保藏号DMS 12731
本发明也包括可得自那些保藏物和/可由那些保藏物表达的序列，也包括包含所述序列及其活性片段的实施方案。实施例小节和附图的介绍
现在仅作为实例，参考附图描述本发明，在附图中：
图1显示一曲线图；
图2显示一曲线图；
图3显示一曲线图；
图4显示一曲线图；
图5显示一曲线图；
图6显示一描绘图；和
图7显示一曲线图；
更详细地讲：
图1．在2％淀粉底物中于45℃培养的克劳氏芽孢杆菌BT-21的液体培养物中胞外淀粉分解活性(mU/ml)。◆可溶性淀粉，●支链淀粉，◆玉米淀粉，■全糙米。条带显示标准偏差。
图2．pH对产物特异性淀粉酶活性的影响。于55℃下pH的影响。
图3．温度对产物特异性淀粉酶活性的影响。于pH9.5下■加入5mM CaCl2、口不加入CaCl2时的影响。
图4．以在pH9.5加入5mM CaCl2下于增加的温度下温育后产物特异性淀粉酶残留活性测试的热稳定性。
图5．通过于55℃、pH9.5下将产物特异性淀粉酶(505mU/ml)与1％可溶性淀粉和5mM CaCl2一起温育形成的产物。○葡萄糖，×麦芽糖，口麦芽三糖，▲麦芽四糖，●麦芽五糖，■麦芽六糖。
图6．通过于pH9.5、55℃下将产物特异性淀粉酶(505mU/ml)与1％可溶性淀粉一起温育获得的HPAEC-PAD示踪图。A)不加入酶的可溶性淀粉，B)与酶一起温育30分钟。
图7．与已知淀粉切割作用的淀粉酶相比，克劳氏芽孢杆菌BT-21产物特异性淀粉酶的内活性和外活性的测定。蓝色的形成(最大量的％)对mM麦芽糖的产生作图。曲线的斜率显示内活性或外活性的优势。
实施例-A节
实施例1
嗜糖假单胞菌非生成麦芽糖的外淀粉酶的发酵和生产
1.1生产
嗜糖假单胞菌IAM第1544号得自日本东京大学，分子和细胞生物科学研究所IAM培养物保藏中心(IAM Culture Collection,Inst.ofMolecular and Cellular Biosciences,University of Tokyo,Japan)。
在Applikon ADI的3升生物反应器中进行该菌株的发酵，工作体积为2升，条件如下：温度： 30℃搅拌速率： 1000rpm通气： 每分钟每体积培养基1体积空气pH： 恒定pH7.4，用2M氢氧化钠和10％(w/v)盐酸调节培养基：
细菌培养用胰蛋白胨 20g/l
细菌培养用酵母提取物 20g/l
淀粉 20g/l
Na2HO4·2H2O 5.6g/l
KH2PO4 1.5g/l
发酵1天后，将发酵肉汤离心并过滤以去除细胞。无细胞肉汤中非生成麦芽糖的外淀粉酶活性如上所述测定为5单位/ml。1.2嗜糖假单胞菌非生成麦芽糖的外淀粉酶的纯化
通过疏水相互作用色谱，用以200mM硫酸钠、50mM三乙醇胺、2mM氯化钙pH7.2的A缓冲液平衡的150ml苯基葡聚糖FF低sub柱(Pharmacia，瑞典)，部分纯化嗜糖假单胞菌非生成麦芽糖的外淀粉酶。将过滤的发酵肉汤(500ml)调节至200mM硫酸钠和pH7.2，上样至柱上。所述非生成麦芽糖的外淀粉酶用线性降低的硫酸钠的A缓冲液梯度洗脱。合并含外淀粉酶活性的流分。
合并的流分用水稀释3次，在用50mM三乙醇胺、5mM氯化钙pH7.5的A缓冲液平衡的150ml Q-Sepharose FF(Phannacia)柱上，通过阴离子交换色谱进一步纯化。所述非生成麦芽糖的外淀粉酶用0-1M氯化钠的A缓冲液线性梯度洗脱。合并含有外淀粉酶活性的流分。这种部分纯化的制备物用于下述的试验。该制剂的活性为14.7单位/ml，当在对淀粉酶活性染色的聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中测试时仅有一条淀粉酶活性条带。1.3 嗜糖假单胞菌非生成麦芽糖的外淀粉酶的特征鉴定
作为介绍，编码嗜糖假单胞菌外淀粉酶的基因(我们称其为PS4)的DNA序列已经由Zhou等发表(Zhou JH,Baba T,Takano T,KobayashiS,Arai Y(1989)FEBS Lett 1989 Sep 11；255(1):37-41“嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶基因的核苷酸序列”。另外，所述DNA序列可以在GenBank中选取，登录号为X16732。
我们现在已经通过质谱(MALDI-TOFF)测定了纯化的PS4酶的MW，为57500±500D，这与得自该序列的理论MW为57741 D相符合。
根据Zhou等所述(Zhou JH,Baba T,Takano T,Kobayashi S,Arai Y(1992) Carbohydr Res 1992 Jan；223:255-61“嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶基因(mta)在大肠杆菌中表达的酶的特性”)，PS4的最适温度和最适pH为45℃和pH6.5。
通过分析在具有4ml上述含10mg/ml蜡质玉米淀粉的试管中将0.7单位部分纯化的非生成麦芽糖的外淀粉酶于50℃温育15分钟或300分钟产生的水解产物，测定所述非生成麦芽糖的外淀粉酶的水解模式。
15分钟或300分钟后检测的水解产物的模式示于表1，表明嗜糖假单胞菌产生如本发明定义的非生成麦芽糖的外淀粉酶，并且该酶在15分钟和300分钟水解后释放麦芽四糖作为主要产物，所述麦芽四糖分别占85.8％(重量)和93.0％(重量)。表1： 嗜糖假单胞菌非生成麦芽糖外淀粉酶的从葡萄糖至麦芽十糖的水解产物
设定焙烤试验以实测嗜糖假单胞菌非生成麦芽糖的外淀粉酶的抗坚实效应。采用Danish烤面包配方。它含有面粉(2000g)、干酵母(30g)、糖(30g)、盐(30g)和水(约1200g，相当于面团稠度为400布拉班德尔单位(BU)+60g额外水，以补偿所用的干酵母)，在Hobart混合器(A-200型)中低速混合2分钟，高速混合12分钟。混合结束时面团温度为26℃。将面团于30℃静置10分钟，此后将面团切成750g的小块面团。小块面团在醒发成型室中于33℃的温度和85％的相对湿度下静置5分钟。然后将小块面团在Glimek成形机(LR-67型)中按以下设定成形：1∶4、2∶2、3∶14和4∶12，此后将成形小块面团转移至焙烤模，在醒发成形室中于33℃和85％的相对湿度下醒发50分钟。最后，将醒发的小块面团在Wachtel烤炉(AE 416/38 COM型)中于220℃、10秒的蒸汽下焙烤40分钟。
将部分纯化的嗜糖假单胞菌非生成麦芽糖的外淀粉酶制剂加入以1470单位/kg面粉配料的面团中。加入或不加入非生成麦芽糖的外淀粉酶下焙烤面包后，冷却至20℃，此后于20℃贮藏于塑料袋中。焙烤后第3天和第7天时，利用Instron 4301通用食品结构分析仪测定坚实度，取第3天时一个面包10片以及第天时测定平均2个面包，每个面包10片的平均值。表2显示，第3天和第7天观察到加入酶的面包中坚实度较低。表2．嗜糖假单胞菌非生成麦芽糖的外淀粉酶的抗坚实效应
表3显示，第7天时，嗜糖假单胞菌非生成麦芽糖的外淀粉酶的抗坚实效应在95％可信度上具有统计学显著性。表3.嗜糖假单胞菌非生成麦芽糖的外淀粉酶抗坚实效应的统计学分析由酶引起的第7天坚实度的AN0VA表变异分析来源 平方和 Df 均方 F-比率 P-值组间 144.0 1 144.0 72.00 0.0136组内 4.0 2 2.0总计(Corr.) 148.0 3The StatAdvisor
ANVOA表将第7天的坚实度方差分解为两个部分：组间部分和组内部分。F-比率在这种情况下为72.0，为组间估计与组内估计之比。由于F-检定的P-值低于0.05，因此在第7天平均坚实度从一种水平的酶至另一种水平的酶之间在95.0％可信度上有统计学显著性差异。为了确定哪种方法与其它方法显著不同，从表格选的列项表中选择多范围检定。
实施例3
以下描述我们在大肠杆菌MC1061中对嗜糖假单胞菌的编码非生成麦芽糖的外淀粉酶的mta基因的克隆和表达。
在该方面，使嗜糖假单胞菌IAM 1520在2ml LB培养基中生长，通过20.000×g离心10分钟收获细胞。用略微改进的小量制备方案分离总DNA。将细胞再悬浮于300μl再悬浮缓冲液(50mM Tris-HCl,pH8.0；10mM EDTA；100μg/ml RNA酶A)中，此后用Fastprep FPl20(BIO10l；Califonia)破碎细胞。破碎后，加入300μl裂解缓冲液(200mMNaOH；1％SDS)和300μl中和缓冲液(3.0M乙酸钾，pH5.5)。于4℃以20,000×g离心15分钟后，收集上清液并加入0.6体积异丙醇。通过于4℃以20,000×g离心30分钟沉淀DNA，用70％乙醇洗涤，再溶于100μl TE(10mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)中。
关于PCR扩增，设计4种不同的PCR引物：#1 ATG ACG AGG TCC TTG TTT TTC 位置213-233#2 GCT CCT GAT ACG ACA GCG 位置2403-2386#3 GCC ATG GAT CAG GCC GGC AAG AGC位置663-683 CCG#4 TGG ATC CTC AGA ACG AGC CGC TGG T位置2258-2238
所述位置是指GenBank登录号X16732中发现的mta序列的位置。较高数值在前的引物是反义引物，所述序列为互补序列。粗体表示不与模板DNA互补的核苷酸，在引入的限制位置下划线。)#3引物引入一个独特的Ncol位点，#4引物引入一个BamHⅠ位点，用来在随后在表达载体pBAD/gⅢ(Invitrogen)中克隆。
用50-150ng基因组IAM1520 DNA作为模板，采用Expand DNA聚合酶(Boehringer Mannheim；德国)，按照生产商的说明和以下扩增方案：94℃2分钟，(94℃1分钟，58℃2分钟，72℃2分钟)，进行35个循环，最后于72℃5分钟，用以下引物组合进行第一次PCR扩增：
反应1 #1+#2得到2190bp的片段。
用“gene clearn kit”(BIO101；Califomia)从凝胶中分离2190bp的片段。采用如上所述的相同扩增方案，在采用以下引物组合的第二次PCR中，该片段用作模板DNA：
反应2 #3+#4得到1605bp的片段。
纯化1605bp的片段，并按照生产商的说明将其克隆入pCR-BLUNT载体(Invitrogen)。通过采用单染料测序技术和ALF测序仪(Pharmacia；瑞典)，采用通常引物和反向引物以及四种标记的内部引物测序，证实所克隆片段的序列。
CAT CGT AGA GCA CCT CCA 999-982
GAT CAT CAA GGA CTG GTC C 1382-1400
CTT GAG AGC GAA GTC GAA C 1439-1421
GAC TTC ATC CGC CAG CTG AT 1689-1708
所述位置是指GenBank登录号X16732中发现的mta序列的位置。较高数值在前的引物是反义引物，所述序列为互补序列。
证实所述序列后，将所述mta基因克隆入表达载体pBAD/gⅢ(Invitrogen)中。通过用BamHⅠ消化，然后用Klenow片段平端化并用NcoⅠ消化，从pCR-BLUNT中释放出所述mta基因，纯化1602bp的片段。用NcoⅠ和PmeⅠ消化表达载体pBAD/gⅢ并将其纯化。在连接后，将获得的表达构成物转化入大肠杆菌MC1061细胞中，按照pBAD/gⅢ手册(Invitrogen)表达所述蛋白。
实施例4非生成麦芽糖的外淀粉酶和生成麦芽糖的外淀粉酶对淀粉凝沉影响的比较
甘薯β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；得自Sigma，产品号为A7005)为从淀粉的非还原末端释放麦芽糖的生成麦芽糖的外淀粉酶。于45-75℃下在50mM柠檬酸钠、5mM氯化钙pH6.5中温育15分钟后的残留活性表明(表4)，这种生成麦芽糖的外淀粉酶的热稳定性与嗜糖假单胞菌的非生成麦芽糖的外淀粉酶的相似。表4．于增加的温度下温育后甘薯β-淀粉酶和嗜糖假单胞菌的非生成麦芽糖外淀粉酶的残留活性(以％计)a
已经通过“用于测量凝沉和变陈的测定”中所述的得自模型系统面团焙烤制品和贮藏制品的DSC分析，测试了两种酶对淀粉凝沉的效应。关于该测试，将按照“淀粉酶测定方案”分析的485单位的嗜糖假单胞菌的非生成麦芽糖外淀粉酶和735单位的甘薯β-淀粉酶用于所述面团。制备不加(对照)或加入酶的50g标准Danish小麦粉(Danisco98022)与30.7ml 50mM柠檬酸钠、5mM氯化钙pH6.5制成的面团。
贮藏7天后，通过测量其熔融熵定量测定凝沉的支链淀粉的量。通过统计学分析，发现两种酶均显著减少淀粉凝沉(表5)；即在第7天时嗜糖假单胞菌的非生成麦芽糖外淀粉酶将凝沉支链淀粉的量降至对照(2.05J/g)的86％(1.77J/g)，而甘薯β-淀粉酶将凝沉支链淀粉的量降至对照的96％(1.96J/g)。总之，嗜糖假单胞菌的非生成麦芽糖外淀粉酶对于减少凝沉和变陈而言比具有相当热稳定性的所述生成麦芽糖外淀粉酶显然有效得多。表5．根据测量焙烤后7天凝沉支链淀粉熔融熵(以J/g计)的嗜糖假单胞菌的非生成麦芽糖外淀粉酶(PS4)和甘薯β-淀粉酶(SP2)对淀粉凝沉的效应通过处理对于熔融熵的多范围测试方法： 95.0％LSD处理 计数 均值PS4 13 1.77154SP2 22 1.96273对照 6 2.05167对比 差异 +/-极限对照-PS4 *0.280128 0.0941314对照-SP2 *0.0889394 0.087841PS4-SP2 *-0.191189 0.06672*表示统计学显著差异。
该表应用多比较方法，以确定哪种方法与其它方法显著不同。输出的下半部份显示每对平均值之间的估计差异。在3对后标有星号，表明这些对在95,0％可信度下具有统计学显著性差异。在所述方法中目前用于鉴别的方法是Fisher最小显著性差异(LSD)法。
实施例-B节材料和方法
材料-得自玉米的支链淀粉和直链淀粉、玉米淀粉、羧甲基纤维素(CMC)、牛血清白蛋白(BSA)、葡聚糖、支链淀粉、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖至麦芽十糖的混合物得自Sigma Chemical Co.,St.Louis，美国。可溶性淀粉得自Merck KGaA,Darmstadt，德国。酵母提取物和胰蛋白胨得自 Difco Laboratories,Detroit，美国。使用得自 NeueAllgemeine Reisgesellschaft mbH,Hamburg，德国的糙米。药用级α-、β-和γ-环糊精得自Wacker Chemie Danmark Aps,Gostrup，丹麦。按照先前所述[32]制备麦芽四糖。除非另有说明，否则所有的化学药品均为分析级。
克劳氏芽孢杆菌BT-21的分离-该菌株从在丹麦Assens收集的土壤样品分离，并由DSMZ(德国Braunschweig的德意志微生物保藏中心)鉴定。
所述酶的产生-克劳氏芽孢杆菌BT-21生长于最适化液体培养基中，所述培养基由2.0％马铃薯可溶性淀粉、玉米支链淀粉、玉米淀粉或全糙米、0.5％酵母提取物、0.5％胰蛋白胨、0.1％KH2PO4、0.1％Na2HPO4、0.02％ MgSO4·7H2O、0.02％ CaCl2·2H2O和0.1％(NH4)2SO4。高压灭菌后，加入无菌Na2CO3溶液至1％(约pH10)的终浓度。1ml甘油中的孢子悬液(贮藏于-80℃)用于接种100ml真正培养基，并在摇动培养箱(New Brunswick Scientific,Edison,N.J.，美国)中于45℃、200rpm培养18小时。用2ml该培养物接种具有200ml培养基的摇瓶，并于45℃在摇动培养箱中培养。以规律的间隔取出等分样品，测量600nm下的OD，以测定培养基中该菌株的生长。以9600rpm于4℃离心样品(4ml)10分钟，测定pH和淀粉酶活性。所有的生长试验均以一式三份进行。确定均值(X=(∑ni=1Xi)/n)和标准偏差值(std.=√∑ni=1(Xi-X)/(n-1))。
产物特异性淀粉酶的纯化-克劳氏芽孢杆菌BT-21在全糙米上生长52小时后，通过于4℃、9600rpm离心15分钟，从胞外液中去除细胞和全糙米粒。用通过将β-环糊精共价结合至环氧活化的sepharose6B基质(Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)制备的亲和凝胶[33]，纯化所述产物特异性淀粉酶。使胞外无细胞上清液与12g凝胶一起在4℃振摇下温育1小时。然后通过于4℃、9600rpm离心10分钟去除上清液。用75ml50mM磷酸缓冲液pH8.0洗涤凝胶，然后离心，去除未结合的蛋白。洗涤步骤重复7次。结合蛋白用45ml含10mMα-环糊精的50mM磷酸缓冲液pH8.0洗脱，然后离心。洗脱步骤重复4次。用α-环糊精洗脱该酶，因为β-和γ-环糊精干扰Bradford的蛋白测定法(1976)[34]。然后通过于4℃搅拌下对5L10mM三乙醇胺pH7.5透析(6-8 kDa Sepctra/Por透析膜，The Spectrum Companies,Gardena,CA,美国)，去除α-环糊精。2小时后更换缓冲液，然后再透析12小时。将透析袋细雨CMC中以浓缩样品。将10ml上样至HiTrap Q柱(5ml预填充的，Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)，用FPLC-系统(Pharmacia,Uppsala瑞典)。用25ml 10 mM三乙醇胺pH7.5以1.0ml/min的速率洗脱，然后在10mM三乙醇胺pH7.5中以20mM NaCl/min的梯度洗脱所述蛋白。所述酶于0.5M NaCl下洗脱出。用Bradford法(1976)[34]，用BIO-RAD Protein Assay (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA，美国)估计蛋白含量。将BSA用作标准品。
凝胶电泳-按照[35]所述方法，通过10％天然tris-甘油凝胶分析15μl样品。然后将凝胶置于50mM磷酸缓冲液pH6.5中振摇30分钟。将1％(w/v)可溶性淀粉溶液与凝胶一起温育，同时振摇45分钟。在缓冲液中洗涤后，将凝胶与碘溶液(4mM I2,160mM KI)一起温育，用缓冲液脱色。脱色的条带显示淀粉水解活性。
按照[36]所述进行SDS-PAGE(10％)，然后进行银染[37]。使用SDS-PAGE宽范围的分子量标准(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA，美国)。
酶测定-将2ml 0.1M硼酸缓冲液pH10.0中的可溶性淀粉溶液(1.25％)与0.5mL酶溶液一起于45℃温育2小时。通过将混合物煮沸10分钟终止反应。用CuSO4/二金鸡钠酸盐测定[38]测定还原糖的形成，并以形成的mM麦芽糖相当物计算。一单位活性相当于于pH10.0/45@下产生1μmol麦芽糖相当物的酶量。
酶的特征鉴定-关于最适温度的测定，将纯化的酶在终浓度为1％可溶性淀粉的0.1M硼酸缓冲液pH10.0(加入或不加入5mM氯化钙)中于30-90℃的温度下温育15分钟。通过将纯化的酶在含有5mM氯化钙的50mM甘油-NaOH缓冲液pH9.5中于30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃、90℃下温育30分钟，进行温度稳定性的测定。通过将热处理的酶在终浓度为1％可溶性淀粉的50mM甘油-NaOH缓冲液pH9.5中于55℃下温育15分钟，测定残留活性。通过将纯化的在含终浓度为1％可溶性淀粉的不同缓冲液中于55℃下温育15分钟，测定最适pH。所用的缓冲液为50mM柠檬酸(pH4.0-6.0)、50mM tris-马来酸(pH6.5-8.5)和50mM甘油-NaOH(pH9.0-11.0)。
按照Fuwa,154所述[39]制备I2-KI溶液(0.02％I2和0.2％KI)。以一式两份按照以下的改进测量淀粉-碘蓝色形成。以不同的时间间隔从可溶性淀粉的酶促水解物中取出500μl样品。然后加入250μl HCl和250μl I2-KI溶液。加入去离子水(4.0ml)并重复混合。于600nm下用分光光度计测量蓝色的形成。
用马铃薯可溶性淀粉、玉米支链淀粉、葡聚糖、支链淀粉(1％)、直链淀粉(0.1％)和10mMα-、β-和γ-环糊精测试所纯化酶对不同底物的水解。将底物溶于含5mM氯化钙的50mM甘油-NaOH缓冲液pH9.5中，并加入所纯化的酶(505mU/ml)。将各种底物于55℃温育，并以不同的时间间隔取出样品。通过煮沸10分钟终止反应，并如下所述分析样品。
用终浓度为2mM的麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖以及麦芽四糖至麦芽十糖的混合物(5mM)测试所纯化酶对麦芽寡糖的水解。将麦芽寡糖溶于含5mM氯化钙的50mM硼酸缓冲液pH9.5中，并加入所纯化的酶(147mU/ml)。将各种底物于55℃温育，并以不同的时间间隔取出样品。通过煮沸10分钟终止反应，并如下所述分析样品。
水解产物的分析-用配有脉冲电流检测的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)检测水解产物。使用 CarboPac PA-1 柱(DionexCorporation,Sunnyvale,CA，美国)和在30分钟内在100mM NaOH中的1.0M乙酸钠0-60％梯度，流速为1.0ml/min，使用Dionex DX-300或DX-500系统。通过将其保留时间与葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖和麦芽六糖比较，鉴定淀粉水解产物。由于同系物线性麦芽寡糖的保留时间随聚合度而增加，因此可以容易第鉴定出中等DP的线性麦芽寡糖[40,41]。结果和讨论
克劳氏芽孢杆菌BT-21的鉴定-根据其脂肪酸组成，所述菌株显示出与芽孢杆菌属的相似性。16SrDNA的部分序列显示出与克劳氏芽孢杆菌的相似性为99.4％。所述耐碱菌株的生理特性证实了这种鉴定。
由克劳氏芽孢杆菌BT-21产生淀粉酶活性-马铃薯可溶性淀粉、玉米淀粉、玉米支链淀粉和全糙米在所述培养基中产生不同水平的胞外淀粉酶活性，而与马铃薯淀粉相比，玉米淀粉含有更多的脂肪并且不含磷，而玉米支链淀粉具有含α-D-(1→6)O-糖苷键的高度分支的结构。这三种类型的淀粉在热凝胶化后可为酶利用，而全糙米含有米粒中包裹的可利用性较低的淀粉。具有不同淀粉底物的液体培养物的胞外液中的淀粉酶活性示于图1中。用全糙米作为底物获得了最高的淀粉分解活性。这表明，可利用性较低的淀粉底物的存在导致克劳氏芽孢杆菌BT-21产生的胞外淀粉分解活性增加。用麦麸获得了相似的结果，但麦麸难以在纯化所述酶之前从胞外液中去除。先前已经报道了诸如半乳糖、糖原和菊粉的碳源适用于用地衣芽孢杆菌生产淀粉酶[27]，并且已经发现可溶性淀粉为嗜热脂肪芽孢杆菌生产淀粉酶的最佳底物[28]。然而，这些研究中没有一项研究包括可利用性较低的淀粉底物。
产物特异性淀粉酶的纯化-通过β-CD Sepharose 6B亲和色谱，然后通过阴离子交换色谱纯化所述酶(表6)。
表6从克劳氏芽孢杆菌BT-21中纯化产物特异性淀粉酶 体积 活性 总活性 总蛋白 比活 得率 纯化 (ml) (mU/ml) (mU) (mg) (mU/mg ％ 因数 蛋白)胞外液 4000 155 620,000 424 731 100 1β-CD亲和色谱 704.5 88 62,137 8.5 3,647 10.0 5浓缩和透析 172.6 254 43,840 4.8 4,581 7.1 6.3阴离子交换 215 251 54,051 2.0 13,493 8.7 18.5色谱
活性染色的天然PAGE显示在胞外液中存在3种淀粉分解活性。在β-CD亲和色谱然后通过阴离子交换色谱后，将所述产物特异性酶与其它淀粉分解活性完全分离。所纯化酶制剂的SDS-PAGE表明，已经将所述产物特异性淀粉酶纯化至均质，其表观分子量约101 kDa。环糊精sepharose 6B亲和色谱先前已经用于通过阴离子交换色谱去除其它淀粉酶后作为最后的纯化步骤纯化α-淀粉酶[29]。所述产物特异性淀粉酶的酶得率为8.7％，而纯化因数为18.5，与这些作者报道的数值相似。
所述产物特异性淀粉酶的特征鉴定-所纯化的酶显示出于pH9.5下有最佳活性(图2)，而在存在或不存在5mM氯化钙下其活性的最适温度为55℃(图3)。该酶于pH9.5、5mM氯化钙存在下的热稳定性示于图4。高于55℃时，该酶在30分钟温育期间丧失其最大活性的75％。生成麦芽六糖[23]、麦芽五糖[24]和麦芽四糖[26]的5种其它产物特异性淀粉酶也显示出碱性的最适pH。这些酶的分子量估计为59、73和80kDa[23]、180kDa[24]和97kDa[26]，而克劳氏芽孢杆菌BT-21的产物特异性淀粉酶显示出估计的分子量为101kDa。这些产物特异性淀粉酶和α-淀粉酶中的大多数显示出50-65kDa范围内的较低的分子量[3、16、17、19和21]。高于55℃的最适温度与报道的上述产物特异性淀粉酶的最适温度[23、24和26]相似。
所纯化的产物特异性淀粉酶在1小时温育后，将可溶性淀粉水解为作为低DP主要原始产物的麦芽六糖和麦芽五糖(52％和19％的总水解产物)(图5)。温育2小时后麦芽六糖的量和4小时后麦芽五糖的量减少，而麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的量增加。这些产物在延长水解后积累，表明它们不再被进一步水解。淀粉水解24小时后，麦芽寡糖的量为(3％)麦芽六糖、(4％)麦芽五糖、(41％)麦芽四糖、(13％)麦芽三糖、(16％)麦芽糖和(4％)葡萄糖。用配有脉冲电流检测示踪的高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)在30分钟淀粉水解后获得的示踪结果(图6)表明，不存在比麦芽六糖(DP6)大的淀粉水解产物。形成麦芽四糖的产物特异性淀粉酶对可溶性淀粉水解的时间进程研究也表明，在水解早期优先产生麦芽六糖[23]。Kim等(1995)[26]发现，用形成麦芽六糖的产物特异性淀粉酶水解淀粉1小时后的原始水解产物主要为麦芽六糖(54％)，随后麦芽四糖和麦芽糖的量逐渐增加，同时麦芽六糖的量减少。20小时后，麦芽寡糖的组成已经变为0.6％麦芽六糖、1.3％麦芽五糖、53.2％麦芽四糖、8.3％麦芽三糖、27.6％麦芽糖和9％葡萄糖。
为了进一步检查所述酶在淀粉水解期间的作用模式，将不同底物与所纯化的酶一起温育(表7)。
表7
用所纯化的产物特异性酶(67mU/ml)水解各种淀粉底物生成的DP1-DP6范围的麦芽寡糖。数据以与底物初始量相比
形成的葡萄糖％(重量)表示水解 生成的产物(％)底物 时间(min) DP1 DP2 DP3 DP4 DP5 DP6可溶性淀粉(1％) 15 0 0 0 ＜0.1 0.9 7.2 240 0 0 0 0.6 7.0 17.8直链淀粉(0.1％) 15 0.2 0 0 0 2.4 13.6 240 1.5 0 4.1 7.7 6.3 20.0支链淀粉(1％) 15 ＜0.1 0 0 0 0.8 3.6 240 ＜0.1 0.5 0.1 0.9 9.2 24.8
淀粉由直链淀粉(20-30％)和支链淀粉(80-70％)组成。直链淀粉为α-D-(1→4)O-糖苷键连接的线性葡聚糖，而支链淀粉为由于分子中存在α-D-(1→6)O-糖苷键而产生的分支的葡聚糖。根据与可溶性淀粉(7％和17.8％)和直链淀粉(6.3％和20％)相比形成麦芽五糖(9.2％)和麦芽六糖(24.8％)表明，所述产物特异性淀粉酶大多数容易水解支链淀粉。所述酶不水解：支链淀粉，即由麦芽三糖主链组成的α-D-(1→6)O-糖苷键连接的葡聚糖；或右旋糖酐，即具有连接至0-3个所述主链单位的分支的α-D-(1→6)O-糖苷键连接的葡聚糖。α-、β-和γ-环糊精即由6、7和8个葡萄糖组成的环状麦芽寡糖甚至在24小时温育后也不被水解。
以右旋糖酐获得的结果表明，α-D-(1→6)O-糖苷键不被所述产物特异性淀粉酶切割。对支链淀粉缺乏活性表明，所述产物特异性淀粉酶不能绕过紧接3个葡萄糖单位的α-D-(1→6)O-糖苷键，或不能攻击这三个葡萄糖单位中的任何一个单位。对α-、β-或γ-环糊精不能水解表明，所述产物特异性淀粉酶通过外切割机制类型[30]水解淀粉。HPAEC-PAD示踪结果(图6)也显示出所述外类型的切割机制，因为不存在大于DP6的淀粉水解产物。
为了进一步检查所述酶对可溶性淀粉的切割作用，将淀粉-碘蓝色形成对还原糖的产生作图(图7)。该曲线的斜率显示普遍类型的淀粉分解性淀粉水解的切割机制[31]。内作用酶将产生的斜率与外作用酶相比数值较小。用得自A.oryzae的α-淀粉酶(斜率为-61)表明，斜率数值小是由于随机淀粉分解活性导致淀粉-碘蓝色复合物快速减少的结果。斜率数值较大(斜率为-13)表明，得自施氏假单胞菌的胞外酶制剂显示了普遍的外作用切割机制的证据。所纯化的产物特异性淀粉酶显示斜率数值为-6，表明为外作用。
通过与低DP底物一起温育，检查所述产物特异性淀粉酶对低DP底物的作用模式。麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖不被纯化的克劳氏芽孢杆菌BT-21的淀粉酶水解。这证实了关于可溶性淀粉获得的结果，即这些产物积累，并因此被认为是水解的终产物。
通过时间进程试验研究对DP4-DP10的麦芽寡糖的混合物的所述产物特异性淀粉酶活性。用HPAEC-PAD获得的峰面积变化相应于麦芽寡糖的生成或水解。麦芽六糖(DP6)的生成以及DP7、DP8、DP9和DP10的量的同时减少证实所述酶的麦芽六糖生成能力。然而，达到稳态条件后，甚至在水解7天后也检测不到通过淀粉水解发现的DP6的进一步降解。DP6的浓度低于淀粉水解时获得的DP6的浓度，表明麦芽四糖和麦芽糖生成的继续需要一定量的麦芽六糖。
发现克劳氏芽孢杆菌BT-21的产物特异性淀粉酶的淀粉水解类似两步法。该方法包括将淀粉初始主要水解为麦芽六糖和少量麦芽五糖，麦芽六糖和麦芽五糖进一步主要水解为麦芽四糖和麦芽糖，它们在延长的水解后积累。至麦芽四糖和麦芽糖的第二个水解步骤看来受到较大底物最初水解为麦芽六糖的限制，因为浓度依赖性看来是进行第二步的调节剂。焙烤试验
用所述产物特异性淀粉酶进行焙烤试验。用10g标准Danish小麦粉(Danico 98078)和6.2ml 0.2M NaOH-甘油缓冲液pH10以及不加入(对照)或加入40单位的所述酶(如B节材料和方法中所述于45℃、pH10下分析)制备面团，焙烤并在按照“用于测量凝沉和变陈的测定”贮藏后通过DSC分析。如表8所示，在焙烤后第7天发现，所述酶显著减少凝沉支链淀粉的量，表明它具有显著的抗变陈效应。表8．根据焙烤后7天测量凝沉支链淀粉的熔融熵(以J/g计)测定克劳氏芽孢杆菌的产物特异性淀粉酶对淀粉凝沉的效应通过处理对于熔融熵的多范围测试方法： 95.0％LSD处理 对照 均值酶 16 2.44375对照 16 2.56对比 差异 +/-极限对照-酶 *0.11625 0.0491094*表示统计学显著性差异。
已经用蒸馏水提取了焙烤后冷冻的焙烤制品的面包瓤样品(1g焙烤制品/10g水，搅拌1小时并离心)，并如上所述通过HPAEC-PAD分析，以检测在面团焙烤期间由所述酶生成的淀粉水解产物。相对于对照，发现麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖的积累是该酶活性的结果。概述小节
本发明公开了制作焙烤制品的方法以及适用于这种方法的淀粉酶。
通过编号的段落陈述本发明的优选实施方案。
1．变陈延迟的焙烤面粉面包制品的制备方法，包括向面团组分、面团添加剂或所述面团加入有效量的非生成麦芽糖外淀粉酶，所述非生成麦芽糖外淀粉酶能够在焙烤过程中通过从支链淀粉侧链的非还原末端切下主要由4-8个D-吡喃葡糖基单位组成的线性麦芽寡糖而水解淀粉。
2．根据段落1的方法，其中所述面粉为小麦粉或黑麦粉或小麦粉和黑麦粉的混合物。
3．根据段落1或2的方法，其中所述非生成麦芽糖的外淀粉酶的加入量范围为50-100,000单位/kg面粉，优选100-50,000单位/kg面粉。
4．根据段落3的方法，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的加入量范围为200-20,000单位/kg面粉。
5．根据段落1-4的方法，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的内淀粉酶活性低于0.5内淀粉酶单位(EAU)/单位外淀粉酶活性。
6．根据段落1-4的方法，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的内淀粉酶活性低于0.05内淀粉酶单位(EAU)/单位外淀粉酶活性。
7．根据段落1-4的方法，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的内淀粉酶活性低于0.01内淀粉酶单位(EAU)/单位外淀粉酶活性。
8．根据段落1-4的方法，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的特征在于，在4ml每ml含50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸和2mM氯化钙的pH6.0缓冲液具有10mg/ml预煮沸的蜡质玉米淀粉的水溶液中，将0.7单位量的所述非生成麦芽糖外淀粉酶于50℃温育15分钟时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的包含葡萄糖、麦芽糖和3-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖的水解产物、由4-8个D-吡喃葡糖基单位构成的线性麦芽寡糖；采用配有脉冲电流检测的Dionex PA 100柱和已知的从葡萄糖至麦芽七糖的线性麦芽寡糖作为标准品，通过阴离子交换HPLC分析所述水解产物。
9．根据段落8的方法，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的的特征在于，当在段落8中所述的条件下温育，并且如段落8所述分析水解产物时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的麦芽四糖。
10．根据段落8的方法，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的的特征在于，当在段落8中所述的条件下温育，并且如段落8所述分析水解产物时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的麦芽五糖。
11．根据段落8的方法，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的的特征在于，当在段落8中所述的条件下温育，并且如段落8所述分析水解产物时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的麦芽六糖。
12．根据段落8的方法，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的的特征在于，当在段落8中所述的条件下温育，并且如段落8所述分析水解产物时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的麦芽七糖。
13．根据段落8的方法，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的的特征在于，当在段落8中所述的条件下温育，并且如段落8所述分析水解产物时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的麦芽八糖。
14．根据段落1-4的方法，其中向所述面团组分、面团添加剂或所述面团加入至少一种乳化剂。
15．根据段落14的方法，其中所述乳化剂选自卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乙酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乳酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的柠檬酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、食用脂肪酸蔗糖酯、硬脂酰-2-乳酸钠和硬脂酰-2-乳酸钙。
16．根据段落1-4中任一段落的方法，其中向所述面团组分、面团添加剂或所述面团中加入至少一种另一种酶。
17．根据段落16的方法，其中所述另一种酶选自纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、氧化还原酶和蛋白酶。
18．用于面团和由所述面团制成的焙烤面粉面包制品的增酵剂组合物，包含一种非生成麦芽糖外淀粉酶和至少一种另一种面团组分或面团添加剂，所述非生成麦芽糖外淀粉酶能够在焙烤过程中从支链淀粉侧链的非还原末端切下主要由4-8个D-吡喃葡糖基单位组成的线性麦芽寡糖而水解淀粉。
19．根据段落18的增酵剂组合物，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的内淀粉酶活性低于0.5内淀粉酶单位(EAU)/单位外淀粉酶活性。
20．根据段落18的增酵剂组合物，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的内淀粉酶活性低于0.05内淀粉酶单位(EAU)/单位外淀粉酶活性。
21．根据段落18的增酵剂组合物，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶的内淀粉酶活性低于0.01内淀粉酶单位(EAU)/单位外淀粉酶活性。
22．根据段落18的增酵剂组合物，其特征在于，在4ml每ml含50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸和2mM氯化钙的pH6.0缓冲液具有10mg/ml预煮沸的蜡质玉米淀粉的水溶液中，将0.7单位量的所述非生成麦芽糖外淀粉酶于50℃温育15分钟时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的包含葡萄糖、麦芽糖和3-10个D-吡喃葡糖基单位的线性麦芽寡糖的水解产物、由4-8个D-吡喃葡糖基单位构成的线性麦芽寡糖；采用配有脉冲电流检测的Dionex PA 100柱和已知的从葡萄糖至麦芽七糖的线性麦芽寡糖作为标准品，通过阴离子交换HPLC分析所述水解产物。
23．根据段落18的增酵剂组合物，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶当在段落8中所述的条件下温育并且如段落8所述分析水解产物时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的麦芽四糖。
24．根据段落18的增酵剂组合物，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶当在段落8中所述的条件下温育并且如段落8所述分析水解产物时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的麦芽五糖。
25．根据段落18的增酵剂组合物，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶当在段落8中所述的条件下温育并且如段落8所述分析水解产物时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的麦芽六糖。
26．根据段落22的增酵剂组合物，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶当在段落8中所述的条件下温育并且如段落8所述分析水解产物时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的麦芽七糖。
27．根据段落22的增酵剂组合物，其中所述非生成麦芽糖外淀粉酶当在段落8中所述的条件下温育并且如段落8所述分析水解产物时，产生至少60％(重量)、优选至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)、最优选至少90％(重量)的麦芽八糖。
28．根据段落19-27中任一段落的增酵剂组合物，其包含至少一种选自乳化剂和水解胶体的添加剂。
29．根据段落28的增酵剂组合物，其中所述乳化剂选自卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乙酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的乳酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的柠檬酸酯、食用脂肪酸甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、食用脂肪酸蔗糖酯、硬脂酰-2-乳酸钠和硬脂酰-2-乳酸钙。
30．根据段落28的增酵剂组合物，其中所述水解胶体选自藻酸盐、角叉藻聚糖、果胶和植物胶。
31．根据段落19-30中任一段落的增酵剂组合物，其包含至少一种选自纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、氧化还原酶和蛋白酶的另一种酶。
32．可用根据段落1-17中任一段落的方法获得的焙烤面粉面包制品。
以上说明书中提及的所有出版物均通过引用结合到本文中。在不偏离本发明的范围和精神的情况下，对本发明的所述方法和系统的各种改进和变化对于本领域技术人员是显而易见的。尽管本发明已经结合具体优选实施方案进行了描述，但应该理解，要求保护的本发明不应过度限于这类具体的实施方案。实际上，对于生化领域或相关领域的技术人员显而易见的对所述实践本发明的模式的各种改进，将属于以下权利要求书的范围。
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机译： 非产麦芽糖外淀粉酶及其在延迟淀粉降解中的用途
机译： 非产麦芽糖外淀粉酶及其在延迟淀粉回生降解中的用途
机译： 非产麦芽糖外淀粉酶及其用于延迟淀粉回生的用途
