肉种鸡产蛋高峰期的马立克氏病鉴定及马立克氏病病毒标准抗原、标准血清的研制

摘要

鸡马立克氏病(Marek's disease，MD)由疱疹病毒科的马立克氏病病毒引起，1907年Josef Marek首次报道，主要引起各种脏器、皮肤的淋巴单核细胞浸润，通常于10-12周龄发病，可造成严重的经济损失。本研究以琼脂扩散试验，间接免疫荧光、病毒分离鉴定等方法，结合病理切片结果，在排除REV和ALV感染的基础上，对250日龄已免疫马立克疫苗肉种鸡鸡群中的肿瘤病原进行了鉴定。同时本研究参考OIE官方公布的MDV琼扩抗原制备方法，经改进制备出MDV标准抗原、标准血清，为MDV的诊断防治以及诊断试剂的标定提供了有效的方法和材料。
　　1.肉种鸡产蛋高峰期马立克氏病的鉴定
　　鸡马立克氏病通常于10-12周龄发病，由马立克氏病病毒引起。本研究以琼脂扩散试验，间接免疫荧光试验、病毒分离鉴定等方法，结合病理切片结果，在排除REV和ALV感染的基础上，诊断出250日龄已免疫马立克病疫苗肉种鸡鸡群的马立克氏病，并且成功分离到一株马立克氏病病毒，命名为MDV-AH1410。对其pp38、meq和gB基因进行PCR检测和序列分析，结果显示分离株与MDVⅠ型强毒及超强毒株的同源性为99.3％～100％，具有强毒特征。研究表明，鸡马立克氏病病毒不仅毒性在逐渐增强，而且鸡群发病的时间段也在延伸。
　　2.马立克氏病病毒标准抗原、标准血清的研制
　　选取MDV国际标准毒株RB1B作为候选毒株，用有限稀释法纯化病毒，将纯化好的病毒通过PCR的方法进行了纯异性分析，参考OIE公布的MDV琼扩抗原的制备方法经改进研制出MDV琼扩标准抗原，对其进行特异性分析以及琼扩效价测定。结果表明纯化的MDV-RB1B病毒无CAV、ALV、REV、EDS-76V、GPV、IBV、ILTV、IBDV等外源病毒，制得的琼扩抗原只与MDV阳性血清反应，与其他相关血清没有交叉反应，琼扩抗原效价为1∶4。用1日龄SPF鸡腹腔注射MDV-RB1B毒株2000PFU/羽，每周采血血分离血清进行抗体检测，待琼扩试验阳性后无菌采血，通过间接免疫荧光和血凝抑制等方法进行纯异性分析，同时检测其荧光效价和琼扩效价。间接免疫荧光试验结果显示该制得的抗MDV血清不与ALV、GPV、REV、IBV、IBDV、NDV、AIV、EDS-76V等外源病毒反应，只与MDV反应，荧光效价为1∶1600，琼扩抗体效价为1∶4。
　　制备的琼扩抗原加入1％的BSA，制备的多抗血清加入0.01％硫柳汞，分别冻干分装。按照中国兽药典进行无菌检验、支原体检验合格;检查分装差异系数CV值、物理性状、稳定性、均一性、保质期等均符合要求，最后获得了高质量的MDV标准抗原和标准血清，为MDV的诊断防治以及诊断试剂的标定提供了有效的方法和材料。

目录

摘要

符号说明

文献综述 综述一 马立克氏病的研究进展

1 病原学

1．1 病毒分类

1．2 形态结构及理化特性

1．3 抵抗力特性

1．4 基因组分析

1．5 本文相关的主要病毒编码蛋白

2 流行病学

3 临床症状

4 病理学变化

5 发病机理

5．1 早起溶细胞感染

5．2 潜伏感染期

5．3 二次溶细胞感染

5．4 转化期

6 实验室诊断技术

6．1 病毒分离

6．2 血清学试验

6．3 病理切片诊断

7 防制措施

7．1 综合防制

7．2 疫苗接种

7．3 免疫失败原因

8 兽用生物制品国家标准物质的研究现状

8．1 OIE马立克氏病病毒检测技术

8．2 标准物质的作用

8．3 我国兽用标准物质现状

研究一 肉种鸡产蛋高峰期的马立克氏病鉴定

1 材料与方法

1．1 发病鸡背景资料及流行病学调查

1．2 主要试剂

1．3 病料的采集

1．4 ALV和REV的排除

1．5 琼脂扩散试验

1．6 病理切片诊断

1．7 病毒分离

1．8 间接免疫荧光

1．9 PCR检测及相关序列分析

2 结果

2．1 发病鸡的组织病变

2．2 ALV和REV的排除

2．3 琼脂扩散试验

2．4 病理切片诊断

2．5 病毒分离

2．6 间接免疫荧光

2．7 PCR检测及相关序列分析

3 讨论与小结

研究二 马立克氏病病毒标准抗原、标准血清的研制

1 材料

1．1 生物材料

1．2 主要仪器

1．3 试剂

2 方法

2．1 马立克氏病病毒标准抗原的制备

2．2 马立克氏病病毒标准抗体的制备

2．3 标准物质属性的标定

2．4 商品化试剂盒的可用性检测

3 结果

3．1 成功研制出马立克氏病病毒抗原标准物质

3．2 成功研制出马立克氏病病毒标标准血清

3．3 标准物质属性的标定

3．4 商品化试剂盒的可用性检测

4 讨论与小结

全文总结

参考文献

致谢

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