使用连续传代的哺乳动物细胞系制备马立克氏病病毒的方法

摘要

本发明涉及使用连续传代的哺乳动物细胞系生产非重组和重组的马立克氏病病毒,生产经基因工程改造的马立克氏病病毒和马立克氏病病毒载体的方法,被马立克氏病病毒感染的连续传代的哺乳动物细胞系,以及使用通过这种方法得到的马立克氏病病毒生产的马立克氏病病毒疫苗,和保护动物,如禽类,使之抵抗由马立克氏病病毒和/或其它病原体引起的疾病的方法。能被马立克氏病病毒感染或转染的哺乳动物细胞系特别有猫肾细胞系。

说明书

本发明涉及使用连续传代的哺乳动物细胞系生产非重组和重组的马立克氏病病毒，生产经基因工程改造的马立克氏病病毒和马立克氏病病毒载体的方法，被马立克氏病病毒感染的连续传代的哺乳动物细胞系，马立克氏病病毒载体，以及使用通过这种方法得到的马立克氏病病毒生产的疫苗，和通过施用使用这种方法生产的疫苗以保护禽类，使之抵抗由马立克氏病病毒和/或其它病原体感染引起的疾病的方法。具体地说，能被马立克氏病病毒感染或转染的哺乳动物细胞系是猫肾细胞系。

马立克氏病(MD)是鸡的急性致癌性疾病，该病可导致淋巴瘤，内脏肿瘤，神经损害和免疫抑制。该病是全球性的和普遍分布的，其病原体是疱疹病毒和马立克氏病病毒。马立克氏病是用于烤焙的鸡群死亡和不适用的主要原因(Calnek，B.W.和Witter，R.L.，Diseases of Poultry，第9版，Iowa State University Press，Ames，Iowa，pp342-385(1991))。

马立克氏病病毒有三种血清型，血清型1包括所有的病原体毒株和它们的减毒衍生物。血清型2由天然无毒的鸡病毒组成，而血清型3也已知为火鸡疱疹病毒(HVT)，它包括能在鸡中复制的无毒的火鸡病毒。这三种血清型能部分地交叉保护，但使用单克隆抗体(Silva，R.F.和Lee，L.F.，Virol.Vol.36，pp.307-320(1984))和其它已知的方法能将它们区分开。

针对MD的第一种疫苗由活的血清型3病毒组成，尽管它最初是有效的，但强毒性马立克氏病病毒(vv马立克氏病病毒)株的出现(由它们破坏HVT免疫接种的能力确定)促进了血清型2和减毒的血清型1疫苗，以及血清型1，2和3的二价和三价组合疫苗的开发(Calnek，B.W.和Witter，R.L.，Diseases of Poultry，第9版，Iowa State University Press，Ames，Iowa，pp342-385(1991))。

马立克氏病病毒与其它疱疹病毒相比显得较难重组产生，病毒的细胞-相关特性使得重组体的噬斑纯化避开了纯化亲代病毒时所遇到的困难。然而，已经由血清型1(Sonoda，K.，等人，疫苗，第14卷，pp.277-284(1996)；Parcells，M.S.，等人，病毒学杂志，第69卷，pp.7888-7898(1995)；Parcells，M.S.，等人，病毒基因，第9卷，pp.5-13(1994)；Parcells，M.S.，等人，病毒学杂志，第68卷，pp.8239-8253(1994)；Sakaguchi，M.，疫苗，第12卷，pp.953-957(1994)；Reddy，S.K.，等人，疫苗，第14卷，pp.469-477(1996))，血清型2(Marshall，D.R.，等人，病毒学，第195卷，pp.638-648(1993)；Silva，R.F.，第14届国际疱疹病毒专题研讨会(文摘)(1989))；和血清型3(Reddy，S.K.，等人，疫苗，第14卷，pp.469-477(1996)；PCT专利申请WO95/29248(1995)；Silva，R.F.，第14届国际疱疹病毒专题研讨会(文摘)(1989)；Darteil，R.，等人，病毒学，第211卷，pp.481-490(1995)；1995年公布的美国专利5,187,087；Zelnik，V.，等人，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)，第76卷，pp.2903-2907(1995)；PCT专利申请WO93/25665(1993公布)；Ross，L.J.N.，等人，普通病毒学杂志，第74卷，pp.371-377(1993)；Sondermeijer，P.J.A.，等人，疫苗，第11卷，pp.349-358(1993)；欧洲专利431,668 B1(1995公布)；Morgan，R.W.，等人，Avian Dis.，第36卷，pp.858-870(1992)；Bandyopadhyay，P.K.，等人，第13届国际疱疹病毒专题研讨会(文摘)(1988))产生了重组的MD病毒。在上述所有的文献中，病毒是有复制活性的并在原代禽类细胞中产生。

可购得的马立克氏病病毒疫苗(一些单价的HVT制剂除外)主要由马立克氏病病毒感染的活的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)组成。与使用马立克氏病病毒感染的完整的活的原代鸡细胞培养马立克氏病病毒以用于疫苗相关的重要的难题是：CEF细胞必需在液氮温度下保存，并通过注射施用才有效。以前，完整的活的细胞疫苗是必需的，因为在细胞培养物和被感染的鸟的大多数组织中，三种马立克氏病病毒的血清型与细胞非常相关。通过细胞与细胞直接的接触，很少或无需释放出无细胞的病毒即可在鸟中传播感染。仅在羽毛的滤泡上皮细胞(FFE)中产生了传染性的病毒颗粒，该颗粒对鸟-鸟之间的传播有作用(Calnek，B.W.，等人，Avian.Dis.，第14卷，pp.219-233(1970)；Witter，R.L.，等人，J.Natl.Cancer Inst.，第49卷，pp.1121-1130(1972)；Eidson，C.S.，等人，J.Natl.CancerInst.，第47卷，pp.113-120(1971))。

通过细胞培养可生产商用的无细胞马立克氏病病毒疫苗。然而，无细胞马立克氏病病毒疫苗的生产在很大程度上被局限于仅使用血清型3马立克氏病病毒生产的疫苗，这是因为只有血清型3马立克氏病病毒能产生足够量的游离的病毒颗粒以生产马立克氏病病毒疫苗。有人提出病毒糖蛋白D(gD)基因表达的缺乏可能与限制无细胞病毒颗粒的释放有关(PCT专利申请WO95/29248(1995公布)；Tan，X.和Velicer，L.F.，第18届国际疱疹病毒专题研讨会A，145(文摘)(1993))。

除了CEF以外，还使用了其它的原代禽类细胞以培养马立克氏病病毒，所述细胞包括鸡肾(CK)和鸭胚成纤维细胞(DEF)。只描述了两个连续传代的禽类细胞系能培养某些马立克氏病病毒血清型。血清型3马立克氏病病毒(马立克氏病病毒-3)能在经化学转化的被称为QT35的鹌鹑细胞系上生长(Niikura，M.，Narita，T.等人，J.Vet.Med.Sci.，第53卷，pp.439-446(1991))。已报道经化学转化的被称为CHCC-OU2的CEF细胞系(Ogura，H.和Fujiwara，T.，Acta Med.Okayama，第41卷，pp.141-143(1987))可支持马立克氏病病毒-1的生长(Abujoub，A.和Coussens，P.M.，病毒学，第214卷，pp.541-549(1985))。

其它已知的生产马立克氏病病毒的方法包括使用致肿瘤的或致癌的细胞系。被马立克氏病病毒转化的类淋巴母细胞系(Nazerian，K.AvianPathol.第16卷，pp.527-544(1987))衍生自致癌性马立克氏病病毒-1感染的鸡体内的淋巴肿瘤。在这些细胞中，病毒基因组以潜伏或半潜伏的状态维持，以使对共同培养的CEF细胞或DEF细胞的感染传播以低频率发生(如果有的话)。另外，这些类淋巴母细胞系可以抵抗其它马立克氏病病毒的超感染。而且，仍未阐明被马立克氏病病毒转化的类淋巴母细胞系在生产非重组的(常规的)马立克氏病病毒疫苗或制备重组的马立克氏病病毒或遗传上有所改变的马立克氏病病毒或载体中的应用。

类似地，由于逆转录病毒的排出、类淋巴母细胞不好的生长特性、和生产性马立克氏病病毒感染的低水平，使得衍生自致癌的禽类逆转录病毒(禽类白血病病毒和网状内皮组织增殖病毒)的类淋巴母细胞系(Nazerian，K.，Avian Pathol.，第16卷，pp.527-544(1987))不能用于生产商用的马立克氏病病毒疫苗或生产重组的马立克氏病病毒。

哺乳动物的原代细胞和哺乳动物细胞系从未被描述可用作培养任何血清型的马立克氏病病毒的适当的基质，任何哺乳动物也未被阐明能被马立克氏病病毒生产性地感染。

图1描述了马立克氏病病毒-1的gH基因插入pCR3.1载体的图谱中。

图2是pGreen Lantern 2质粒的图谱。

图3描述了马立克氏病病毒gH转染的NLFK 3 G4细胞的逆转录酶PCR分析。

一方面，本发明涉及生产MDV的方法，所述方法包括：

(a)用MDV感染或转染连续传代的哺乳动物细胞系；和

(b)培养被MDV感染或转染的连续传代的哺乳动物细胞系。MDV可以是含有马立克氏病病毒核酸序列或其片段的非重组分子，含有马立克氏病病毒核酸序列或其片段的重组分子，含有MDV核酸序列和至少一种插入MDV核酸序列中的异源基因或其片段的重组分子，和含有已缺失了一个或多个基因，调控的遗传因子或其片段的MDV核酸序列的重组分子。例如，缺失的基因可以是复制所必需的一个基因，更具体地说，缺失的基因可以是马立克氏病病毒的gH基因或其片段。

MDV可选自血清型1、血清型2和血清型3中的任何一个，或它们的任何组合。

另一方面，本发明涉及的上述方法中，MDV是用于制备能诱导抗禽类疾病之保护作用的疫苗的病毒。

优选地，用于上述方法中的连续传代的哺乳动物细胞系是被MDV的Md5株感染的猫肾细胞系，如细胞系ATCC No ATCC-CRL 12336。其它适当的毒株的例子包括MDV-1的584A和652株。

本发明的另一方面是被MDV感染或转染的连续传代的哺乳动物细胞系。MDV可以是含有马立克氏病病毒核酸序列或其片段的非重组分子，含有马立克氏病病毒核酸序列或其片段的重组分子，含有MDV核酸序列和至少一种插入MDV核酸序列中的异源基因或其片段的重组分子，和含有已缺失了一个或多个基因、调控的遗传因子或其片段的MDV核酸序列的重组分子。例如，细胞系中可以缺失复制所必需的基因，更具体地说，细胞系中可以缺失gH基因或其片段。

优选地，连续传代的哺乳动物细胞系是被MDV的Md5株感染的猫肾细胞系，如细胞系ATCC No ATCC-CRL 12336。其它适当的毒株的例子包括MDV-1的584A和652株。

MDV可选自血清型1，血清型2和血清型3中的任何一个，或它们的任何组合。

本发明的另一方面，MDV是用于制备能诱导抗禽类疾病之保护作用的疫苗的病毒。

本发明的另一方面是生产MDV疫苗的方法，所述方法包括培养被MDV感染或转染的连续传代的哺乳动物细胞系，并从中收获细胞培养物成分。

本发明的另一方面是生产被MDV感染的连续传代的哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括：

(a)培养被MDV感染的连续传代的哺乳动物细胞；和

(b)增殖被MDV感染或转染的哺乳动物细胞以生产细胞系。

本发明的另一方面是含有由上述方法生产的MDV的疫苗。MDV可以是含有马立克氏病病毒核酸序列或其片段的非重组分子，含有马立克氏病病毒核酸序列或其片段的重组分子，含有MDV核酸序列和至少一种插入MDV核酸序列中的异源基因或其片段的重组分子，和含有已缺失了一个或多个基因，调控的遗传因子或其片段的MDV核酸序列的重组分子。例如，MDV中可以缺失复制所必需的基因，更具体地说，MDV中可以缺失gH基因或其片段。

优选地，使用连续传代的哺乳动物细胞系制备疫苗，所述细胞系是被MDV的Md5株感染的猫肾细胞系，如细胞系ATCC No ATCC-CRL12336。其它适当的毒株的例子包括MDV-1的584A和652株。

疫苗可由选自血清型1，血清型2和血清型3中的任何一个，或它们的任何组合的MDV组成。优选使用被马立克氏病病毒感染或转染的猫肾细胞系生产疫苗。

本发明的另一方面是使用上述方法生产的重组的MDV。重组的MDV可含有例如其中已缺失了一个或多个基因如病毒复制所必需的基因的天然MDV的核酸序列。这种必需基因的例子是MDV基因组的糖蛋白H(gH)基因或其片段。所得缺损(复制缺陷型的)病毒对于单循环而言是感染性的，只要存在用于增殖该缺损细胞的互补细胞，该互补细胞经基因工程改造含有病毒复制、继而是缺损基因表达产物所必需的基因。缺损病毒的生产和它们作为疫苗的用途被描述于PCT申请GB91/01632(公开号为WO92/05263)中(全文被列入本文作为参考)。

本发明的另一方面是含有经基因工程改造的哺乳动物细胞系的细胞系，所述细胞系可表达天然MDV的复制所必需的基因，如gH，并能够复制缺损的MDV病毒。

本发明的另一方面是使用上述方法产生的MDV载体。MDV载体含有重组的MDV和一个或多个异源基因或其片段。任选MDV载体具有含SEQID NO：2所示核酸序列的3’侧翼区。也任选MDV载体具有含SEQ IDNO：1所示核酸序列的5’侧翼区。另外，MDV载体可以同时具有含SEQID NO：2所示核酸序列的3’侧翼区，和含SEQ ID NO：1所示核酸序列的5’侧翼区。

本发明的另一方面涉及通过给动物施用含有经上述方法生产的MDV的疫苗以保护动物抵抗疾病的方法，优选所述动物为禽类。

本发明提供了使用连续传代的哺乳动物细胞系生产非重组和重组的马立克氏病病毒(MDV)的方法，生产经基因工程改造的MDV和MDV载体的方法，被MDV感染或转染的连续传代的哺乳动物细胞系，以及使用这种方法生产的能保护动物抵抗由MDV和/或其它致病剂所致疾病的疫苗。本发明还提供了给动物施用MDV疫苗和由MDV载体生产的疫苗以获得抗MDV感染的保护作用的方法。

“MDV”指的是编码马立克氏病病毒基因组的核酸序列或其任何片段(一个或多个)。MDV包括例如天然马立克氏病病毒(非重组的马立克氏病病毒)或其任何片段，重组产生的马立克氏病病毒(重组的马立克氏病病毒)或其任何片段，经基因工程改造或改变的马立克氏病病毒或其任何片段的基因组。非重组的马立克氏病病毒，重组的马立克氏病病毒，或经基因工程改造或改变的马立克氏病病毒的核酸序列片段可包括一个或多个马立克氏病病毒基因或其部分，优选这种片段编码能用作抗马立克氏病病毒之疫苗的马立克氏病病毒的抗原。

MDV可以是血清型1，2或3中的任一个或它们任何的组合，MDV还可以是血清型1，2或3中任一个或它们任何组合的菌株组合。

应理解MDV包括例如对马立克氏病病毒核酸序列的取代、插入、倒位、增加和缺失及其任何的组合，如马立克氏病病毒的缺失突变体和其中缺失了马立克氏病病毒基因组的非必需区(如非必需基因)或缺失了马立克氏病病毒基因组的必需区的马立克氏病病毒。这种变异可以是自然发生的，或者可使用常规的重组技术进行基因工程改造以产生这种变异。重组的马立克氏病病毒或其片段，经基因工程改造或改变的马立克氏病病毒或其片段和天然马立克氏病病毒的重组变体的产生和操作是本领域技术人员熟知的技术，可根据文献中所述的重组技术进行，所述文献例如为Maniatis等人，1989，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约；Ausubel等人，1989，最新分子生物学实验方法，Greene PublishingAssociates & Wiley Interscience，NY；Sambrook等人，1989，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约；Innis等人(编辑)，1995，PCR策略，Academic Press，Inc.，San Diego；和Erlich(编辑)，1992，PCR技术学，牛津大学出版，纽约，上述所用文献都列入本文作为参考。

已知可使用重组技术制备多种重组马立克氏病病毒和马立克氏病病毒载体，例如，1993年7月27日公开的美国专利5,231,023描述了通过将异源基因插入马立克氏病病毒DNA基因组的非必需区制备出的马立克氏病病毒载体。

缺失了必需基因的MDV的例子是复制缺陷型的马立克氏病病毒，复制缺陷型的MDV的具体例子是使用重组技术缺失了gH基因的马立克氏病病毒基因组。

应理解MDV也包括含有异源基因(一个或多个)的重组马立克氏病病毒，所述异源基因掺入位于马立克氏病病毒基因组核酸序列内的插入区。优选异源基因编码其它致病剂，如禽类致病剂的抗原。制备含有异源基因的重组马立克氏病病毒的方法是本领域技术人员熟知的技术，可根据Maniatis等人和上述其它文献中所述的重组技术进行。

“感染”或“转染”指的是病毒DNA或其片段转移到哺乳动物细胞中。基因转移到哺乳动物细胞中的方法是本领域技术人员熟知的技术，例见Watson等人，重组DNA，第2版，W.H.Freeman and Company，N.Y.，(1992)。

“MDV载体”指的是含有适当的调控序列的表达系统，所述调控序列是表达一个或多个功能性多肽(如抗原)所必需的且是由载体编码的，所述表达系统含有MDV(如非重组的马立克氏病病毒或其任何片段，重组的马立克氏病病毒或其任何片段，或经基因工程改造或改变的马立克氏病病毒或其任何片段的基因组)，并含有一个或多个异源基因(与马立克氏病病毒非天然相关的基因)，在本发明的连续传代的哺乳动物细胞系中能表达所述异源基因，或使用本发明的方法也能产生所述异源基因。例如，MDV载体可含有重组的马立克氏病病毒的核酸序列和一个或多个编码其它致病剂(如禽类致病剂)之抗原的异源基因。使用本领域技术人员熟知的重组技术插入MDV载体中的异源基因能在本发明的连续传代的哺乳动物细胞系中表达，一旦将它施用于动物(如禽类)，即可引发动物对重组的马立克氏病病毒和异源基因表达产物或多肽(如抗原)的反应。异源基因应与适当的和起作用的启动子连接以使MDV载体能表达异源基因。启动子可以是在被重组MDV载体感染的细胞中能引导转录的任何真核生物、原核生物或病毒的启动子。启动子的制备和使用是已知的，可根据Maniatis等人和上述其它文献中所述的重组技术进行。

或者，MDV载体可以缺失复制所必需的马立克氏病病毒基因，即它可以是有复制缺陷型的，并另外含有一个或多个编码其它致病剂(如禽类致病剂)之抗原的异源基因。使用Maniatis等人和上述其它文献中所述的已知的重组技术可制备这种重组的MDV载体。

应理解本发明提供了生产多价疫苗的方法，所述疫苗可以保护动物使之抵抗由马立克氏病病毒以及另外的致病剂引起的感染。

“连续传代的细胞系”指的是可在体外维持至少50次细胞传代，优选15-20次细胞传代的无限增殖化细胞。

本发明包含通过感染和培养能生产MDV或用于生产MDV载体的连续传代的哺乳动物细胞系以及亚克隆自或衍生自这种连续传代的哺乳动物细胞系的细胞系(如猫肾细胞系)以生产MDV和MDV载体的方法。使用本领域技术人员熟知的分离技术可分离在这种细胞系中生产的MDV。

本发明也包含被MDV或MDV载体感染的连续传代的哺乳动物细胞系。用于MDV感染或转染的哺乳动物细胞系的特征在于它是不含哺乳动物病毒和禽病毒的连续传代的细胞系。优选哺乳动物细胞系是肾细胞系，可使用如Celis，Julio编的，《细胞生物学，实验室手册》Academic Press，N.Y.(1994)所述的已知哺乳动物细胞培养技术培养和维持肾细胞系。哺乳动物细胞的不同培养条件，包括有关具体的营养成分、氧张力、CO₂和减少血清可由本领域技术人员选择和最优化。

优选的供MDV感染或转染的哺乳动物肾细胞系是猫肾细胞系。任何猫肾细胞系都可用于实施本发明的方法，例如被称为CRFK，保藏于美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland)保藏号为ATCC CCL-94的猫肾细胞系。优选的细胞系是被称为NordenLaboratories Feline Kidney(NLFK)的猫肾细胞系(Pfizer Inc.)，1997年4月8日被保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC CCL-12336，及其任何克隆。ATCC CCL-12336细胞系是被马立克氏病病毒的Md5株感染的猫肾细胞系，Md5株得自美国典型培养物保藏中心，其保藏号为ATCC VR987。

使用本领域技术人员熟知的已知的哺乳动物细胞培养技术可以克隆用于本发明的哺乳动物细胞系，优选猫肾细胞系。在适于增殖哺乳动物细胞的已知条件下，使用几种可购得的培养基由单个细胞培养和繁殖细胞。

例如，将冷冻待用的猫肾细胞如NLFK细胞加温至约37℃-约38.5℃，并在其中加入含有2％胎牛血清(FBS)的适当生长培养基，如OptiMEM(Life Technologies Inc.)。在含有约5％CO₂的潮湿的保温箱内，以约37℃-约38.5℃的温度保温细胞直至铺满。为使细胞传代，除去培养基并在细胞中加入0.05％胰蛋白酶和0.53mM的EDTA，使细胞脱附并将细胞悬浮液收集到离心管中，离心得到细胞沉淀物。除去胰蛋白酶溶液，将细胞沉淀物重新悬浮于新鲜的生长培养基中，然后在另外的培养容器中进一步地增殖细胞以达到所需的密度。

通过与MDV感染的细胞共培养可发生感染或转染，其中MDV是非重组的、重组的、经基因工程改造的MDV、或是MDV载体。用于共培养的细胞可以是被MDV感染的细胞，如CEF细胞或DEF细胞、类淋巴母细胞、外周血单核细胞、CHCC-OU2细胞、QT35细胞和猫肾细胞的克隆，如实施例中所述的3G4克隆。或者，通过使用本领域技术人员熟知的方法，如磷酸钙共沉淀、DEAE葡聚糖、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、脂转染和电穿孔法，将纯化的MDV DNA或得自被MDV感染的细胞的DNA导入哺乳动物细胞系中，即可使哺乳动物细胞系被MDV感染。优选使用被MDV感染的DEF或CEF细胞感染本发明的连续传代的哺乳动物细胞系。MDV感染的CEF、DEF、类淋巴母细胞、外周血单核细胞、CHCC-OU2细胞和QT35细胞的培养是本领域技术人员熟知的技术。

例如，通过使细胞生长至约50％-约80％铺满，优选生长至80％铺满，并向这种半铺满细胞中加入MDV感染的DEF细胞，即可使猫肾细胞被MDV感染。在约37℃-约38.5℃的温度下保温细胞约48小时，除去生长培养基，并以新鲜培养基取代之，然后在约37℃-约38.5℃的温度下保温细胞约48-72小时，优选保温48小时。除去培养基并用含有2％FBS的培养基取代之，将细胞至少保温24小时。然后通过上述的胰蛋白酶消化使细胞裂解，通过使用MDV特异性抗体的间接荧光抗体(IFA)监测被感染的细胞，使用已知的单克隆抗体杂交瘤技术(Goding，James，W.，单克隆抗体：原理和操作，第2版，Academic Press(1986)；Harlow，E等人，抗体，实验室手册，冷泉港实验室(1988))可产生MDV特异性抗体。然后储存被MDV感染的细胞的冷冻储存液直至使用。

本发明还涉及生产含有MDV的疫苗的方法，所述MDV是通过感染连续传代的哺乳动物细胞系，如猫肾细胞系，并培养被感染的细胞系以产生能用于抗MDV之疫苗的抗原而产生的。被MDV感染的细胞可用作抗MDV的疫苗，或者分离自细胞的无细胞MDV可用作疫苗。

本发明还涉及生产含有MDV的疫苗的方法，所述MDV是通过用MDV载体转染或感染连续传代的哺乳动物细胞系，如猫肾细胞系而产生的，所述MDV载体中含有MDV和一个或多个异源蛋白质或多肽的基因，所述MDV载体除了能表达MDV外，还可表达异源基因，因此所述疫苗除了能用于抗MDV外，还能用于抗其他禽病的致病剂。

另外，本发明还涉及生产疫苗的方法，所述疫苗是通过用MDV载体转染连续传代的哺乳动物细胞系而产生的，所述MDV载体中含有复制缺陷型的MDV和一个或多个异源蛋白质或多肽的基因或其部分，所述MDV载体除了能表达MDV外，还可表达异源基因，因此所述疫苗除了能用于抗MDV外，还能用于抗其他禽病的致病剂。

能用于生产疫苗，并能使用本发明方法产生的其它禽病致病剂的例子包括新城疫病毒(NDV)，传染性的囊病病毒(IBDV)，传染性支气管炎病毒(IBV)，鸡贫血病毒(CAV)，传染性喉气管炎病毒(ILTV)，禽白血病病毒(ALV)，网状内皮组织增殖病毒(REV)和禽流感病毒(AIV)。

使用本发明方法生产的含有并表达一个或多个不同的外源蛋白质或多肽的MDV可用作单价或多价疫苗。通过疫苗制备领域的技术人员熟知的方法可制备这种疫苗。

本发明进一步地包含给动物施用MDV疫苗和用MDV载体产生的疫苗以保护动物抗MDV感染的方法，表达MDV和/或一个或多个外源的禽病致病剂(如病原体)蛋白质或多肽的MDV可被用于接种对这种致病剂易感的动物，如鸡和火鸡。用MDV或使用本发明方法生产的其它抗原接种可导致保护性的免疫应答，以使被接种的动物受到保护，能抵抗那些致病剂随后的感染。

下列实施例将进一步地阐明而不是限制本发明。实施例1未感染的连续传代的猫肾细胞系的增殖

在96孔组织培养板内，通过终点稀释从亲代NLFK细胞中衍生出14个克隆细胞系，在单细胞的孔中扩充细胞，几次传代后，冷冻得自每个克隆的细胞并储存于-70℃中。在添加了3％胎牛血清(FBS)和22.5μg/ml庆大霉素的OptiMEM中增殖所有的猫肾细胞，如下列实施例所述，将NLFK细胞的单层维持在FBS浓度有所改变的OptiMEM中。实施例2NLFK细胞单层和新鲜接种的培养物的感染

用MDV血清型1的Md5株接种24孔组织培养板内的DEF或未克隆的NLFK细胞的培养物，按Solomon，J.J.，Tissue Culture Association，第1卷，pp.7-11(1975)的描述进行DEF细胞的制备和增殖，胚胎化的鸭蛋得自康奈尔大学。

通过使用针对糖蛋白B(1AN86)或磷蛋白38(H19)的MDV特异性单克隆抗体(Silva，R.F.和Lee，L.F.，病毒学，第36卷，pp.307-320(1984))的间接荧光抗体(IFA)试验检测病毒，这些抗体是USDA禽病和癌症学实验室(East Lansing，MI)的Lucy Lee博士所馈赠的。简单地说，用80％丙酮固定需检测的细胞，将所述细胞与一种或两种单克隆抗体一起保温，洗涤并与抗-小鼠FITC缀合物(Kirkegaard & PerryLaboratories)一起保温，用UV显微镜检查染色的细胞制品，通过特征性的FITC荧光标示出阳性细胞。

对于阳性对照而言，MDV种子由被感染的DEF细胞组成，当被IFA染色时，其中约一半细胞是表达MDV抗原的。种子被稀释成大约100个IFA阳性细胞/孔。用IFA周期性地染色双份试验孔以显示MDV感染的存在。不是所有含有NLFK细胞的孔都能显示出复制性MDV的存在，总数为48的孔中只有3个通过IFA显示出MDV的生长。此实验所用的MDV感染的DEF接种物的稀释导致单细胞均匀地分布于24孔培养板的底部，所述培养板中不含预先存在的细胞单层。因此，多细胞荧光小块的存在显示出猫细胞中病毒的复制。

进行研究以测定MDV的复制是在新鲜接种的细胞中更好，还是在铺满单层的细胞中更好。单层培养物在感染前已被培养4天，而新鲜接种的细胞在感染前已被接种约4小时。在6孔培养板中，被MDV感染的DEF接种物含有大约3000个IFA阳性细胞/孔，作为对照，在几个孔中只加入接种物，通过IFA染色周期性地监测细胞中MDV抗原的存在。在接种后5天，12个孔被胰蛋白酶消化并用于接种75cm²培养瓶和另一个24孔培养板，5天后，在75cm²培养瓶和24孔培养板的一半孔中重新补充新鲜培养基，通过在最初传代后的第4天和第12天用IFA染色来监测24孔培养板中MDV抗原的存在。在培养基改变后2天(传代后7天)，将75cm²培养瓶内的细胞传代至24孔培养板中，5天后，通过IFA染色监测这些细胞。

在NLFK细胞单层或新鲜接种的细胞上，MDV复制的能力差别很小。另外，此实验阐明了在缺少NLFK细胞时，DEF细胞的MDV感染减少，并通过第3次传代消失。在存在NLFK细胞时，MDV感染可以维持，并在被感染细胞的传代过程中被增强。这一研究支持下列的看法，即通过在感染过程中改变培养基可增强NLFK细胞中MDV的复制。当在传代后的第5天改变培养基时，荧光灶的数目和大小都有所增加。实施例3克隆自NLFK细胞系的猫肾细胞的感染

评价衍生自NLFK细胞系的15个猫细胞克隆支持MDV的Md5株生长的能力，克隆在75cm²培养瓶内生长，在每个培养瓶中加入1ml含有约5000个阳性IFA细胞的被MDV感染的DEF细胞悬浮液，作为对照，也接种含有亲代NLFK细胞系或不含细胞的培养瓶。7天后，将培养瓶中的细胞传代至另外的75cm²培养瓶和24孔培养板中。通过IFA染色周期性地监测24孔培养板以显示出NLFK细胞中MDV抗原的存在。6天后，用新鲜培养基重新补充培养瓶。鉴于IFA染色的结果，选择4个显示出最活跃的MDV复制的克隆以传代至下一水平。8个克隆显示出很少或没有MDV的传播，而剩下的3个细胞克隆显示出中间结果。改变培养基2天后，用胰蛋白酶消化这些培养瓶中的细胞，将所述细胞接种于两个75cm²培养瓶和另外的24孔培养板中。通过IFA染色周期性地监测上述75cm²培养瓶和24孔培养板以显示出MDV的存在。

这些结果表明未克隆的NLFK细胞最初仅表明少数几个阳性孔的原因是NLFK细胞的亚群能支持MDV的复制。尽管在某种程度上，几个克隆似乎能支持MDV的生长，但4个克隆表明在这些实验所用的条件下，MDV复制良好。这些克隆是3G4，9，7和KKCL6。4个克隆中最好的是克隆3G4和9，选择它们以进一步地传代。还应注意的是通过第一次传代使DEF细胞接种物失去了MDV感染。如上所述，在保温过程中改变培养基可增强MDV感染的传播。实施例4被MDV感染的猫肾细胞储存液的制备

几次另外的传代后，得到NLFK克隆3G4和9的培养物，经IFA测定，其中几乎所有的细胞都表达gB和pp38抗原。这些培养物未显示出在被感染的DEF培养物中观察到的典型的MDV引起的CPE。

由第5和6代制备冷冻的细胞储存液，将这些储存液用作种子储存液以进行下述的体内实验。实施例5用被MDV感染的NLFK细胞和MDV病毒接种鸡

使用得自Hy-Vac的无特异性病原体的鸡(RF1-5系)进行体内实验。此研究中使用的猫细胞系得自Pfizer Animal Heath，Lincoln，为Norden Laboratories Feline Kidney(NLFK)细胞。在96孔组织培养板中，通过终点稀释从原始的NLFK细胞系衍生出15个克隆的细胞系，在研究中使用了2个NLFK细胞克隆，它们被称为克隆3G4和克隆9。CHCC-OU2细胞(Ogura，H.和Fujiwara，T.，Acta Med.Okayama，第41卷，pp.141-143(1987))由Douglas N.Foster博士(明尼苏达大学)提供。强毒力MDV毒株Md5(Witter，R.L.等人，Avian Res.，第24卷，pp.210-232(1980))购自美国典型培养物保藏中心(ATCC VR-987)，并在细胞培养至第11代水平时用于此研究中。

3天龄的6组小鸡(每组10只)被腹膜内接种(1)未感染的NLFK克隆3G4和NLFK克隆9细胞的混合物(细胞对照)，(2)被Md5感染的DEF细胞(阳性对照)，(3)被Md5感染的OU2细胞，(4)被Md5感染的NLFK克隆3G4细胞，(5)被Md5感染的NLFK克隆9细胞，剩下的第6组是未接种的阴性对照。给每只鸡接种500-2000 TCID₅₀的MDV，感染后6-8天，使用TCID₅₀法在用80％丙酮固定并通过上述的IFA检查的DEF继代细胞的单层上测定病毒的滴度。

在含有5％CO₂的潮湿的保温箱内，在添加了庆大霉素和适当量的胎牛血清(0-5％)的OptiMEM(Life Technologies)中，以38.5℃的温度培养感染或未感染的细胞。

如果鸡在研究过程中死亡，则对鸡进行尸检并检查MDV感染的体征，收集存活鸡的肾脏、脾脏、肝脏和脑以用于组织学评价。在接种后第14天采血以从外周血淋巴细胞(浅黄层)中分离病毒并铺于DEF细胞单层上。

注射Md5感染的细胞的所有鸡(第2-5组)显示出被强毒力的MDV感染的典型体征，这些鸡中的大多数死于MD，阴性对照组和细胞对照组在实验的过程中(8周龄)没有显示出MD的体征，结果示于表1。表1MDV-1(Md5株)攻击后的几周内存活的鸡的数目(百分比)

      组   第1周   第2周   第3周    第4周   第5周   第6周   第7周    第8周    第9周1(未感染的3G4和克隆9细胞)    10/10(100％)    10/10(100％)   10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)  2(被感染的DEF细胞)    10/10(100％)    9/10(90％)    9/10(90％)    9/10(90％)    8/10(80％)    6/10(60％)    5/10(50％)    2/10(20％)    1/10(10％)  3(被感染的OU2细胞)    17/17(100％)    17/17(100％)    17/17(100％)    17/17(100％)    17/17(100％)    17/17(100％)    12/17(71％)    10/17(59％)    9/17(53％)  4(被感染的3G4细胞)    8/8(100％)    8/8(100％)    8/8(100％)     8/8(100％)    5/8(62.5％)    3/8(37.5％)    2/8(25％)    1/8(12.5％)    1/8(12.5％) 5(被感染克隆9细胞)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    6/10(60％)    4/10(40％)    4/10(40％)    3/10(30％)  6(未接种的阴性对照)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)    10/10(100％)

组织(肾脏，脾脏，肝脏，心脏和脑)的组织病理学评价显示出被感染组的存活鸡中与马立克氏病一致的损害，在细胞对照组或阴性对照组的鸡中未观察到这种损害。

为了重新分离病毒，在接种后第14天，通过翅膀静脉穿刺从每只鸡中收集0.5-2ml鸡血，置于肝素化的试管中。集中并离心得自每个实验组的血，从每只试管中取去浅黄层的细胞并用于接种DEF单层，在接种后4天，用80％的丙酮固定细胞并为IFA制备细胞。通过IFA发现细胞对照组和阴性对照组中的MDV为阴性，通过IFA发现阳性对照，OU2，NLFK克隆3G4和NLFK克隆9组中的MDV为阳性。实施例6

被称为652和584A的另外两个MDV-1分离物适于生长于NLFK细胞的3G4克隆中，这些分离物比Md5分离物更新并更具毒力(Witter，R.L，Avian Dis.，第41卷，pp.149-163(1997))。使这些分离物生长于3G4细胞中的方法与实施例3中所述的使分离物Md5生长于NLFK细胞的多个克隆中的方法基本上相同。实施例7制备表达MDV gH的NLFK3G4细胞系制备PCR3.1gH构建体

通过聚合酶链反应(PCR)分离马立克氏病病毒Md5株的2.6kb的糖蛋白H(gH)基因，通过使用可购得的PCR试剂系统(GIBCO-Life Technologies，cat.No.10198-018)，使用上游PCR引物5’-GGGGGTACCA AGTTG CATTG GATGG CTACA TA-3’和下游PCR引物5’-GGGGC TAGCT TAAAG ATCGT CGTAC AGGCT CAA-3’进行聚合酶链式反应(PCR)将上述基因克隆到pCR2 TA克隆(TA克隆载体，得自Invitrogen Inc.，U.S.A.，目录号K2000-1)中。使用已知技术测定gH基因的序列，gH基因的序列描述于Scott等人，病毒遗传学杂志，第74卷，pp.1185-1190(1993)中。

然后利用多克隆位点中的KpnI和XhoI位点(见图1)将MDV gH基因亚克隆至pCR3.1载体(得自Invitrogen Inc.，U.S.A.，目录号K3000-01)中。载体pCR3.1是真核表达载体，它含有巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子以有效地进行哺乳动物表达，还含有新霉素抗性基因以选择含有载体的阳性细胞。载体pCR3.1的特征在于：CMV启动子碱基1-596；推定的转录起始碱基520-625；T7启动子/引发位点碱基638-657；多克隆位点碱基670-785；pCR3.1反向引发位点碱基797-815；BGH聚腺苷酸化位点碱基796-1010；ColE1起始碱基1100-1773；SV40启动子和起始碱基3178-3515；新霉素/卡那霉素抗性基因(ORF)碱基2355-3143；胸苷激酶聚腺苷酸化位点碱基1910-2180；氨苄西林抗性基因(ORF)碱基3595-4455和fl起始碱基4586-5042。通过使用已知技术的序列分析和限制性分析进一步地证实构建体。构建体通过使用体外转录/翻译系统(得自Promega，U.S.A.，TnT T7系统目录号L1170)可表达约90kDa的预期大小的蛋白质。NLFK 3G4 MDV gH稳定转染子的产生

使用脂质体试剂(得自Qiagen，U.S.A.，SuperFect目录号301305)，通过脂转染法将构建体pCR3.1gH导入NLFK 3G4细胞。使用300μg/mlG418(得自Gibco BRL，U.S.A.，目录号10131-019)选择性培养基(得自Optimem I Gibco BRL，U.S.A.，目录号11058-021)和1％胎牛血清(得自Gibco BRL，U.S.A.，目录号16000-036)产生稳定转染子库。被转染的细胞表达了新霉素抗性基因，它不会受到对NLFK 3G4细胞有毒性的G418的影响。使用Biotex Ultraspec RNA分离系统(目录号BL-10050)从G418抗性细胞库中分离总RNA。通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)(使用得自Gibco BRL，U.S.A.，目录号为18089-018的SuperScript预扩增系统和得自Gibco BRL，U.S.A.，目录号为10198-018的PCR试剂系统)检测库中的总RNA(每个样品1μg)，并发现总RNA显示出MDVgH mRNA表达阳性。通过有限稀释得到单细胞克隆，在G418选择性培养基(如上所述)中扩充后，分离得自克隆细胞的总RNA，如上所述通过RT-PCR(见图3)检测之。由所得的RT-PCR阳性克隆细胞制备冷冻的细胞储存液。根据图2，通过RT-PCR检测1μg总RNA，在加入(+RT)和不加入逆转录酶(-RT)的匹配对中检测样品。还包括阴性对照，检测时含有所有试剂但不含RNA模板以证实试剂未受到损害。在所示的4个克隆中(1C，1E，3A和3C)，+RT泳道中扩增了865bp的gH片段。对于每个样品而言，-RT泳道是阴性的，显示出阳性信号来自MDV gH的mRNA而不是污染的DNA。实施例8重组MDV载体的产生

制备具有可检测标记物的质粒构建体。标记物基因被gH基因中可用于同源重组的5’和3’侧翼区所包围。通过PCR(上游PCR引物：5’-GGGATGCATT ACGGT CTCTG AACAA G-3’，下游PCR引物：5’-GGGATGCATA AGGAC GCCA ATTAC TATCT-3’)克隆MDV-1 gH的5’侧翼区，并将它插入得自GIBCO-Life Technologies，U.S.A的pGreenLanern-2质粒(见图2)的经平端处理的NsiI位点(如下所述)。MDV-1 gH的5’侧翼区得自美国的GeneBank，它在位置894-1925处含有TK基因。pGreenLanern-2质粒具有编码水母绿荧光蛋白(gfp)的基因，在产生gH缺失的重组病毒的方法中，所述蛋白可用作标记蛋白。用T4聚合酶处理pGreenLanern-2中绿色荧光蛋白基因的CMV启动子上游的NsiI位点以产生平端，从而与含有Pme1末端的5’gH侧翼区连接。

质粒得自Tampa Bay Research Institute Fl，U.S.A.的MeihanNonoyama博士，该质粒含有MDV-1 BamHI片段“F”，此片段中包括gH的3’侧翼区(Fukuchi等人，病毒学杂志，102-109(1984))。约2.4kb区域(本文中指称为“3’侧翼区”)的DNA序列示于SEQ ID NO：2。通过PCR克隆(上游引物：5’-AAGAT TTTTC CCAAG TCC-3’，下游引物：5’-TCGTC GAATA ATGTG ATC-3’)得到MDV-1 gH的3’侧翼区，并将此区域克隆到在NsiI位点已插入MDV-1的5’侧翼区的上述pGreenLanern-2质粒。3’侧翼区被插入整个绿色荧光蛋白基因下游的NaeI位点。

将具有被MDV-1 gH的5’和3’侧翼区侧接的绿色荧光蛋白基因的质粒转染到被MDV-1感染的能产生gH的3G4细胞系中。在紫外光显微镜下选择绿色的病毒噬斑，并从亲代的MDV-1病毒中纯化之。所得的新的重组病毒缺失了gH基因，而由编码绿色荧光蛋白的基因取代了gH基因。

在从缺失gH基因的病毒中除去绿色荧光蛋白基因的第二次重组步骤中，可任选地插入得自除MDV以外的病毒的异源基因，如鸡干扰素基因，新城疫病毒或传染性的囊病病毒等，所述异源基因可取代绿色荧光蛋白基因。与亲代的绿色噬斑相比，出现了白色的病毒噬斑，该噬斑中含有新的重组MDV-1病毒，其中缺失了gH基因并除去了绿色荧光蛋白基因。序列表(1)一般性资料

(i)申请人：Pfizer Inc

(ii)发明题目：使用连续传代的哺乳动物细胞系制备马立克

              氏病病毒的方法

(iii)序列数目：2

(iv)联系地址：

  (A)联系人：Pfizer Inc

  (B)街道：235 East 42nd Street

  (C)城市：纽约

  (D)州：纽约

  (E)国家：美国

  (F)邮编：10017

(v)计算机的可读形式：

  (A)介质类型：软盘

  (B)计算机：IBM PC兼容机

  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

  (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25

(vi)本申请资料：

  (A)申请号：US 60/049,055

  (B)申请日：1997年6月10日

  (C)分类号：

(viii)代理/代理人资料：

  (A)姓名：Ling，Lorraine B.

  (B)登记号：35，251

  (C)参考号/文档号：PC9888

(ix)电信资料：

  (A)电话：212-573-2030

  (B)电传：212-309-4801(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特征：

(A)长度：2023个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(iii)假拟：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：1ACGGTCTCTG AACAAGACGG GCGATAATAT TAGCCATGTT TCGCATAGCC GTACCTCCCG  60TTCTCTCCTG ATTATTTGAA AATGATAAAG TAGCCGTTTT ATTACAAGCT ATATGATTCC  120TCAAATCCGT TACGTTAGCA GACGCCTTTC CACTGCGTCG TTGTATATGT ATCGTGTTTG  180TATTATGACG TTTTAAAATT TTATGAGTGT CAGTTATCCG TGCTTTATAG TCAGACGCGG  240TCGCCAATAT AGAGCATAGT CTATGAAAAT CAGTCACTAT GTGCCTTTTC TTTAGGCACA  300TCACATGTAG AACAGACAGT TTTCGTCTTG CTACAAATAC TAACATTGGA CAAATAACGA  360TACAATCTGA TCCTTGAGGC GCAATTTGCC CAATCAGAGA TTTGGAATCC AATAACTGCT  420TTATGCCGGT GAGTCTTTGT TCATGTTTAC TGCGTGTCTT CAGGTTACGA GAAAATTTGC  480AAGTTTTTAG TTCTAGAATG ACGCATACTC CATCACAGCC TACTTCCCAC AAATCACGAG  540GCAACTTAAA CATGCAAATA CAATCCGGTC TACGTCGTTC TAGGTTTACT TCGAAGACCA  600ATCGAAAATC CGTCAACTGT TTAAATACAT CTAATACCAT GACCTTCCCA AAAATTTTGG  660CAAAGCTTCT CCCCGGCCAA TCATACACCT GAGATCCTAG ACACATCGCT TCTGCATAAA  720GCCGTTTGTA AAAGCGATCG TGACATCGAA CACCAGCCGC TAAACGTCGC TTTCTAAGGA  780CATTCGTATT TACATGCCGT TTGAAATTTC GAGTGCTACT AACCTGTCTG CGATATCTTT  840TGAGTACGTT CTTCTCTCCC ATTGAACATG TCGGAGCCAC AATCGTGGTC GGTAATGGCA  900TCTCAGATGA CATCTGCACA GCTCATACGT GTATACCTCG ATGGATCAAT GGGTATAGGT  960AAAACGTCAA TGTTGAATGA GATACCGACG CACTCTTTAA TGGGAGTACC CGTACTAAAG  1020GTTTTCGAAC CTATGAAATA CTGGCGGTAT TATTTTACTG ATTTGGTCAC GACCGTAAAT  1080GATACATGTG ATCGTCGTCG CAGGGGAGAG TTTTCTTTAT TTCAATCTAG CATGATTGTA  1140ACAGCTTTAC AATCAAAGTT TGCAGATCCC TATCTTGTAT TTCATGAGCG CTTATCGTCG  1200AAGTGTCATC GCATAACAGG AACACGTGGC AATCCATCGC TTATATTAAT TCTAGATCGA  1260CATCCCATAT CCGCTACCGT ATGTTTTCCC ATTGCTCGAC ATTTAACTGG AGATTGTTCC  1320TTGGAGATGC TAATTAGTAT GATAATAAGG TTGCCCCAGG AACCGCCAGG ATGCAACTTG  1380GTGATTGTCG ATCTACATGA CGAAAAGGAG CATGTTAGCC GTCTATCTTC ACGGAATAGG  1440ACCGGCGAGA AAACAGATCT ACTAATGCTC AGGGCACTTA ATGCAGTGTA TTCCTGTTTA  1500GTAGACACTA TTATGTACGC AAATCATATT TGTCCCTACA GTAAGGATGA ATGGGAATCT  1560GAATGGTTGG ATCTACCATG GTTTGATACA TCTTTGGCCA CAACGTTTAT AAACGAACCT  1620CGTACTGATT ATCGCGGTAG TAGGGTGTCA TTACACCATA CGCTTTTAGC GATATTTAAG  1680CGGCGAGAAT TATGTGCCGA AGATGGTAGC TTATCAACAA CGCATGCATG GATATTGTGG  1740GGATTATTAA TGAAACTGCG GAACATTAAC GTCGAACGAT TTAATATTAC TGGCCTGTCC  1800ACAACAAAGT GTGTAGAATC GTTCATGGAT ACTATGTCGG AGAGATTGGT AACACATAGT  1860AGCTGGAATG ATGCCTTCGA GATTGAAGCT GATGTACTAG CCTATAATAA AGAGATGGCT  1920ATGTAAAACT ACCCATTCAT ATCGCGCTTC TATAATTAGC TTGCCCACAT CACAATGATG  1980CGGCAATATT GACTTATATT AAGATAGTAA TTTGGCGTCC TTA                    2023(2)SEQ ID NO：2的资料：(i)序列特征：

(A)长度：2236个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(iii)假拟：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：2 TAAATAAAGA ACTTTGGGAA TAACAAGCTA TGTATAGAAT TTATTTCGCG TGAAGATTTT  60TCCCAAGTCC GATCACATTT CAGGTATTAC AGCGGTAATA GATCCATGCA TTATGAGGGT  120TTGACGTATT ATCTCGATTA AGAACATATT GTAATACACC CACTGTTTCT CAAACGAGTG  1805TCTATCAATG ATATAATACA TTGATGTATC GACTATAATA CCCCCAATGT TCAAAGGCTG  240ATAAAACTGA TATATCTATG GCCGCGCATA GCAATTCTGC CGTATCTTCT CCCACCGATT  300CTCGTAACGC GACGTCTATG GGATCAATGT CTTTATATAG ACCGTCTAGA ATAAGAGCCA  360GTTTACGTAT CTTGAGGTCC TGTATAGATT TTGGTGCAGA TGTTTCTGCC ACATCCAATA  420AAGTAGTCTC GTCTGCAAAG GCTGATGGAC TAAGAACTCC ATGTTGCTCT TCCAATGAAG  480AAGTCCAGTT CACAACTAAT TTCAGTAACC ATGCCAAGAA ATAAAATCCT CTGAATAAAC  540TGTTTGTTTC TGCAAGACAA GTCGGCATGG AGTAGGCATT CCCCCTCAAT GGTAGAGGTA  600TGATGATCGC ACAACTCGCG AATTAAGTCA TAACAATTTG GCAGACGATT TAATATATGT  660ATATACTGAA GCAACAAAAA CTTCTGACTG GGCGATATAT TTTTGTTTTC TGGTCCAACT  720CCAACAAACA TGGATGCGTG TCTTCCAAAT AAAGCATTTG AAATCATCCC CAACTCACTT  780TGTATAATTT CCAGGTCGGA TTGAGATCCA TTCTCCGTAT AAGATTAGAA TTTAAATTGA  840GCATGTTCAT ATTAAAAACC GAGTCTACTT TCCAGAAGAT TTCCCATAAC TTATTTAGAG  900AAGTAGAGGG TATACAAGAG CTGGTATCGC AACTCCATAT CTTAAATACG GGTGGTATAT  960ATTTGATTTG TACCAAAGAA CTGAACCGAG CATGTTTTTT CCGTTGTACT GGATTTGTTT  1020GTTACTGTTC ACGTTCAATT TACCCCGGCT CCAGCCGTCA TATCCCATGC GCGTTGCACA  1080GTCGTCGTGT TTGCAGCTTT CTTTGCTGTA ACTATAACAT CGACTCGCCT GCCGAATATC  1140TCTGATGATA ATGCTTCTCT AGGAGTGGGA ATGCCATCAA ATAATCCTTC AACGAGGTCA  1200CTCAAAGACT TAGGTAATTC AGTCAATCTT GCACAAGTTA GCACAAATGC ATCACGACTG  1260CACTCATATA CTAAATCTGA ATATATGTCC GTGATTATAG GGAATTCGGG TATATGAATT  1320GTACGATCAT GTGGAAAATC GTATGCGGCC TGTATCGTTA ACCCAGAAAT TGCATTTGTC  1380GGTACCATAT ACTTTGCTAT ATCCGGATCA TACGTTTCCA GACAGAGAAG CCCACAAAGC  1440TCACGTTCAC TGCATATACC ATCACGACTT AACACAGCTA TACTATCGAT GAACAATTCA  1500TCTTCATCGG AAGAAAAAGC CCACTTCATA CCTCTGCGAA GTAATTCTCG GCGAACATGA  1560GCTGCCAATG GTTTGGACTG ACCACCACGT AGAACCAACC CAATTTTTGC GAGCTCTGGT  1620AATACCATCA TCTATACAGC CTGCCTACAG CAAAAAACAA CCGCCGCAAA AAAATACCTT  1680TATATCCCAT TCCGATACAT AAAACTGGAC ATTCTATAAC GAAAACATGT CCGTATTTAA  1740TATCCATTGA CTGTCCTCTC TGGACGTAAC CTATATCACT GTAGCGCAAA TCCAATCCTT  1800GATAACAGCA TTGCGTTAAT CACTGGGTGC ACGGATTAAC GTGTACGTAT TTACTGTCGC  1860GTCATATGAA CGACAATGAG CTTGGGTATG CAGCTCGTCA TTGAACGCCA TTTGTGGCAA  1920AGCAATAAGG GTCTCAGACC ATCACATTAT*TCGACGAATT GTACTACATA GGCCACCCCT  1980TGTTTAACTA TGTCAAGCAT GGATTTGGAT ACTATGTCAA CAGAAGCTAA TGAATATACC  2040ATCCCCCTCA TGAATTGATG ATGGACGATC GGATACATGC GAAAACTCTT GGGTCGTATT  2100GACCACTATC TGAGGAATTA GATTGGGATG ATATTATGCA CTTTCTCTTA TTTAGGCGAT  2160ATATTTTACA ATCCAACAGC TATGACATAC ATCCTCAAAT CACCCGTATG TTTACTCTTT  2220GGCTATCTAC TTTGTC                                                  2236