一种新的肿瘤细胞多药耐药性逆转剂

摘要

本发明公开了一种新的肿瘤细胞多药耐药性逆转剂。其为从中药贝母中提取分离的异甾类生物碱衍生物,具有作为肿瘤细胞多药耐药性的逆转剂的新用途。从而为临床上治疗肿瘤提供了新的方法和手段。该化合物还可与其他药物作用进一步提高逆转效果。

说明书

本发明属于植物化合物新用途领域。该发明涉及一种新的多药耐药肿瘤细胞逆转剂。它们是从植物如百合科植物贝母中分离提取得到的异甾类生物碱衍生物。

化学抗癌药物治疗在肿瘤临床治疗中占有重要地位，但是肿瘤细胞耐药性问题却是化学治疗的巨大障碍。从某种意义上说，90％以上死于肿瘤的病例都与肿瘤原发或获得性耐药性有关。70年代开始就注意到肿瘤细胞的多药耐药性问题对临床联合化疗方案的影响极大(肿瘤学临床与基础研究进展P.245孙燕等著原子能出版社1994年第一版)。为此，国内外积极开展肿瘤细胞耐药性逆转剂的研究。目前实验室中已发现多种效果较高的逆转剂，如钙离子拮抗剂异博定，免疫抑制剂环孢菌素A等等。但由于毒副作用等问题，迄今尚无公认的可在临床普遍应用的药物(中华血液学杂志1990，3(2)：161，肿瘤防治研究1995，1(22)：61，实用肿瘤杂志1995，4(10)：204)。如上所述，当前临床迫切需要这类药物。

本发明的第一个目的是提供一类新型的肿瘤细胞多药耐药性逆转剂。

本发明的第二个目的是提供异甾类生物碱作为多药耐药肿瘤细胞逆转剂在治疗多药耐药肿瘤疾病中的用途。

本发明再一个目的是提供一种对于肿瘤细胞多药耐药性具有良好逆转作用的药物组合物。

根据本发明之目的，所提供的肿瘤细胞多药耐药性逆转剂是异甾类生物碱衍生物。该化合物主要系来自植物，可从常见中药如百合科植物贝母中分离提取。其可使肿瘤细胞多药耐药性大为减低。

该化合物具有下述结构：其中R₁可为或H R₂可为或＝O

R₃，R₄，R₅可为H，R₆可为OH

根据本发明，异甾类生物碱衍生物可按本领域已知方法配成肠道或非肠道组合药的制剂。如片剂、胶囊、粒剂、注射液等。

根据本发明，异甾类生物碱衍生物还可与其它逆转剂伍用，达到提高逆转作用的目的。如与异博定按1∶1伍用时可提高逆转作用近廿倍。

有益的效果：本发明所述的化合物具有临床应用前景，因为若在临床上给予相应于贝母剂量的药量时，不致于有明显的毒副作用，而且该化合物可使肿瘤细胞多药耐药性大为减低，可达五倍左右。如与异博定(临床常用药物)伍用，效果尚可大为提高。预示该类化合物临床应用的前景较好。肿瘤耐药性问题是化学治疗的巨大障碍。死于肿瘤的病例都与肿瘤原发或获得性耐药性有关。所以当前临床迫切需要这类逆转药物用于治疗多药耐药性肿瘤疾病。

下面的实施例将详细说明本发明。实施例1 异甾类生物碱衍生物的提取及结构鉴定：

本发明的化合物可从植物如百合科植物贝母中提取得到。其具体制备路线如下：

取浙贝母饮片9kg，加95％乙醇，回流提取。药渣复加95％乙醇，回流提取。弃去药渣。合并醇提取液。减压回收乙醇，得醇提取物。醇提取物以2～3％盐酸搅溶，滤除不溶物。酸水液以氢氧化钠调PH至10，以三氯甲烷抽取。分出三氯甲烷层。回收溶剂，得总生物碱16.5g。总生物碱经硅胶柱层析，三氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，依此得化合物甲0.78g，化合物乙0.65g，化合物丙0.66g，化合物丁0.84g，化合物戊0.12g。经鉴定：

化合物甲为无色针状结晶mp214～215℃.EL-MSm/z：429.3(M⁺)，411.3，384.3，155.1，154.1，112.1(100％)，98.1，69.1。¹HNMRδppm(CD₃OD，400MHz)：0.76(3H，S，H-19)，1.05(3H，S，H-21)，1.11(3H，d，J＝7.33Hz，H-27)，3.51(1H，m，W_1/2＝18.6Hz，H-3).¹³CNMR数据见下表。其与peimine标准品混合熔点不下降，共薄层Rf一致。

化合物乙为无色针状结晶，mp222-224℃.¹HNMR &ppm(CD₃OD，400MHz)：0.83(3H，s，H-19)、1.04(3H，s，H-21)、1.11(3H，d，J＝6.84Hz，h-27)、3.35(1H，m，H-6)、3.52(1H，m，H-3)、3.59(1H，q).¹³CNMR数据见下表。由以上数据推断乙为peiminine.

化合物丙为淡黄色砂晶，mp246-248℃.EI-MS m/z：592.2(M+1)⁺，574.2，458.2，430.2，412.2，394.2，155.1，154.1，112.1(100％)，98.0，69.0.¹HNMR & ppm(CD₃OD，400MHz)：0.86(3H，s，H-19)、1.13(3H，d，J＝7.6Hz，H-27)、1.16(3H，s，H-21)、4.39(1H，d，J＝7.62HzH-1’H-6).¹³CNMR数据见下表。由以上数据推断为zhebeinonoside。

化合物丁为淡黄白色粉末，mp246-248℃.EI-MS m/z：5942(M+1)⁺，576.2，460.2，432.2，414.2，396.2，155.1，154.1，112.1(100％)，98.0，69.0.¹HNMR & ppm(CD₃OD，400MHz)：0.77(3H，s，H-19)、1.05(3H，s，H-21)、1.11(3H，d，J＝6.86Hz，H-27)、4.39(1H，d，J＝7.63Hz，H-1’).¹³CNMR数据见下表。由以上数据推断丁为peiminoside。

化合物甲…丁的¹³CNMR化学位移值ppm(CD₃OD，400MHz)

碳       甲      乙      丙      丁

1       38.8    39.9    38.0    39.0

2       32.1    32.5    30.6    30.0

3       73.1    73.2    78.8    79.4

4       31.6    33.9    29.7    30.0

5       58.4    54.1    57.4    53.1

6       214.7   71.9    213.8   71.1

7       47.4    42.2    46.6    41.2

8       43.6    40.9    42.7    39.6

9       58.4    59.2    57.5    58.3

10      40.3    37.1    39.6    36.4

11      31.6    31.6    29.9    29.6

12      42.9    43.1    42.0    41.6

13      40.9    40.7    40.0    39.0

14      46.3    46.0    45.4    45.0

15      26.3    26.6    25.5    25.4

16      22.6    22.6    21.8    21.7

17      51.1    51.2    50.2    49.6

18      64.1    64.2    63.2    61.9

19      13.7    14.0    12.9    13.1

20      73.1    73.1    72.3    72.0

21      22.2    22.4    21.4    21.2

22      72.2    71.9    72.2    71.8

23      21.1    21.1    20.2    19.5

24      30.8    31.1    29.1    29.3

25      30.0    30.0    27.5    28.3

26      64.2    64.4    63.2    62.8

27      18.7    18.7    17.8    17.0

1’                     102.3   102.2

2’                     75.1    75.1

3’                     78.1    78.1

4’                     71.7    71.7

5’                     77.9    77.9

6’                     62.8    62.8实施例2：生物评价

在下面生物实验中主要通过上述化合物(以下简称为化合物PM)体外试验及整体试验对于肿瘤细胞多药耐药性的逆转作用来简述本发明。

生物实验主要通过化合物PM对于多种敏感及多药耐药肿瘤细胞的杀伤作用对其进行效果的评价，并利用荷瘤裸鼠模型对化合物PM进行其逆转效果的评价。一、材料与方法：1.1材料1.1.1细胞与动物细胞株：

K562、HL60、MCF-7，KB细胞，前三者细胞由中国医学科学院血液学研究所药物室提供，后者由军事医学科学院放射医学研究所提供。

K562/A02多药耐药细胞株以P_gp蛋白升高为主要耐药机制。由中国医学科学院血液学研究所药物室诱导并提供。对阿霉素耐药40倍，对三尖杉酯碱，长春新碱，VP16，柔红霉素等交叉耐药。

MCF-7/Adr：多药耐细胞株，以P_gp蛋白表达升高为主要耐药机制，由中国医学科学院血液学研究所药物室引自北京肿瘤研究所，并提供作者使用。对阿霉素耐药100倍，对三尖杉酯碱，长春新碱，VP16，柔红霉素等交叉耐药。

HL60/Adr多药耐药细胞株，以多药耐药相关蛋白(MRP)表达升高为主要耐药机制。由中国医学科学院血液学研究所药物室引自日本国细胞库并提供作者使用。对阿霉素耐药100倍，对高三尖杉酯碱，米托蒽醌，柔红霉素，氨甲蝶呤等交叉耐药。

KB_V200多药耐药细胞株，以P_gp蛋白表达升高为主要耐药机制。由军事医学科学院放射医学研究所引自中国医学科学院药物研究所并提供作者使用，对长春新碱耐药175倍，对阿霉素，紫杉醇，秋水仙素交叉耐药。动物：Balb/C裸鼠，4-6周，雌性，体重16±2克，购自军事医学科学

院实验动物中心；

昆明种小鼠，6-8周，雌、雄性，20±2克，购自军事医学科学院

实验动物中心。1.1.2试剂

化合物PM溶液：化合物PM中加入少量双蒸水后，滴入1NHCl使溶(PH～2)，再加双蒸水至200μg/ml作为母液，再以RPMI1640培养液配制成工作液。

阿霉素    标准品，中国卫生部药品鉴定所

长春新碱  北京医科大学实验药厂

RPMI1640培养基美国SIGMA公司

小牛血清军事医学科学院

MTT (进口)华美公司分装实验用品及仪器：

培养瓶

培养板

二氧化碳培养箱

酶标仪

液相色谱仪1.2实验方法：1.2.1细胞杀伤增敏试验(1)测定各耐药株细胞对阿霉素或长春新碱的耐药倍数；(2)测定化合物PM对于各细胞株毒性，先选择对于细胞生长抑制率低于10％(IC₅₀)的浓度作增敏试验。(3)测定化合物PM与阿霉素或长春新碱联合应用时化合物PM的增敏作用(4)试验操作步骤：

取对数生长期液体培养细胞，用含10％小牛血清的RPM1640培养液配成细胞悬液，每孔180μl(细胞毒试验)或160μl(增敏试验)加至96孔塑料培养板，使每孔细胞数为2×10⁴个，细胞在培养板中适应生长12小时，分组加入实验药物各20μl，设无血清培养液调零孔和不加药细胞空白对照组，每组设三个平行孔，每孔终体积为200μl，不足部分以药物溶剂补足。置二氧化碳培养箱中，37℃，饱和湿度，5％CO₂条件下培养68小时，每孔加入5mg/ml MTT液20μl，相同条件培养4小时，去上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μl，微量振荡器振荡，充分溶解药物，酶标仪检测540nM波长OD值。(5)计算方法细胞生长抑制率IC₅₀＝抑制率为50％时的药物浓度1.2.2小鼠肿瘤治疗增敏试验(1)肿瘤细胞的接种：取对数生长期多药耐药细胞株KB_V200细胞悬液1.5×10⁷/ml，0.2ml接种于裸鼠背部皮下。(2)接种KB_V200细胞五日后(第六日)分组为对照组、腹腔注射长春新碱0.4μg/鼠/天组，或长春新碱0.4μg/鼠/天伍用化合物PM30μg/鼠/天组。五日作为一疗程，休息二日，继续一疗程。(3)测定化合物PM的增敏作用，治疗二疗程后立即活杀小鼠，称瘤体重量，作为评价指标。1.2.3化合物PM的药代动力学试验(1)化合物PM溶液30μg/0.2ml腹腔注射小鼠(1.5mg/kg体重)，不同   时间活杀取血及肝、脾、肺与脑组织。(2)高效液相色谱法测定不同时间血浆及组织中化合物PM量。二、结果2.1 K562/A02，MCF-7/Adr，HL60/Adr，KB_V200细胞株耐药倍数测定细胞株       阿霉素IC₅₀     长春新碱IC₅₀   耐药倍数

         (μg/ml)        (ng/ml)K562         0.45±0.051K562/A02     17.56±1.823                      39MCF-7        0.06±0.007MCF-7/Adr    8.96±0.986                       140HL60         0.08±0.009HL60/Adr     8.16±1.027                       102KB                              6.7±0.7KB_V200                        1297.6±0.33     193化合物PM的细胞毒性测定：细胞系        化合物PMIC₅₀         IC₁₀

          (μg/ml)              (μg/ml)K562          328.50±36.52         65.35±7.58K562/A02      300.06±33.18         60.63±7.34MCF-7         438.03±38.56         97.20±11.2MCF-7/Adr     412.02±45.40         83.16±9.35HL60          288.27±34.23         66.29±8.10HL60/Adr      256.52±26.15         58.08±6.02KB            104.32±34.96         21.51±10.29KB_V200        130.69±24.56         46.30±12.67

化合物PM对阿霉素杀伤耐药肿瘤细胞的增敏作用。按细胞生长抑制率为50％计算的增敏倍数：细胞系           AdrIC₅₀          Adr+PMIC₅₀      增敏倍数

             (μg/ml)         (μg/ml)K562             0.45±0.058      0.31±0.041      1.5K562/A02         17.52±1.932     3.07±0.426      5.7MCF-7            0.06±0.008      0.05±0.006      1.2MCF-7/Adr        8.96±0.974      1.53±0.212      5.9HL60             0.04±0.005      0.04±0.006      1.0HL60/Adr         8.16±9.083      1.45±0.197      5.6^*PM的终浓度为50μg/ml，N＝5

化合物PM对长春新碱(Vin)杀伤耐药肿瘤细胞的增敏作用。按细胞生长抑制率为50％计算的增敏倍数：细胞系             VinIC₅₀        Vin+PMIC₅₀       增敏倍数

               (ng/ml)        (ng/ml)KB                 4.87±1.55     1.69±0.63         2.8KB_V200             1661.6±552    233.89±65.0       7.9^*PM的终浓度为20μg/ml N＝3

多次实验结果表明：化合物PM对于阿霉素或长春新碱杀伤多药耐药肿瘤细胞具有明显的增敏作用，即PM对于上述二种药物耐药的肿瘤细胞确实具有明显的逆转作用。其逆转倍数约可达5左右。为推测其临床应用的可能性，又应用MCF-7/Adr细胞系测试了化合物PM不同药量时杀伤此多药耐药肿瘤细胞的IC₅₀，并计算其逆转倍数的变化。结果如下表：

PM剂量(μg/ml)       逆转倍数

50                    5.6

20                    3.46

10                    1.54

5                     1.24

2.5                   1.19

0.5                   1.20^*细胞株为MCF-7/Adr

结果表明化合物PM在高浓度时对于阿霉素杀伤耐药细胞的增敏效果较好。随着化合物浓度的下降，此作用也迅速减失。这种量效关系变化的趋势与其他逆转剂如异博定雷同(Biochem Pharmacology1995，50(8)：1245-55)，而后者在临床验证中尚未能肯定其实际应用价值，障碍就在于药物浓度高时有作用，但人体中无法达到此水平(中华血液学杂志1988，9(6)：340-3)而药物浓度低时，效果又太低的缘故。因此如能提高化合物PM低浓度时的效果才可能会具有实际应用的意义。本发明采用低剂量化合物PM与低剂量异博定(Ver)伍用，以提高PM对MCF-7/Adr细胞的作用，结果如下：

组别             逆转倍数

PM(0.5μg/ml)    1.151

Ver(0.5μg/ml)   1.199

PM+Ver           1.540

(0.5μg+0.5μg)

此说明异博定可使PM作用提高。而这结果如与前表(不同剂量PM的逆转效果)相参比，可大致估计其相当于PM10μg/ml时的效果，即相当PM提高了廿倍用药量的效果；由于异博定的剂量很低，此剂量是人体完全可以耐受的。在这种条件下化合物PM伍用异博定可能会具有实际临床应用的意义。2.2化合物PM对于荷瘤小鼠整体试验中的逆转作用

实验用Balb/C裸鼠，体重约16±2g，龄4-6周。

皮下接种1.5×10⁷/mlKB_V200细胞0.2ml后五日分组。为对照组，长春新碱i.p 4μg/鼠/天组，长春新碱 i.p 4μg/鼠/天，加PM i.p30μg/鼠/天组。药物注射5天为一疗程，休息二天。再用药一疗程后即活杀称瘤重。结果如表：

组别           瘤重(g)

对照           0.846±0.237

长春新碱       0.731±0.400

长春新碱+PM    0.618±0.407

^*N＝5

初步结果表明，长春新碱可使瘤体生长比对照组者缓慢，而长春新碱加PM者效果更好。2.3化合物PM的药代动力学试验

利用反相液相色谱法定量分析小鼠i.p PM 30μg/鼠后不同时间血浆及肝、脾、肺与脑组织中化合物PM的含量。血浆中药物浓度变化见表：

取血时间             PM浓度(μg/ml)

(注药后)             (M±SD)

5分                  0.78±0.190

10分                 0.96±0.140

20分                 0.79±0.087

30分                 0.53±0.008

60分                 0.43±0.072

2小时                0.25±0.035

4小时                0.11±0.020

8小时                0.034±0.008

12小时              0.00

^*N＝4

小鼠腹腔注射化合物PM后药代动力学参数T(1/2)    C(Max)    T(Peak)    AUC         CL/F(S)            V/F(C)(h)       (μg/ml)    (h)      (μg/ml)h   μg/kg/h(μg/ml)   (μg/kg/μg/ml)0.84       0.87       0.15      1.60         1265.9            1535.9各脏器中药物浓度变化趋势与血浆者基本相似但峰值移后，脾脏及淋巴结中含量较高。讨论：

随着多药耐药性问题发生的机制及逆转剂的深入研究，逐渐了解到多种细胞组份如P_gp蛋白，多药耐药相关蛋白(MRP)，肺耐药蛋白(LRP)，谷胱苷肽转移酶(GST)，拓扑异构酶-II(Top-ll)等的表达或功能的变化均可导致耐药性的变化(Science 1983，221：1285-88，Cancer Res.1989，49：6634，Cancer Res.1991，51：6592，Cancer 1992，70：764，Anticancer Res.1996，16(2)：709-14)。而目前所知的逆转剂一般作用还比较单一，如异博定、环孢菌素A等对于表达P_gp的多药耐药细胞作用明显(Molecular Pharmacology 1995，47：51-56，Anticancer Res.1992，12(6B)：2127-32)。因此，寻找作用更为广泛或作用于其他机制的逆转剂就显得很为重要。发现新型化学结构的逆转剂就会增加这种可能性。本发明的异甾类生物碱作为逆转剂是属于新类型化学结构，而又能作用于二种机制不同的多药耐药细胞株(如MCF-7/Adr及HL60/Adr)，故从其化学结构及功能特点而言是属于新一类的多药耐药逆转剂，因而其临床应用前景或可能与作用较为单一的逆转剂有所不同。目前逆转剂过渡到临床应用时遇到的最大困难是病人只能耐受比较小的药量，血液浓度水平很低，与离体细胞试验时的有效浓度比较，相差很多。因此，如在细胞试验中，找到低浓度仍然具有作用的药物，就易于与临床相衔接。本发明考虑到化合物PM与其他逆转剂如异博定的作用机制有所不同。因此伍用，以增加效果。结果本资料表明化合物PM0.5μg/ml(相当于IC₁₀的1/100)伍用异博定0.5μg/ml(临床安全用量)效果明显。因为在临床病人中较易达到这个用药剂要求，因而实际应用前景较为乐观。结论：1.化合物PM在离体试验时对于多药耐药肿瘤细胞株K562/A02，MCF-7/Adr，HL60/Adr及KB_V200均有逆转作用，用药浓度较大时(～IC₁₀)，逆转系数可达5倍左右，降低药物浓度则效果迅速下降。但PM0.5μg/ml(IC₁₀的1/100浓度)与异博定0.5μg/ml(临床安全用量)伍用时作用增加，约相当PM10μg/ml时效果。在荷KB_V200细胞裸鼠初步试验表明长春新碱0.4μg/鼠i.p治疗的小鼠二周后瘤重为对照的87％，而长春新碱0.4μg/鼠加化合物PM30μg/鼠i.p治疗者为73％。化合物PM对小鼠的毒性为：口服LD₅₀11.4mg/kg，腹腔注射LD₅₀ 6.67mg/kg。腹腔注射1.5mg/kg后10分钟血浆浓度即达高峰。T_1/2为0.84h，C(Max)0.87μg/ml，T(peak)0.15h，AUC1.60μg/ml.h组织浓度的消长趋势与血浆者雷同，脾脏及淋巴结中含量较高。