L－抗坏血酸和D－异抗血坏酸的制备

摘要

由2－酮－L－古洛糖酸生产L－抗坏血酸(维生素C)或由2－酮－D－葡糖酸生产D－异抗坏血酸的方法,包括在溶液中使2－酮－L－古洛糖酸或2－酮－D－葡糖酸分别接触内酯酶(尤其是根据酶命名法的分类属于酶类EC3.1.1.x)。用于这一反应的溶剂可以是水、含水醇、非醇有机溶剂或者含水醇和非醇有机溶剂的混合物。酶促反应通常在0～120℃的温度范围和1.5～12的pH范围进行。两种情况中原料可以是游离酸、钠盐或钙盐的形式。如此生成的维生素C有很熟悉的用途,生产的D－异抗坏血酸可作为食品添加剂中的抗氧化剂使用。

说明书

本发明涉及使用内酯酶由2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸分别生产L-抗坏血酸(维生素C)或D-异抗坏血酸的新方法。

目前使用众所周知的Reichstein法[Helv.Chim.Acta 17，311-328(1934)]由2-酮-L-古洛糖酸生产L-抗坏血酸。这种方法已经在商业上使用了60多年，采用了许多化学和技术改进以提高每一步的效率：D-葡萄糖→D-山梨糖醇→L-山梨糖→二丙酮-L-山梨糖→二丙酮-2-酮-L-古洛糖酸→2-酮-L-古洛糖酸→2-酮-L-古洛糖酸甲酯→L-抗坏血酸。在这种方法中，由D-山梨糖醇到L-山梨糖的转变是唯一的微生物步骤，其它都是化学步骤。由二丙酮-2-酮-L-古洛糖酸到L-抗坏血酸的转变可由两种不同的操作实现：1)去保护得到2-酮-L-古洛糖酸，接着进行甲醇酯化和碱催化环化；和2)直接由受保护或去保护的2-酮-L-古洛糖酸酸催化环化成L-抗坏血酸。碱催化反应的起始物是2-酮-L-古洛糖酸甲酯，它本身由酸用酸性甲醇处理制备而成。或者将其甲酯与碳酸氢钠或醋酸钠反应，提供L-抗坏血酸钠。许多化学和技术改进提高了每一步的效率，使多步合成法成为主要使用和经济的方法。

D-异抗坏血酸由D-葡萄糖经2-酮-D-葡糖酸(它自身可由属于假单孢菌属的一种菌株发酵生产)和2-酮-D-葡糖酸甲酯生产。D-异抗坏血酸主要在食品添加剂中作为抗氧化剂使用。

已经投入了很多时间和努力去寻找L-抗坏血酸的其它微生物合成方法。大多数L-抗坏血酸的微生物生产聚焦在由L-山梨糖[G.Z.Yin等人，Wei Sheng Wu Hsueh Pao.20，246-251(1980)；A.Fujiwara等人.，EP213,591(Roche)；T.Hoshino等人，USP4,960,695(Roche)；和I.H.Nogami等人，EP221,707]，由D-山梨糖醇[A.Fujiwara等人，EP213,591(Roche)；T.Hoshino等人，USP5,312,741(Roche)；M.Niwa等人，WO95/23220；和S.F.Stoddard等人，WO98/17819]，或由D-葡萄糖采用单一、混合或重组培养物经2，5-二酮葡糖酸[T.Sonoyama等人，应用环境微生物学43，1064-1069(1982)；和S.Anderson等人，Science 230，144-149(1985)]生产L-抗坏血酸生产中的中间产物2-酮-L-古洛糖酸上。然后2-酮-L-古洛糖酸可以用上述化学方法转变成L-抗坏血酸。

最近报道了用酶法将2-酮-L-古洛糖酸酯转变成L-抗坏血酸的内容[J.C.Hubbs，WO97/43433，Eastman化学公司]。WO97/43433描述了制备L-抗坏血酸的方法，包括将2-酮-L-古洛糖酸或其酯与选自蛋白酶、酯酶、脂肪酶和酰胺酶的水解酶催化剂接触。通过使用水解酶，如蛋白酶、酯酶、脂肪酶或酰胺酶，WO97/43433例证了由2-酮-L-古洛糖酸的酯(2-酮-L-古洛糖酸丁酯)形成L-抗坏血酸，但是没有由2-酮-L-古洛糖酸自身明显形成L-抗坏血酸。WO97/43433公开了，如Candidaantartica B脂肪酶在8.6％甲醇存在时于pH3.1～3.2和38℃(实施例15)催化该反应，由1％2-酮-L-古洛糖酸形成413～530mg/l 2-酮-L-古洛糖酸甲酯，但是没有形成L-抗坏血酸。Candida antartica B脂肪酶在酸性pH下对2-酮-L-古洛糖酸(一种α-酮-羧酸)的酯合成活性是明显阳性的，但是这种脂肪酶引起的分子内酯的形成可以忽略。它没有公开用内酯酶作水解酶催化剂，由2-酮-L-古洛糖酸生产L-抗坏血酸。

惊讶地发现，由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗坏血酸的转变可以由内酯酶进行。相应地，惊讶地发现内酯酶对环酯的选择性有利于由2-酮-L-古洛糖酸生产L-抗坏血酸。

已经知道很多种内酯酶，包括大肠杆菌[F.Hucho等人，生物化学及生物物理学学报276，176-179(1972)]或运动发酵单孢菌[M.Zachariou等人，细菌学杂志167，863-869(1986)和V.Kanagasundaram等人，生物化学及生物物理学学报1171，198-200(1992)]的葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.17)，和尖镰孢[S.Shimizu等人，欧洲生物化学杂志209，383-390(1992)]的内酯水解酶。另外报道的内酯酶包括嗜糖假单孢菌的L-阿拉伯糖酸内酯酶(EC3.1.1.15)和D-阿拉伯糖酸内酯酶(EC3.1.1.30)、出芽茁霉(Pullularea pullulans)的L-鼠李糖酸-1，4-内酯酶(EC3.1.1.65)、莓实假单孢菌和氧化葡糖杆菌的木糖酸-1，4-内酯酶(EC3.1.1.68)、Trichoderma reesei的纤维二糖酸内酯酶[Chem.-Ztg.113，122-124(1989)]、1，4-内酯酶(EC3.1.1.25)和EC编号为3.1.1.19、3.1.1.24、3.1.1.27、3.1.1.36、3.1.1.37、3.1.1.38、3.1.1.39、3.1.1.45、3.1.1.46和3.1.1.57的内酯酶。

在这些内酯酶中，已开发了尖镰孢的内酯水解酶用于工业上D-泛酰内酯的不对称水解(K.Sakamoto等人，USP5,275,949)。该酶催化比较广泛的内酯化合物水解，包括D-泛酰内酯和几种醛糖酸内酯，如D-葡糖酸-δ-内酯和D-半乳糖酸-γ-内酯的水解，和逆反应，即内酯化。

可以得到一些内酯酶基因的核苷酸序列，如运动发酵单孢菌的葡糖酸内酯酶基因[960bp；320个氨基酸残基；V.Kanagasundaram等人，生物化学及生物物理学学报1171，198-200(1992)]和尖镰孢的内酯水解酶基因[1,140bp；380个氨基酸残基；K.Sakamoto等人，WO97/10341]。

本发明提供了使用内酯酶由2-酮-L-古洛糖酸生产L-抗坏血酸的方法，和由2-酮D-葡糖酸生产D-异抗坏血酸的方法。

相应地，本发明致力于由2-酮-L-古洛糖酸生产L-抗坏血酸或由2-酮-D-葡糖酸生产D-异抗坏血酸的方法，该方法包括在溶液中将内酯酶分别接触2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸。

本发明方法中使用的内酯酶可以由合适的生物体得到，包括动物、植物和微生物，如真菌、酵母和细菌。任何微生物可以是它们的功能替代物、亚培养物、突变体或变种。

适合用于本发明方法的内酯酶(如内酯水解酶)是根据酶命名法(1992，学术出版社)的分类属于酶类EC3.1.1.x的那些酶。在名称“EC3.1.1.x”中，x表示任何位于“EC3.1.1.”之后的数，特征在于是内酯酶，如内酯水解酶，属于有关类的酶；这些数x的例子是由上文给出的内酯酶例子的酶类名称中的那些。内酯酶催化可逆反应，具体地说是水解内酯(由羧基和羟基之间的分子内反应形成的环酯)和重新形成内酯。优选的内酯酶是葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.17)，尤其是大肠杆菌和运动发酵单孢菌的那些。尖镰孢的内酯水解酶是进一步优选的内酯酶。更特别优选的内酯酶是大肠杆菌IFO14410或运动发酵单孢菌IFO13756的葡糖酸内酯酶和尖镰孢IFO5942的内酯水解酶。

如下文实施例所述制备的葡糖酸内酯酶或内酯水解酶在纯化后或部分纯化后的物理-化学性质如下：1)酶活性

本发明方法中使用的内酯酶催化醛糖酸的内酯化，并且有能力在没有其它辅助因子的情况下生产醛糖酸内酯。在50～70℃测定由2-酮-L-古洛糖酸形成L-抗坏血酸的量，进行L-抗坏血酸形成的酶实验。对于酶的纯化，在室温(约20～25℃)下，使用对硝基酚作为pH指示剂，测定作用于D-半乳糖酸-γ-内酯底物形成D-半乳糖酸的底物内酯酶活性作为酶活性。产生的D-半乳糖酸造成的酸化由对硝基酚在405nm吸收值的降低检测。2)最佳pH

在0.2M 2-吗啉代乙烷磺酸钠(Na-MES)缓冲液(pH5.5～7.0)或0.2M醋酸钠缓冲液(pH3.75～5.5)中，使用2-酮-L-古洛糖酸钠单水化物作为底物，在30、37、45或55℃测定内酯酶的反应速率和pH的相关性。大肠杆菌的葡糖酸内酯酶、运动发酵单孢菌的葡糖酸内酯酶和尖镰孢的内酯水解酶的最佳pH分别为5.5、5.5和4.5～5.0。3)最佳温度

在30～70℃，0.2M Na-MES缓冲液(pH5.5)或0.2M醋酸钠缓冲液(pH5.0)的反应混合物中测定内酯酶的酶活性。大肠杆菌的葡糖酸内酯酶、运动发酵单孢菌的葡糖酸内酯酶和尖镰孢的内酯水解酶的最佳温度分别为70℃、50℃和55℃。4)分子量

在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上确定纯化后或部分纯化后的内酯酶的分子量。使用兔骨骼肌磷酸化酶B(97,400)、牛血清清蛋白(66,200)、牛卵清蛋白(45,000)、牛碳酸酐酶(31,000)、大豆胰蛋白酶抑制剂(21,500)和鸡卵清溶菌酶(14,400)作为分子量标准。结果证实运动发酵单孢菌葡糖酸内酯酶和尖镰孢内酯水解酶的亚基的分子量分别为约32kDa和约60kDa。

本发明方法也可以通过使用内酯酶的功能衍生物实现。这些功能衍生物由于在内酯酶(未修饰的)的正常序列中添加、插入、删除和/或取代一个或多个氨基酸残基而不同于内酯酶本身，但这些衍生物用本领域知道的或此处特别描述的实验测定仍然具有内酯酶活性。这些功能衍生物可以用本领域知道的肽化学合成法或蛋白质的化学修饰法，或者根据此处公开的DNA序列用本领域知道的和如Sambrook等人(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，USA，第二版1989)公开的重组方法制备。蛋白质和肽中通常不改变这些分子活性的氨基酸改变为本领域所知道且有描述，如H.Neurath和R.L.Hill的“蛋白质”(学术出版社，纽约，1979；具体参阅图6，第14页)。最经常发生的改变有：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly，以及反向改变。

本发明方法中使用的内酯酶可以由以下方法得到：

含有想要的内酯酶的生物体可以从自然界、商业或从生长在合适培养基中的培养物中得到。内酯酶可以以完整生物体或者以纯化或部分纯化后的酶形式使用。

就通过在培养基中培养合适的微生物得到内酯酶而言，微生物可以在提供合适营养的液体培养基中在有氧条件下便利地培养。可以在约pH1.5～12进行培养。而培养时间随着pH、温度和使用的营养培养基变化，通常1～10天时间即可获得比较满意的结果。进行培养的优选温度范围为约0～120℃。

通常要求培养基含有诸如可同化的碳源、可消化的氮源和无机物、维生素、微量元素和其它生长促进因子之类营养物。可以使用甘油、D-葡萄糖、D-甘露醇、D-果糖、D-阿拉伯糖醇、L-山梨糖、D-山梨糖醇等等作为可同化的碳源。

许多有机物和无机物也可以被用作氮源，如酵母提取物、肉提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐等等。作为无机物，可以使用硫酸镁、磷酸钾、氯化亚铁和氯化铁、碳酸钙等等。

可以通过下列本领域众所周知的方法，在培养后由微生物分离和纯化内酯酶：

(1)由发酵肉汤离心或过滤收获细胞。

(2)通过常用的细胞裂解方法，如超声波法、匀浆法、French挤压处理、和用细胞溶解酶处理，由细胞制备粗制酶溶液。通过渗透休克方法或自身裂解方法的提取法可应用于粗制酶溶液的制备。

(3)通过常用的蛋白质纯化方法，如硫酸铵沉淀、透析、离子交换层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析、亲合层析和结晶，由粗制酶溶液分离和纯化内酯酶。

在内酯酶(如大肠杆菌和运动发酵单孢菌的葡糖酸内酯酶和尖镰孢的内酯水解酶)的酶纯化过程中，可以用醛糖酸内酯(如D-半乳糖酸-γ-内酯和D-葡糖酸-δ-内酯)作为底物测定酶活性。

实现本发明方法的反应混合物包括底物，即2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸，和作为催化剂的内酯酶，如上文提及的，内酯酶以完整生物体的形式、以纯化或部分纯化的形式、或以功能衍生物的形式存在。

2-酮-L-古洛糖酸和2-酮-D-葡糖酸优选的化学形式是游离酸、它的钠盐或它的钙盐。

本发明方法(酶反应)在温度0～120℃，优选20～100℃，最优选37～80℃便利地进行。

实现酶反应的合适pH为pH1.5～12，优选pH1.5～8，且最优选pH2.5～7。

底物2-酮-L-古洛糖酸或2-酮-D-葡糖酸在反应混合物中的浓度便利地为1～300g/l，优选10～200g/l，最优选50～150g/l。

反应可以在水或者由水和一种醇或几种醇混合物组成的含水溶剂(即含水醇)中便利地实现。或者，它可以在非醇的有机溶剂或有机溶剂和上述含水溶剂(含水醇)的混合物中实现。醇优选C_1～6醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇和叔丁醇。合适的有机溶剂包括脂肪族碳氢化合物(如庚烷和异辛烷)、脂环族碳氢化合物(如环己烷)和芳香族碳氢化合物(如苯和甲苯)。优选的溶剂是水或含水溶剂，尤其是水自身。从经济和环境角度看，在工业方法中尽可能少使用有机溶剂。

反应混合物可以进一步含有抗氧化剂，如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇或半胱氨酸，以防止生成的L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸降解。

作为内酯酶自身的替代物，反应混合物可以包括具有内酯酶活性的生物体。

对于该反应，可以使用内酯酶的任何形式，尤其是酶溶液、固定化酶、具有内酯酶活性的生物体的完整细胞和具有内酯酶活性的固定化细胞。

通过在用一个容器的一步转变法中或在用两个容器的两步转变法中结合使用具有内酯酶活性的生物体和具有L-山梨糖/L-山梨糖酮脱氢酶和D-山梨糖醇脱氢酶的生物体，例如氧化葡糖杆菌DSM4025，可以由L-山梨糖或D-山梨糖醇生产L-抗坏血酸[A.Fujiwara等人，EP213,591(Roche)；T.Hoshino等人，USP4,960,595(Roche)；T.Hoshino等人，USP5,312,741(Roche)]。

本发明由下列实施例举例说明：

实施例1(1)运动发酵单孢菌IFO13756的葡糖酸内酯酶的部分纯化

将运动发酵单孢菌IFO13756在6升含0.5％酵母提取物和2％葡萄糖的培养基(pH6.9)中于30℃静止培养22.5小时。离心收集细胞，并用含0.1M NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)清洗。

在酶纯化过程中，所有柱层析于4℃进行。使用对硝基苯酚作为pH指示剂，通过分光光度法实验测定D-半乳糖酸-γ-内酯的水解活性作为酶活性。实验混合物含100mM D-半乳糖酸-γ-内酯、50μg/ml对硝基酚、10mM 2-吗啉代乙烷磺酸钠(Na-MES)缓冲液(pH6.4)和酶。产生的D-半乳糖酸造成的酸化由在405nm吸收值的降低检测。

将细胞(湿重11.7g)悬浮于1,200ml含30％蔗糖的30mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，然后加入EDTA(pH8.0)至1mM。悬浮液在室温下搁置并搅拌30分钟。离心(8,000xg，20分钟，4℃)收集细胞，并重悬浮于12ml含30％蔗糖的30mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。将悬浮液倒入1,800ml冰冷的5mM MgSO₄·7H₂O中稀释，在冰上搁置并搅拌30分钟。将所得悬浮液离心(8,000xg，20分钟，4℃)得到上清液作为周质部分。

向周质部分中加入Na-MES缓冲液(pH6.4)和2-巯基乙醇分别至20mM和0.1mM，然后加入(NH₄)₂SO₄至1.25M。将所得周质部分上样到Butyl-Toyopearl 650 S柱(40ml：内径(ID)2.5×8.2cm，TOSOH公司，东京，日本)，该柱已用含0.1mM 2-巯基乙醇和1.25M(NH₄)₂SO₄的20mM Na-MES缓冲液(pH6.4)平衡过。用平衡缓冲液清洗柱子后，用线性梯度浓度的(NH₄)₂SO₄[于含0.1mM 2-巯基乙醇的20mM Na-MES缓冲液(pH6.4)中1.25～0M]将酶洗脱。收集活性部分。

用含0.1mM 2-巯基乙醇的25mM Na-MES缓冲液(pH5.0)透析后，将酶部分上样到用相同缓冲液平衡的HiTrap SP柱(1ml，Amersham PharmaciaBiotech AB，瑞典)上。用相同缓冲液清洗柱子后，用线性梯度浓度的NaCl(于相同缓冲液中的0～0.5M NaCl)将酶洗脱并收集活性部分。将酶溶液用20mM Na-MES缓冲液(pH6.4)透析，然后用Centricon 30(Amicon有限公司，USA)浓缩。将酶溶液保存于-80℃直至使用。

最后，由运动发酵单孢菌经440倍纯化得到纯度约为30％的含葡糖酸内酯酶的酶溶液(0.319mg蛋白质)。在SDS-PAGE上该酶的亚基大小约为32kDa，与由运动发酵单孢菌ATCC29191报道的相同[生物化学及生物物理学学报1171，198-200(1992)]。(2)运动发酵单孢菌IFO13756的葡糖酸内酯酶作用下由2-酮-L-古洛糖酸转变为L-抗坏血酸

将部分纯化后的运动发酵单孢菌葡糖酸内酯酶用于由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗坏血酸的转变。反应混合物含8％2-酮-L-古洛糖酸钠单水化物、1mM CaCl₂和320μg/ml部分纯化后的酶(于200mM Na-MES缓冲液，pH5.5中)。反应在厌氧条件下于50℃进行20小时。用HPLC在YMC-PackPolyamine II柱(ID 4.6×150mm；YMC公司，日本)上于264nm检测L-抗坏血酸，流动相溶剂含70％(v/v)乙腈和15mM磷酸二氢铵，流速1.5ml/min。生成L-抗坏血酸236.3mg/l(表1)。

表1

酶来源        反应条件L-抗坏血酸(mg/l)酶样品 Na-2KGA·H₂O^*3pH  温度 时间(μg/ml)  (％)             (℃)(小时)葡糖酸内酯酶^*1不加酶葡糖酸内酯酶^*2不加酶内酯水解酶不加酶运动发酵单孢菌大肠杆菌尖镰孢 320      8.0          5.5  50  20 0        8.0          5.5  50  20 269      8.0          5.5  70  20 0        8.0          5.5  70  20 400      12.0         5.0  55  20 0        12.0         5.0  55  20 236.3 1.3 30.5 4.0 714.8 7.2*1：酶纯度：约30％*2：酶纯度：低于30％*3：Na-2KGA·H₂O：2-酮-L-古洛糖酸钠单水化物实施例2(1)大肠杆菌C600(IFO14410)的葡糖酸内酯酶的部分纯化

将大肠杆菌C600在6升含0.2％葡萄糖的LB培养基中于37℃培养5小时。离心收集细胞，并用含0.1M NaCl的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)清洗。

在酶纯化过程中，所有柱层析于4℃进行。如实施例1描述通过分光光度法测定酶活性。实验混合物含200mM D-半乳糖酸-γ-内酯、50μg/ml对硝基苯酚、10mM Na-MES缓冲液(pH6.4)和酶。产生的D-半乳糖酸造成的酸化检测为405nm吸收值的降低。

将细胞(湿重15.4g)悬浮于1,200ml含30％蔗糖的30mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，然后加入EDTA(pH8.0)至1mM。悬浮液在室温下搁置并搅拌30分钟。离心(8,000xg，20分钟，4℃)收集细胞，并重悬浮于12ml含30％蔗糖的30mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。将悬浮液倒入1,800ml冰冷的5mM MgSO₄·7H₂O中稀释，并在冰上搁置并搅拌30分钟。将所得悬浮液离心(8,000xg，20分钟，4℃)得到上清液作为周质部分。

向周质部分，加入Tris-HCl缓冲液(pH7.5)和2-巯基乙醇分别至25mM和0.1mM，然后加入(NH₄)₂SO₄至1.5M。将所得周质部分上样于Butyl-Toyopearl 650 S柱(40ml：ID 2.5×8.2cm，TOSOH公司，东京，日本)中，该柱已用含0.1mM 2-巯基乙醇和1.5M(NH₄)₂SO₄的25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡。用平衡缓冲液清洗柱子后，用线性梯度浓度的(NH₄)₂SO₄[于含0.1mM 2-巯基乙醇的25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中的1.5～0M]将酶洗脱并收集活性部分。

用含0.1mM 2-巯基乙醇的25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)透析后，将酶部分上样于用相同缓冲液平衡的HiTrap Q柱(1ml，AmershamPharmacia Biotech AB，瑞典)上。用相同缓冲液清洗柱子后，用线性梯度的NaCl(于相同缓冲液中的0～0.8M NaCl)将酶洗脱并收集活性部分。

将酶溶液用25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)透析，然后上样于用相同缓冲液平衡的RESOURCE Q柱(1ml，Amersham Pharmacia Biotech AB，瑞典)上。用相同缓冲液清洗柱子后，用线性梯度浓度的NaCl(于相同缓冲液中的0～0.6M NaCl)将酶洗脱并收集活性部分。将酶溶液用相同缓冲液透析，然后用Centricon 30(Amicon有限公司，USA)浓缩。最后，由大肠杆菌500倍纯化得到含葡糖酸内酯酶的酶溶液(0.291mg蛋白质)。在SDS-PAGE上观察到至少5条蛋白质带。将酶溶液保存于-80℃直至使用。(2)大肠杆菌C600(IFO14410)的葡糖酸内酯酶作用下由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗坏血酸的转变

将部分纯化后的大肠杆菌葡糖酸内酯酶用于由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗坏血酸的转变。反应混合物含8％2-酮-L-古洛糖酸钠单水化物、1mMCaCl₂和269μg/ml部分纯化后的酶(于200mM Na-MES缓冲液，pH5.5中)。反应在厌氧条件下于70℃进行20小时，并如实施例1所述用HPLC检测L-抗坏血酸。生成L-抗坏血酸30.5mg/l(表1)。实施例3(1)尖镰孢IFO5942的内酯水解酶的纯化

基本上按照文献描述的方法[S.Shimizu等人，欧洲生物化学杂志209，383-390(1992)]由IFO5942菌株纯化尖镰孢的内酯水解酶。通过监控葡糖酸内酯酶的活性纯化酶。用实施例1所述方法测定活性。实验混合物含25mM D-半乳糖酸-γ-内酯、0.25mM对硝基苯酚、20mM 3-吗啉代-1-丙烷磺酸钠缓冲液(pH7.2)和1mM CaCl₂。产生的D-半乳糖酸造成的酸化由在405nm吸收值的降低检测。

将尖镰孢IFO5942在7.5升含3％蔗糖、0.4％NaNO₃、0.2％K₂HPO₄、0.1％MgSO₄·7H₂O、0.05％KCl、0.001％FeSO₄·7H₂O、0.002％ZnSO₄·7H₂O改进后的Czapek培养基(pH6.0)中于28℃培养48小时。用Whatman 1SP滤器(Whatman NJ，UK)过滤收集细胞，并用“TB”缓冲液[含0.1mM二硫苏糖醇的20mM Tris-HCl(pH7.4)]清洗，得到湿重365g细胞。将细胞悬浮于1升TB缓冲液，加入2M Na₂CO₃至pH6.0～6.2，在10～15℃保温7天。将所得细胞悬浮液用Whatman 1SP滤器过滤并将所得滤出液离心以除去细胞碎片；由细胞分离出约1升上清液。将上清液用5升TB缓冲液透析，得到1200ml细胞提取液，含408mg总蛋白。首先将细胞提取液上样于DEAE-Toyopearl 650M(TOSOH公司，东京，日本，ID 4.4×4cm，60ml，用TB缓冲液平衡)上。用1升TB缓冲液清洗后，用540ml于TB缓冲液中的0～0.3M NaCl线性梯度浓度将蛋白质洗脱。收集活性部分，用2升TB缓冲液透析并上样于SuperQ-Toyopearl 650M(TOSOH公司，日本，ID1.5×8cm，14ml，用TB缓冲液平衡)上。用20ml TB缓冲液清洗后，用240ml于TB缓冲液中的0～0.15M NaCl线性梯度浓度将蛋白质洗脱。收集活性部分(30ml)并用20ml TB缓冲液稀释(最终蛋白质浓度约为1mg/ml)。向得到的50ml酶溶液中，加入0.5ml 2M Tris-HCl(pH8.25)和30g固体硫酸铵(约85％饱和硫酸铵)并于4℃保温10分钟。15,000rpm离心30分钟除去沉淀的蛋白质。为了除去硫酸铵，将有酶活性的上清液用TB缓冲液充分透析，在浓缩器中用YM-30滤器(Amicon有限公司，MA，USA)反复浓缩和稀释。透析和浓缩后(直至小于10ml)，酶开始以晶体(针芒)析出。离心收集结晶的酶，用TB缓冲液清洗两次并以纯化酶浓度为2.0mg/ml蛋白质溶于含0.1M KCl的TB缓冲液中。最后，由细胞提取液中以约56倍的纯化系数和27％的回收产量得到在SDS-PAGE上显示单一60kDa条带的2mg纯化后酶。将纯化后的酶保存于-80℃直至使用。(2)尖镰孢IFO5942的内酯水解酶作用下由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗坏血酸的转变

将纯化后的尖镰孢内酯水解酶用于由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗坏血酸的转变。反应混合物含12％2-酮-L-古洛糖酸钠单水化物、0.2M醋酸钠缓冲液(pH5.0)和1mM CaCl₂。反应在厌氧条件下于55℃进行20小时，并如实施例1所述用HPLC检测生成的L-抗坏血酸。含400μg/ml纯化酶的反应混合物生成L-抗坏血酸714.8mg/l。不含纯化酶的相同反应条件显示L-抗坏血酸背景积累7.2mg/l(表1)。(3)尖镰孢IFO5942的内酯水解酶的酯选择性

将2-酮-L-古洛糖酸甲酯(12％w/v)、尖镰孢IFO5942的内酯水解酶(100μg/ml)和0.2M Na-MES缓冲液(pH7.0)在氩气中于50℃保温2小时。加入内酯水解酶对2-酮-L-古洛糖酸甲酯的消耗没有影响。

在下列条件下检测对2-酮-L-古洛糖酸(12％)与甲醇(10％)的直链酯合成活性：将2-酮-L-古洛糖酸钠单水化物(12％w/v)、甲醇(10％)、尖镰孢IFO5942的内酯水解酶(200μg/ml)和0.2M醋酸钠缓冲液(pH5.0)在氩气中于50℃保温20小时。没有检测到2-酮-L-古洛糖酸甲酯，而检测到L-抗坏血酸219mg/l。

实施例4脂肪酶的由2-酮-L-古洛糖酸到L-抗坏血酸的转变活性

没有检测到德氏根霉(Rhizopus delemar)脂肪酶具有将2-酮-L-古洛糖酸转变为L-抗坏血酸的活性。反应混合物含购自SEIKAGAKU公司(编号No.100890，东京，日本)的德氏根霉脂肪酶、6％2-酮-L-古洛糖酸钠单水化物、0.2M醋酸钠缓冲液(pH5.0)和1mM CaCl₂。反应在厌氧条件下于37℃进行20小时，并如实施例1所述用HPLC检测生成的L-抗坏血酸。含500μg/ml脂肪酶RD的反应混合物没有生成可检测量的L-抗坏血酸(表2)。含100μg/ml尖镰孢内酯水解酶的相似反应条件由3.2％2-酮-L-古洛糖酸钠单水化物生成了L-抗坏血酸48.3mg/l(表2)。

表2

酶来源                反应条件L-抗坏血酸  (mg/l)酶样品  Na-2KGA·H₂O^*1 pH   温度  时间(μg/ml)   (％)               (℃)  (小时)脂肪酶内酯水解酶不加酶德氏根霉尖镰孢  500      6.0           5.0   37    20  100      3.2           5.0   37    20  0        3.2           5.0   37    20   0   48.3   0.5*1：Na-2KGA·H₂O：2-酮-L-古洛糖酸钠单水化物

实施例5运动发酵单孢菌IFO13756和大肠杆菌C600的葡糖酸内酯酶作用下将2-酮-D-葡糖酸转变为D-异抗坏血酸

将部分纯化后的运动发酵单孢菌和大肠杆菌葡糖酸内酯酶用于由2-酮-D-葡糖酸到D-异抗坏血酸的转变。反应混合物含4.7％2-酮-D-葡糖酸半钙盐(Sigma化学公司，圣路易斯，密苏里州，USA)和运动发酵单孢菌或大肠杆菌葡糖酸内酯酶(于167mM Na-MES缓冲液，pH5.5)。加入运动发酵单孢菌葡糖酸内酯酶浓度为213μg/ml，反应在厌氧条件下于50℃进行20小时。加入大肠杆菌葡糖酸内酯酶浓度为180μg/ml，反应在厌氧条件下于70℃进行20小时。用HPLC在YMC-Pack Polyamine II柱(ID 4.6×150mm；YMC公司，日本)上于264nm检测D-异抗坏血酸，流动相溶剂含70％(v/v)乙腈和15mM磷酸二氢胺，流速1.5ml/min。运动发酵单孢菌和大肠杆菌葡糖酸内酯酶分别生成D-异抗坏血酸35.8mg/l和39.6mg/l(表3)。

表3

酶来源           反应条件D-异抗坏血酸(mg/l)酶样品 2-酮-D-葡糖酸^*3 pH 温度 时间(μg/ml)    (％)           (℃)(小时)葡糖酸内酯酶^*1不加酶葡糖酸内酯酶^*2不加酶运动发酵单孢菌大肠杆菌   213      4.7        5.5  50 20   0        4.7        5.5  50 20   180      4.7        5.5  70 20   0        4.7        5.5  70 20  35.8  0.47  39.6  2.34*1：酶纯度：约30％*2：酶纯度：低于30％*3：2-酮-D-葡糖酸半钙盐