抗CA125双功能基因工程抗体的克隆与表达

摘要

本发明涉及一种抗CA125双功能基因工程抗体的克隆与表达,属于一种新型导向抗癌药物。提供了一种抗CA125双功能基因工程抗体的分子导向药物的核苷酸序列。该序列是将抗CA125免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区基因片段构建成单链抗体,再将单链抗体基因与人源Tuftsin基因直接融合,该基因所表达双功能基因工程抗体由259个氨基酸组成。该抗体具有与CA125抗原特异性结合并通过调节免疫机制抑杀癌细胞的双重功能,它能广泛用于与CA125相关的肿瘤的治疗。本发明还提供了有上述核苷酸序列的重组表达载体,以及含有这种载体的毕奇酵母菌pichia pastoris。

说明书

本发明涉及一种抗CA125双功能基因工程抗体的克隆与表达，是一种新型导向免疫抗癌药物。它属于生物工程在医药领域中的应用。

生物技术是生命科学的技术前沿之一，当今世界各国都把生物工程制药视为一种高科技和下个世纪的朝阳产业，在科学技术创新中占有重要的地位。最近十年，生物技术在医药领域的应用，为制药工业带来一场新的革命，特别是在开发新型抗癌药物方面，利用生物工程技术所研制的免疫和靶向药物，正在成为癌症治疗的主要发展方向，并将逐步取代毒副作用较大传统化疗药物。

癌症的导向治疗是在杂交瘤技术的基础上发展起来的，利用细胞工程生产单克隆抗体做为导向药物的载体应用于临床已取得了一定的进展，但并没有达到人们所预期的理想效果。由于目前所制备的单抗多是鼠源性的，反复使用会产生抗鼠抗体(HAMA)，而作为载体所交联的药物或毒素主要是以化学链连接，常常会由于体内环境的变化而使药物或毒素丢失而无法到达靶部位并对机体产生副作用，而且由于分子量过大而导致穿透力差，这些缺点使单抗作为导向药物载体在临床应用上受到了一定限制，而人源化抗体存在建株难的问题，同时，由于细胞工程工艺过程十分复杂，生产成本较高。上述问题在一定程度上也限制了单抗药物在临床上的应用和发展。为了克服单克隆抗体的上述缺点，目前世界上发达国家许多实验室正在进行将抗体改造或修饰的研究，以期得到小型高效低毒的导向抗癌药物，目前该领域以已为抗癌药物研究的前沿核心。

本发明的目的是利用基因工程技术研制开发一种新型导向抗癌药物，通过运用分子生物学、免疫化学、生物化学及生物发酵等技术手段，在分子水平构建一种可分泌型表达具有抗癌活性的目的蛋白的基因工程菌。该工程菌通过表达产生一种融合蛋白，该蛋白具有特异性识别癌细胞表面抗原CA125和通过调节机体免疫系统杀伤癌细胞的双重活性。研究的途径为：通过杂交瘤技术制备抗CA125抗原的单克隆抗体，从该抗体中克隆出可变区基因，序列验证无误后，用一个15个氨基酸的肽将可变区基因连接起来，构建成单链抗体(ScFv)，再将单链抗体(ScFv)基因与内源性免疫肽Tuftsin基因结合，整合到质粒载体中，转入酵母表达系统Pichia pastoris中，构建可分泌表达融合蛋白质的工程菌，并对其进行特性鉴定，同时对表达产物进行分离纯化和活性检测。

1.用杂交瘤方法制备抗CA125抗原的单克隆抗体。

2.用PCR方法克隆抗体轻链可变区和重链可变区基因。

3.对已克隆的抗体可变区基因进行测序分析。

4.构建单链抗体(ScFv)。

5.双功能ScFv-tuftsin分子的设计：

选择表达载体；克隆ScFv基因；克隆tuftsin基因。

6.表达载体的构建

7.重组表达质粒在酵母表达系统Pichia pastoris中的转化及选择。

8.重组融合蛋白质的表达及活性检测。

本发明的附图有：

图1a，b抗CA125双功能基因工程抗体构建的工艺流程及操作方案

图2质粒载体的结构及特性

图3质粒载体的构建过程

图4酵母菌在不同培养基中表达BACF(ScFv-Tuftsin)融合蛋白的电泳结果

图5利用免疫方法杂交蛋白质显色

图6重链可变区核苷酸及其推导的氨基酸序列

图7轻链可变区核苷酸及其推导的氨基酸序列

图8单链抗体(ScFv)结构

图9a，b基因重组双功能抗癌因子(ScFv-tuftsin)的全部核苷酸及其推导的氨基酸序列

图10基因重组双功能抗癌因子(ScFv-tuftsin)的氨基酸组成

本发明是这样实现的：

我们开始在分子水平上进行药物的设计，该药物由两个功能部分构成，一部分是导向识别部分，另一部分是效应因子部分。对于导向识别部分，我们选择的是针对CA125抗原的抗体，从该抗体上克隆出可变区的V_H和V_L基因，将二者用一个短肽(Linker)连结成V_L-Linker-V_H基因，即重组单链抗体(SinleChain F_V，ScFv)基因。在抗癌功能的设计上，通过比较实验和查阅有关文献报道，我们选择了一种人源性天然四肽：促吞噬肽(Tuftsin)。Tuftsin是一种高效的免疫调节剂，它可以激活体内的巨噬细胞并增强其吞噬作用，进而通过调节免疫系统杀灭癌细胞，且无毒副作用。经过40多次的反复实验，我们成功地克隆出Tuftsin基因，并将单链抗体基因(ScFv)与Tuftsin基因连接起来，用基因重组技术克隆出来，连入质粒载体，转入到酵母表达系统中，其表达产物是一个融合蛋白。

本发明抗CA125双功能基因抗体将结合附图详细阐述如下：

图1表示抗CA125双功能基因工程抗体构建的工艺流程及操作方案

用卵巢癌细胞表面抗原CA125对小鼠体进行免疫，在体外同骨髓瘤细胞融合制备出抗CA125的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞中提取mRNA，反转录成cDNA，用PCR引物V_HIFOR，V_HIBACK，V_LIFOR，V_LIBACK，应用PCR扩增技术得到完整的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)基因片断。通过15个氨基酸的短肽将V_H和V_L连接构成V_L-Linker-V_H(ScFv)基因，通过质粒整合到大肠杆菌中，所表达的单链抗体含有亲本抗体的识别癌细胞表面抗原的功能。应用基因工程手段克隆ScFv和Tuftsin基因，将ScFv和Tuftsin基因连接，构建为一个重组的ScFv-Tuftsin DNA片断。将这个片断整合到表达质粒pPIC-9中，该质粒含有AOX1强启动子，可使目的基因高效表达。将该质粒转化入酵母Pichia pastoris细胞中，成为分泌型酵母表达系统。经生物发酵，并在诱导剂甲醇的存在下，基因工程菌表达产生所需蛋白质，即ScFv-Tuftsin。该蛋白质分泌到酵母培养基中，经分离纯化后得到的产物即为“基因重组双功能抗癌因子”(Recombinant Bi-functional Anticancer Factor，BACF)。

图2表示质粒载体的结构及特性

将ScFv-Tuftsin重组基因转化入Pichia pastoris所利用质粒载体是pPIC-9，该质粒具有如下特征：带有Amp和HIS4选择标记；8023bp；具有高分泌α-因子分泌诱导信号；被克隆的基因受控于AOX1启动因子；带有多克隆位点(polylinker site)。

图3表示质粒载体的构建过程

重组质粒pPIC-ScFv-Tuftsin是这样构建的：抗CA125的抗体可变区DNA序列使用特定的PCR引物扩增后，插入Pichia pastoris分泌型表达系统中的载体pPIC-9质粒中，称为pPIC-ScFv，然后将Tuftsin氨基酸顺序，N-SerGlyGlyThrLysProArg-c，编码的DNA碱基序列通过内切酶(EcoRI和EagI)酶切以后直接插入pPIC-ScFv质粒中，该质粒被称为pPIC-ScFv-Tuftsin。它含有双功能引导基因(N-端带有分泌因子信号)受控制于AOX1启动子。此质粒带有的Amp和HIS4基因，用于在大肠杆菌及酵母菌中选择。

表达系统的选择

目前用于重组DNA的表达系统都有其局限性及长处，可以通过评价目的蛋白的表达水平来确定最佳的蛋白质表达系统及生产条件。为了快速表达并有利于目的蛋白质的分离纯化，我们根据实验结果，选用了酵母菌Pichia pastoris高效分泌型表达系统，该系统已成功用于表达许多难以在大肠杆菌表达的真核基因。首先，将在体外构建的质粒中转化到Pichia pastoris细胞株GS115中，通过组氨酸缺乏的培养基平板选择阳性克隆结果，通常5微克的DNA可得到大约200个阳性转化菌落，这些阳性菌落需要在含有葡萄糖的培养基平板上进行选择，在含有甲醇的培养基平板上不生长的菌点为最终阳性菌，通常第二种选择阳性结果为5％左右。

图4表示酵母菌在不同培养基中表达BACF(ScFv-Tuftsin)融合蛋白的电泳结果。

图中所示的1.ScFv于BMGY培养液中；2.ScFv-tuftsin在BYGY培养液中；3.ScFv-tuftsin于Buffer 3培养液中；4.ScFv-tuftsin浓缩10倍于Buffer 3培养液中；M是分子量标准。

分离以后的最终阳性菌落在BMGY培养基中接种，在30℃摇动培养两天，振动频率为300转/分钟。两天后，检查OD₆₀₀，当吸光值在10-20之间时，离心收集菌体转入200毫升甲醇诱导液BMMY或者Buffer3中，30℃摇动培养二至五天。所需要的蛋白质分泌在此培养诱导液中，我们采用常规的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白质的纯度、分子量和表达量。通常BACF(ScFv-Tuftsin)的表达量至少为100-150毫克/升，此蛋白质的分子量大小为33-35kDa。

图5表示利用免疫方法杂交蛋白质显色

1到5为BACF在不同的选择分泌培养液中的电泳结果，其中1为BMGY，3为Buffer 3，6为负对照。

BACF(ScFv-Tuftsin)融合蛋白的表达及纯化

生物技术的一个主要优势就是能迅速地为重组蛋白的制备提供较简化的方案，这样，最好的方法是简化培养组成成份，例如，我们所提到的Buffer3。蛋白质的纯化主要是应用传统的离子交换柱法分离纯化，它的主要优势在于简捷、快速，能大体积制备，而且该方法可以排除培养液中有可能出现的清蛋白、传递蛋白、蛋白酶等非亲和性蛋白。

目前所报道的重组蛋白在Pichia中表达均能保持其生物活性。用竞争性体外免疫学方法(RIA)，我们可以检测BACF(ScFv-tuftsin)的结合活性。方法如下：将800单位的CA125涂在固相上(200微升，浓度为4000单位/毫升的CA125)，加入5微克I¹²⁵标记的抗CA125的单抗(100毫升，浓度为50微克/毫升的抗体)与BACF(ScFv-tuftsin)样品进行竞争反应。在此竞争反应后所得到的差值显示出BACF(ScFv-tuftsin)特有的生物结合活性。

图6表示重链可变区核苷酸及其推导的氨基酸序列

图7表示轻链可变区核苷酸及其推导的氨基酸序列

图8表示单链抗体(ScFv)结构

图9a，b表示基因重组双功能抗癌因子(SeFv-tuftsin)的全部核苷酸及其推导的氨基酸序列

图10表示基因重组双功能抗癌因子(ScFv-tuftsin)的氨基酸组成

本发明抗CA125双功能基因工程抗体的克隆与表达其特征在于工程菌的构建和完整的氨基酸序列：

1.该序列是将抗CA125免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区基因片段构建成单链抗体，再将单链抗体基因与人源Tuftsin基因直接融合，该基因所表达双功能基因工程抗体由259个氨基酸组成；该抗体具有与CA125抗原特异性结合并通过调节免疫机制抑杀癌细胞的双重功能，它能广泛用于与CA125相关的肿瘤的导向治疗；本发明还提供了有上述核苷酸序列的重组表达载体，以及含有这种载体的毕奇酵母菌Pichia pastoris。

2.菌株及质粒：菌株：Pichia pastoris Gs115(His4- Mut+)。质粒：pPIC-9，该质粒带有Amp和HIS4选择标记；8023bp；具有高分泌α-因子分泌诱导信号；目的基因受控于所含的AOX1启动因子；带有多克隆位点(polylinker site)。空白菌株及质粒购自美国Invitrogene公司。启动子：AOX1，甲醇诱导型。

3.抗CA125杂交瘤的获取：采用传统的细胞融合技术。CA125通过人卵巢癌细胞Ovcar-3分泌经分离纯化而成。用CA125对小鼠进行免疫，将免疫后脾细胞分离，融合于杂交瘤SP2/O，通过ELISA方法选取具有高亲和力抗体的杂交瘤细胞株，进行培养至对数生长期，所分泌的抗CA125单克隆抗体为IgGIK型。

4.杂交瘤细胞总RNA的提取与纯化和cDNA合成：采用盐酸胍-酚-氯方法(Guanidium thiocyanate-phenol-chloroform)提取总RNA，由得到的mRNA经反转录即为cDNA。

5.用PCR方法克隆抗体可变区基因：抗体可变区含重、轻两条链，因此可变区基因有两个，即V_H和V_L基因，提取VH基因的PCR引物为V_HIFOR和V_HIBACK

V_HIFOR：5’-TGA GGA GAC GGT GAC CGT CCC TTG GCC CCA G-3’

V_HIBACK：5’-CAG GTC/G A/CAA/G CTG CAG C/GAG TCA/T GG-3’

提取V_L基因的PCR引物为V_LIFOR和V_LIBACK

V_LIFOR：5’-GTT TGA TCT CCA GCT TGG TCC C-3’

V_LIBACK：5’-GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA-3’

在这些PCR引物的序列中，V_LIFOR含BglII切点，V_LIBACK含有PvuII切点。应用Touchtown程序进行40个周期的PCR反应，反应后取反应液上样于1％的DNA琼脂糖凝胶，从琼脂糖凝胶电泳中提取出PCR产物，得到的PCR-DNA含350bp。

6.克隆PCR产物：由于PCR产物得到的DNA片断为平末端，因此可直接克隆到质粒载体(pBluescript II Ks)的EcoRV切点位置上，此载体为1961bp，含有位于715bp的EcoRV切点和2个分别位于529bp和977bp Pvu II切点。克隆的步骤为：

a.连接：质粒和插入片断比例为1∶3，用T4-DNA连接酶进行连接反应。

b.转化：大肠杆菌DH5α用0.1M的CaCl₂处理为感受态细胞，20ul连接液加入100ul DH5α细胞，处理后在37℃条件下培养过夜。

c.选择：采用限制性内切酶法，选择阳性克隆。

7.可变区基因序列分析

a.提取质粒DNA：V_H和V_LDNA片断插入载体后称为pBKS-V_H和pBKS-V_L，我们采用的是Qiagen公司的质粒提取方法。

b.测序方法：主要采用《United States Biochemical》所提供的实验方案，所用的引物为T₃和T₇(Stratagene)，将测得的DNA序列用Genework软件处理，同已知的Data Base Gene Bank做对比得到准确的V_H和V_L序列，V_H的序列见图7，V_L的序列见图8。

7.单链抗体ScFv的构建

将V_H和V_L组合成单链分子，应考虑V_H和V_L的方向，我们的研究结果表明V_L-Linker-V_H比较稳定且容易表达，同时要考虑Linker的长短及顺序，我们采用15个氨基酸(SerGlyGly)5序列。ScFv的构建步骤如下：采用两步PCR方式将V_H和V_L组合成ScFv，并在5’端带有EcoRV切点，在3’端带有EcoRI切点。PCRI和PCRII所用条件一致为30周期，每周期为94℃ 1min；50-55℃，min；72℃，1min。经过PCRI以后从胶上提取PCR片断，将两个PCRI的片断1∶1混和后，做为PCRII的模板。PCRII则用V_L-EcoRV和V_H-EcoRI进行PCR扩增，组成的单链ScFv基因为752bp，两端含有EcoRV和EcoRI的酶切位点。测序后得到完整准确的V_L-Linker-V_H核苷酸序列(见图8)。

8.双功能ScFv-tuftsin的实验设计及表达载体的构建

将双功能抗体(ScFv-tuftsin)基因克隆在酵母菌分泌型表达载体中的过程，分为两个步骤，首先将ScFv基因克隆到pPIC-9质粒中(Invitrogene)，  所需的酶切位点为SnaBI/EcoRV和EcoRI，然后再将tuftsin基因克隆在pPIC-9-ScFv的COOH端，所需的酶切位点为EcoRI和EagI，同时，我们考虑到在ScFv和tuftsin基因之间需要有一定空间序列(spacer)使ScFv和tuftsin各自功能互不影响对方。

a.表达载体的选择

我们选择的是购自Invitrogene公司的表达载体，质粒pPIC-9，其图谱及特征见图2。

b.克隆ScFv基因：

将已构建好的含有752bp的ScFv DNA片段用EcoRV和EcoRI同时酶解后，克隆到粒pPIC-9的SnaBI和EcoRI位点，转入大肠杆菌DH5α，用氨苄青霉素进行选择，得到的阳性克隆为pPIC-9-ScFv。

c.克隆Tuftsin基因：

在设计tuftsin基因时，需要在tuftsin基因5’和3’端安装EcoRI和EagI酶切位点。同时还要构建负对照分子。合成tuftsin基因的寡核苷酸(Oligo)引物设计如下：

人(H-tuftsin)：5’-AAT TCT GGA GGT GGT ACC AAG CCT AGG TAG

 GA CCT CCA CCA TGG TTC GGA TCC ATC GCC GG-5’

鼠(m-tuftsin)：5’-AAT TCT GGA GGT GGT ACC CAG CCT AGG TAG C

 GA CCT CCA CCA TGG GTC GGA TCC ATC GCC GG-5’

负对照(G4C)：5’-AAT TCA GCT GGA GGT GGT GGA TGT GC

GT CGA CCT CCA CCA CCT ACA CGC CGG-5’

其中H-tuftsin序列中含有KpnI位点，M-tuftsin序列中含有KpnI位点，G4C序列中含有PvuII位点。

将三组oligo标记好后，分别进行5’端磷酸化反应(Phosphorylation)。反应停止后，用乙醇沉淀oligo DNA。

c.表达载体的构建：

1pmol的载体DNA(pPIC-ScFv)用EcoRI和EagI同时进行消化，分别与三组1pmol的Oligo DNA进行连接反应。连接反应后，将含有所需ScFv-tuftsin的pPIC9质粒转化到大肠杆菌E.coli DH5α，所形成的质粒分别命名为：

pDL-6(pPIC9-ScFv-m-tuftsin)

pDL-10(pPIC9-ScFv-G4c)

pDL-11(pPIC9-ScFv-H-tuftsin)分别提取三种质粒DNA，并做内切酶检测结果如下：

                  酶      切点    片断

pDL-6             kpnI    4       612bp，635bp，970bp，6633bp

pDL-10            PvaII   3       245bp，2900bp，5700bp

pDL-11            KpnI    4       612bp，635bp，970bp，6633bp

同时，用5’-AOX1和3’-AOX1为引物进行序列分析，进一步证明DNA序列无误，测序引物为：

5’-AOX1：5’-GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC-3’

3’-AOX1：5’-GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3’

测序结果见图9。根据测序的结果分析，该序列由259个氨基酸组成，BACF(ScFv-tuftsin)的氨基酸组成详见图10。

10.表达质粒pPIC-ScFv-H-tuftsin在酵母菌Pichia pastoris中的转化与选择酵母菌株Pichia pastoris为GS115(His4- Mut+)。用电转化的方法将重组质粒pPIC-ScFv-H-tuftsin转化入酵母菌株GS115细胞中。

a.线性化质粒的制备：用BglII消化重组粒后，乙醇沉淀，即可得到线性化质粒。

b.电转化：将GS115在500mlYPD培养基中培养至OD₆₀₀约为1.3-1.5，离心收集菌体，处理后的细胞溶于1ml Sorbitol液中，加入5ul用BglII消化的质粒DNA(5ug)，放入0.2um的电转化管中，进行电转化(1800V pulse)，然后加入1ml的Sorbitol，混匀细胞，取200ul涂RDB平板，30℃培养两天。

c.转化子的选择：将在RDB平板上生成的菌落分别接种于MM和MD培养基平板上，于30℃培养两天。通常，我们接种100个菌落左右，一般能得到点5-25个His+ Mut-菌落。将这些His+ Mut-型的菌在YPD培养液中培养过夜(30℃，200rpm)，然后分别保存菌种。

11.ScFv-tuftsin融合蛋白质表达及活性分析

筛选以后的菌种在MGY培养液中接种，在30℃培养48小时，检查OD600，应在10-20之间。然后离心收集菌体，将菌体用200ml甲醇诱导液BMMY或Buffer3中30℃培养2-5天，启动子AOX1在甲醇诱导下启动目的基因，将所需的目的蛋白分泌在诱导培养液中。经SDS-PAGE电泳分析，在分子量35KD左右有一条区带(图4，5)，表达量达100-150mg/L。纯化后进行生物活性测定，用体外免疫竞争法(RIA)检测ScFv-tuftsin与抗原的结合活性，结果表明，ScFv-tuftsin具有与亲本抗体相同的特异性和亲合力。

与目前世界上应用较多的单抗类导向治疗药物相比，本产品具有分子量小，稳定性强，不易产生抗鼠抗体，与抗原亲和性强，效应因子与载体结合牢固等显著优点。另外，在制备工艺上本产品是基因工程产品，而单抗类产品是细胞工程产品，工艺过程比单抗类产品大为简化。与目前世界上一些实验室正在研究的同类产品比较，本产品的优点表现在：

(1)本产品是在酵母菌Pichia pastoris中分泌型高效表达，表达量和纯度都较高，目的蛋白直接分泌到培养基中并自动折叠成天然构象，无须复性，同时降低了成本。而其它同类产品多是在E.coli中表达，所得到的融合蛋白往往是以包涵体的形式存在，须经复性后才有生物活性。

(2)本产品单链抗体所连接的是内源性免疫调节剂tuftsin，即使由于体内环境作用与单链抗体断开，也不会对机体造成任何毒副作用。而其它同类产品所连接的多是细胞毒素，一旦与单链抗体断开，易产生毒副作用，在使用上对剂量的要求极为严格。