表面活性剂对肿瘤细胞多药耐药的逆转作用

摘要

多药耐药(Multidrug Resistance,MDR)是肿瘤化疗失败的主要障碍。MDR是指肿瘤细胞接触某一种抗癌药物后对它产生耐药的同时,也对其它结构、作用机理完全不同的药物产生交叉耐受性的现象。其表现出的耐药性常常是由于某一特殊蛋白,比如细胞膜转运蛋白的表达增加,导致细胞毒性药物从肿瘤细胞的外排增加,即药物外排泵的作用增强,从而降低细胞内药物浓度。MDR的病因学因素可能是多方面的,但经典观点认为主要是P-糖蛋白(P-Glycoprotein,P-gp),一个分子量为170KD的ATP能量依赖性药物外排泵,是MDR产生的重要因素。外排泵抑制剂不仅可以抑制肿瘤细胞对药物的外排,恢复其对药物的敏感性,提高对肿瘤的临床治疗效果,而且在改善某些药物的药动学特性(如提高口服药物的吸收,降低肝、肾清除率)方面也有重要作用。许多早期的第一代、第二代外排泵抑制剂包括维拉帕米、环孢霉素A、他莫昔芬和一些钙调素拮抗剂在上个世纪80年代就被确认,但由于它们对转运蛋白的低亲和力导致了必须使用很高的剂量才能有效,从而产生一些不可接受的毒副作用,而且许多抑制剂也是其他酶系统的底物,因此会引起不可预测的代谢方面的改变。这就启示我们必须寻找一些无毒的、无药理活性的逆转剂。表面活性剂相对的无毒性和无药理活性正符合这些要求,因而也被称为第三代外排泵抑制剂。
　　 本研究采用长期、单一、小剂量用药的方法诱导慢性粒细胞白血病急变细胞系K562/S细胞系成为耐药细胞系K562/A02。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)生物活性法检测上述两种细胞对阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素、5-氟脲嘧啶、长春新碱、顺铂、依托泊苷、三尖杉酯碱等抗肿瘤化疗药物的敏感性,结果发现K562/A02细胞系对阿霉素、柔红霉素、长春新碱、依托泊苷、三尖杉酯碱均产生耐药性,其耐药倍数在18～94倍之间。证明阿霉素诱导的白血病多药耐药细胞系K562/A02具有多药耐药性,可以作为进一步体外筛选逆转肿瘤多药耐药的新药物或物质的细胞模型。
　　 研究了硬脂酸聚氧乙烯酯(S-40)、泊洛沙姆(F-68)、蓖麻油聚氧乙烯醚(EL-35)、吐温(T-60)、辛基酚聚氧乙烯醚(Triton—100)、聚乙二醇类(PEG-1000,PEG-400)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)9种不同表面活性剂及具有逆转肿瘤细胞多药耐药作用的药物维拉帕米的细胞毒性,并比较同一表面活性剂对药物敏感肿瘤细胞和多药耐药肿瘤细胞的细胞毒性之间的差别。结果非离子表面活性剂对肿瘤细胞K562/S及其多药耐药细胞K562/A02的IC50在10-1mg·ml-1数量级,阳离子及阴离子表面活性剂的IC50为10-3mg·ml-1数量级,上述10种物质的细胞毒性由小到大排序为:F.68-　　 选择并确定表面活性剂及其没有细胞毒性的浓度,以维拉帕米作阳性对照,检测不同的表面活性剂在不同的浓度下逆转多药耐药细胞系K562/A02对不同抗肿瘤药物耐药的能力。结果非离子表面活性剂硬脂酸聚氧乙烯、泊洛沙姆、蓖麻油聚氧乙烯醚、吐温-60、辛基酚聚氧乙烯醚这几种表面活性剂均能降低抗肿瘤药物阿霉素、柔红霉素、长春新碱、依托泊苷、三尖杉酯碱对K562/A02细胞的IC50,提高多药耐药细胞对这几种抗肿瘤药物的敏感性。阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂尽管本身细胞毒性较大,但在实验浓度没有降低这些抗肿瘤药物的IC50,即不能增加耐药细胞对抗肿瘤药物的敏感性。同一表面活性剂对不同抗肿瘤药物细胞毒性改变的能力不同,可以推测肿瘤细胞耐药对不同的抗肿瘤药物耐药机制是不同的,对同一抗肿瘤药物耐药的机制也非单一的。
　　 应用流式细胞仪研究P-糖蛋白(P—gp)的底物Rh123在多药耐药细胞K562/A02及其亲本细胞K562/S内的蓄积差异,并研究F-68对多药耐药细胞K562/A02内Rh123蓄积及外排的影响。结果显示肿瘤细胞K562/S及其多药耐药细胞K562/A02细胞内的Rh123荧光强度有明显差异,在没有F-68或Ver的作用下,K562/S细胞内Rh123潴留的荧光强度比K562/A02耐药细胞内Rh123的荧光强度约高31倍。由此证明K562/A02细胞多药耐药机制之一是由于P—gp药物外排功能的亢进。F-68能显著增加K562/A02细胞内R123的蓄积并抑制其外排,但对K562/S细胞内R123的蓄积和外排没有明显作用,提示F-68逆转多药耐药的机理不是非特异性地改变细胞膜的转运活性而起作用,而是有选择性地改变K562/A02细胞P-gp的功能。
　　 用大鼠离体外翻小肠囊法研究在F-68作用下,地塞米松作为P-糖蛋白底物从外翻小肠囊的浆膜层向粘膜层转运量的变化,并以维拉帕米作阳性对照,检测表面活性剂F-68在0.5mg/ml和5mg/ml的浓度下抑制小肠P-gp对不同浓度地塞米松外排能力。结果表明F-68在0.5mg/ml的浓度下能显著地抑制P-gp外排地塞米松的能力,且其抑制能力要大于浓度为125μg/ml的维拉帕米(P<0.05),但在高浓度(5mg/ml)时,F-68对离体肠P-gp底物的外排不仅没有抑制作用,而且由于其对肠囊的表面活性作用使药物的透过增加,从另一个角度说明了其抑制P-gp功能与改变细胞膜的通透性无关。实验还发现,高浓度地塞米松组的外排药量虽然高于低浓度组,但其外排率却低于低浓度地塞米松组,说明P-gp外排作用具有一定饱和性。
　　 通过用含P-gp底物地塞米松的Krebs液进行大鼠原位小肠灌流,测定灌流液在表面活性剂F-68存在下地塞米松减少量的变化,研究表面活性剂F-68对原位小肠P-gp减少药物吸收的影响；通过静脉注射P-gp底物地塞米松后,用含有F-68的Krebs液作大鼠原位小肠灌流,测量小肠灌流液中被外排的地塞米松增加量的改变,研究F-68对原位小肠P-gp外排功能的作用。结果F-68能促进P-gp底物地塞米松的吸收,减少静脉推注后药物从小肠的外排,从而提高血药浓度。与阳性对照盐酸维拉帕米比较,其抑制原位小肠P-gp底物外排的能力无显著性差异。(P>0.05)。
　　 综上所述,一些非离子表面活性剂具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用,其逆转机制是抑制P—gp的外排功能。这为临床提高抗肿瘤药物的抗肿瘤治疗效果,减少肿瘤细胞对药物的外排,提高其对药物的敏感性,提供了研究方向和试验手段,而且它们还可以改善某些药物的药动学特性(如提高口服药物的吸收,降低肝、肾清除率)。其中F-68更是毒性低,刺激性小,生物相容性好,可用于水溶性、脂溶性、甚至一些难溶性药物的载体,是一种理想的药物辅料,在药剂学领域将会有更广泛的应用。