一株奇异变形杆菌噬菌体RDP-SA-16033及其工业化生产工艺

摘要

本发明公开了一株奇异变形杆菌噬菌体RDP‑SA‑16033，其宿主为奇异变形杆菌S5，该噬菌体在双平板上能形成直径在4‑6mm的噬菌斑；透过电镜观察噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约150nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科。本发明还提供了该噬菌体的生产工艺，增值液离心后，首先通过膜浓缩提高噬菌体的效价，再通过陶瓷膜和0.22μm聚醚砜过滤膜，有效去除增值液中残留的宿主及其它杂菌，同时最大限度的保留了噬菌体，生产工艺简单，成本较低，利于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株奇异变形杆菌噬菌体RDP-SA-16033及其工业化生产工艺。

背景技术

奇异变形杆菌为革兰氏阴性菌，无芽胞、无荚 膜、周身鞭毛、形态成明显多形性，其生长繁殖对营养要求不高，4-7℃即可繁殖。该菌广泛存在于人与动物粪便、污水、土壤及临床标本中，其产生的毒素可以引起中毒，是一种常见的条件致病菌。奇异变形杆菌不仅感染鸡、鸽、山羊、奶牛和猪等常见家畜，也可感染猴、狐狸、熊猫和水貂等动物，在动物机体体抗力下降时能够引起外科感染、泌尿 系统感染、腹泻和菌血症等。近年来，我国河 南、河北、山东、安徽、广西等地不断有鸡群暴发奇异变形杆菌病，尤其是在季节更替、环境变化、转群和混合感染其他病原时，鸡群体抗力下降，病情加重，病死率升高，给畜禽养殖带来较大的经济损失。

此外，随着细菌耐药性逐渐加剧，原有的抗生素治疗己不能解决细菌耐药性问题。病原菌的流行病学可以锁定流行菌株，以流行菌株筛选噬菌体，其治疗效果会越来越体现出抗生素所无法比拟的优越性。随着分子生物学的日益完善与应用，噬菌体的裂解谱有望得到进一步的扩展，可以増强噬菌体的裂解能力，进而噬菌体治疗致病菌引起的感染性疾病也将会展现出前所未有的发展空间。

本发明在于相应国家全面禁抗的号令，解决细菌耐药性，抗生素滥用的问题，提供一株治疗禽奇异变形杆菌病的且安全可靠的裂解性奇异变形杆菌噬菌体。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株治疗禽奇异变形杆菌病的，且安全可靠的裂解性奇异变形杆菌噬菌体RDP-SA-16033，提供一株生产该噬菌体的病原菌S5。同时提供了一种分离噬菌体的高效方法。

本发明的另一个目的在于提供该噬菌体在治疗禽奇异变形杆菌病中的应用，提供该病原菌在生产该噬菌体在畜禽养殖中的的应用，RDP-SA-16033具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，效价较高，安全有效，有利于工业化生产。结合该噬菌体增值的特点，提供了一种大规模生产的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一株奇异变形杆菌噬菌体RDP-SA-16033，其宿主为奇异变形杆菌S5，该噬菌体在双平板上能形成直径在4-6mm的噬菌斑；透过电镜观察噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约150nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目肌尾病毒科,保藏编号为CGMCC No.18197。

一株奇异变形杆菌噬菌体RDP-SA-16033的工业化生产方法，步骤如下：

（1）种子制备，包括宿主种子制备和噬菌体种子制备，其中

A.宿主种子制备：无菌环境下挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-6h，将培养后的宿主菌以5%的接种量接种于100mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-6h，再以5%的接种量接种于1000mL的LB液体培养基，37℃，150rpm培养4-6h，培养好的宿主菌种子置于4℃冰箱备用；

B.噬菌体种子制备：将保存的噬菌体种子适当稀释后，取200μL与200μL宿主菌置于上层培养基中，倒双层平板，37℃，培养12-16h，在无菌条件下扣取噬菌斑，置于1mL生理盐水中，12000rpm，10min，取清液与宿主分别以2%的比例接种于5mL的LB培养基，37℃，200rpm培养4-8h，将培养好的噬菌体和宿主各以2%的接种量同时接种于100mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-8h，再将培养好的噬菌体和宿主各以2%的接种量同时接种于1000mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-8h，培养好的噬菌体种子置于4℃冰箱备用；

（2）噬菌体增殖：在种子罐中接种3%的宿主菌，培养4-6h后，OD600在0.6-0.8，再以3%的接种量接种噬菌体种子，培养6-8h，待溶氧反升，pH趋于稳定；

将制备好的宿主菌以3%的比例接种于种子发酵罐中，培养3-4h后，OD600值在0.6-0.8，将宿主菌通过移种管道接种于发酵罐，接种量为5%，宿主在种子罐中培养4-6h，OD在0.6-0.8时以5%的接种量接入噬菌体，培养6-8h，待溶氧反升，pH趋于稳定，结束增值；

（3）噬菌体后处理工艺：

A.离心：将增殖完成的噬菌体，用管式离心机离心，14000rpm，流速≤30L/H，去除未裂解的宿主和细菌碎片；

B.采用卷式膜进行浓缩，以提高噬菌体效价，卷式膜规格为50kd；

C.500纳米陶瓷膜过滤，去除部分细菌碎片和残留宿主；

D.过滤除菌：采用三级过滤：聚丙烯0.45μm，双层聚丙烯0.2μm，聚醚砜0.22μm除菌；

（4）噬菌体低温喷雾干燥：

将过滤除菌后的噬菌体液体加入载体并搅拌均匀，然后进行低温喷雾干燥，干燥温度60℃，进料速度8L/H，即可得到噬菌体粉。

优选的，步骤（2）种子罐参数为： 200-300rpm，37℃，通气1:0.6-0.8vvm；发酵罐参数为：120-150pm，37℃，通气1：0.6-0.8vvm。

优选的，步骤（2）中培养基成分为：酵母浸粉2%，甘油0.5%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，氯化钙20ppm，氯化镁20ppm，其余为水。

优选的，步骤（4）中所述载体成分为： 3%可溶性淀粉，3%聚乙烯吡咯烷酮，3%乳糖，2%海藻糖，0.2%磷酸氢二钠，0.3%磷酸二氢钠，0.1%维生素C和0.5%变性壳聚糖；均为质量比。

本发明的有益效果体现在：

（1）本发明发现并分离了一株奇异变形杆菌病原菌S5，并以该一株奇异变形杆菌S5为宿主分离得到了奇异变形杆菌噬菌体RDP-SA-16033，该噬菌体RDP-SA-16033对养殖环境中奇异变形杆菌S5具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中奇异变形杆菌S5的防治提供了噬菌体来源；

（2）RDP-SA-16033具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，效价较高，安全有效；

（3）本发明提供了一种有利于工业化大规模生产的方法，工艺成本较低，所得产品稳定性好，便于推广应用。

附图说明

本发明上述的以及其他的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：

图1为电镜观察本发明分离得到的噬菌斑的示意图；

图2为本发明噬菌体一步生长曲线实验的示意图；

图3为本发明噬菌体pH稳定性实验的示意图；

图4为本发明噬菌体对宿主裂解实验的示意图；

图5为本发明噬菌体热稳定性实验的示意图；

图6为本发明噬菌体稳定性遗传实验的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1致病性奇异变形杆菌S5的分离及鉴定

从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mL的 LB肉汤培养基中，37℃，200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16sRNA分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性奇异变形杆菌，将其中一株命名为S5，采用甘油保存的方法，将其保存于-80℃冰箱。

实施例2噬菌体RDP-SA-16033的分离及鉴定

样品处理：从肉鸡场采集病料，解剖后取肝脏，用灭菌后的研磨器研磨，然后添加2倍体积的生理盐水，震荡10min，然后12000rpm，10min离心，取上清液过0.22μm滤器，收集滤液备用。

噬菌体的浓缩：在收集到的清液中加入10%的GEG8000，4℃静置4-6h，12000rpm，10min离心，弃清液，用少量的生理盐水溶解沉淀，收集溶解液备用。

噬菌体的增值：取0.2mL菌悬液和0.5mL溶解液加入至5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后12000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，收集滤液备用。

噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.5mL和奇异变形杆菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，观察结果。如果有噬菌体，那么平板上有透明斑。挑取透明斑于1mL生理盐水中37℃水浴30min后，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养6-8h纯化，照此步骤纯化2-3次，至噬菌斑大小均匀为止，得到一种噬菌体，噬菌斑直径在4mm-6mm，并将其命名为RDP-SA-16033。

噬菌体的保藏：扣取单个噬菌斑，于2mL生理盐水中，37℃水浴10min，适当梯度稀释后，分别取0.1mL稀释液和宿主混合均匀，铺双层平板，选取噬菌斑呈云雾状的平板，用5mL灭菌的LB肉汤培养基清洗双层平板的上层，然后收集到离心管中，12000rpm，10min离心，过0.22μm的滤膜，收集过滤液，然后加入2%的氯仿，室温放置12-24h，取1mL置于安瓿瓶中，用酒精喷灯封口，做好标记，置于4℃冰箱长期保藏。

将所得的噬菌体进行基因测序。基因长度41327bp，不具有毒力基因和溶源基因。

实施例3：噬菌体的电镜观察

取 20 μL 含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀 15 min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2%的磷钨酸（PTA）于铜网上对噬菌体染色 10 min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态。

噬菌体RDP-SA-16033有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约70nm，有一个长约150nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，可将该噬菌体归类为有尾病毒目肌尾病毒科。参照图1所示。

实施例4一株奇异变形杆菌噬菌体RDP-SA-16033的工业化生产方法，步骤如下：

1、种子制备

（1）宿主种子制备：无菌环境下挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-6h，将培养后的宿主菌以5%的接种量接种于100mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-6h，再以5%的接种量接种于1000mL的LB液体培养基，37℃，150rpm培养4-6h，培养好的宿主菌种子置于4℃冰箱备用。

（2）噬菌体种子制备:将保存的噬菌体种子适当稀释后，取200μL与200μL宿主菌置于上层培养基中，倒双层平板，37℃，培养12-16h，在无菌条件下扣取噬菌斑，置于1mL生理盐水中，12000rpm，10min，取清液与宿主分别以2%的比例接种于5mL的LB培养基，37℃，200rpm培养4-8h（培养至增殖液变澄清或者出现絮状物为止），将培养好的噬菌体和宿主各以2%的接种量同时接种于100mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-8h，再将培养好的噬菌体和宿主各以2%的接种量同时接种于1000mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-8h，培养好的噬菌体种子置于4℃冰箱备用。

2、噬菌体增殖：在种子罐中接种3%的宿主菌，培养4-6h后，OD600在0.6-0.8，再以3%的接种量接种噬菌体种子，培养6-8h，待溶氧反升，pH趋于稳定。

将制备好的宿主菌以3%的比例接种于种子发酵罐中，培养3-4h后，OD600值在0.6-0.8，将宿主菌通过移种管道接种于发酵罐，接种量为5%，宿主在种子罐中培养4-6h，OD在0.6-0.8时以5%的接种量接入噬菌体，培养6-8h，待溶氧反升，pH趋于稳定，结束增值。

其中种子罐参数为： 200-300rpm，37℃，通气1:0.6-0.8vvm。发酵罐参数为：120-150pm，37℃，通气1：0.6-0.8vvm。

培养基成分：酵母浸粉2%，甘油0.5%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.1%，磷酸氢二钾0.1%，氯化钙20ppm，氯化镁20ppm，其余为水。

3、噬菌体后处理工艺

（1）离心：将增殖完成的噬菌体，用管式离心机离心，14000rpm，流速≤30L/H，去除未裂解的宿主和细菌碎片等。

（2）采用卷式膜进行浓缩，以提高噬菌体效价，卷式膜规格为50kd。

（3）500纳米陶瓷膜过滤，去除部分细菌碎片和残留宿主等。

（4）过滤除菌：采用三级过滤（聚丙烯0.45μm，双层聚丙烯0.2μm，聚醚砜0.22μm）除菌。

4、噬菌体低温喷雾干燥

将过滤除菌后的噬菌体液体加入载体并搅拌均匀，载体组成为3%可溶性淀粉，3%聚乙烯吡咯烷酮，3%乳糖，2%海藻糖，0.2%磷酸氢二钠，0.3%磷酸二氢钠，0.1%维生素C，0.5%变性壳聚糖，均为质量比；然后进行低温喷雾干燥，干燥温度60℃，进料速度8L/H，即可得到噬菌体粉。

本发明低温喷雾干燥与真空冷冻干燥的噬菌体粉在37℃和50℃条件下的稳定性：

在37℃条件下，采用本发明工艺所得的噬菌体粉在储存180天后，其效价由初始11.96Log（pfu/g）下降到10.31Log（pfu/g），而采用真空冷冻干燥的噬菌体粉，其效价由初始11.63Log（pfu/g）下降到8.16Log（pfu/g），在37℃条件下，低温喷雾干燥生产的噬菌体粉稳定性较好。

进一步对比两种噬菌体粉的热稳定性，将储存温度提高至50摄氏度。50℃，120min后，低温喷雾干燥生产的噬菌体粉效价由初始11.96Log（pfu/g）下降到8.61Log（pfu/g），而采用真空冷冻干燥的噬菌体粉，其效价由初始11.63Log（pfu/g）下降到7.31Log（pfu/g），同样在50℃条件下，本发明低温喷雾干燥生产的噬菌体粉的热稳定性较好。

实施例5噬菌体生长曲线的测定：

取对数生长期的奇异变形杆菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种奇异变形杆菌S5和噬菌体RDP-SA-16033，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB肉汤培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的LB肉汤培养基中，迅速置于37℃ 200r/min的摇床中振荡培养并计时。前30min每隔5min取样计数，30-60min每隔20min计数，60-300min每隔30min计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。平均裂解量 = 暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。结果如图2所示。

由图2可知，噬菌体感染宿主菌后的90min 内效价没有明显变化，表明其潜伏期约90min，感染后90-180min 内噬菌体的滴度明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为90 min。通过计算，噬菌体裂解量约为260PFU/感染细胞，表明噬菌体具有极强的裂解和复制能力。

实施例6噬菌体pH稳定性的测定：

用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再用配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1*10¹⁰pfu/mL，将稀释液在37℃下，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板。37℃倒置培养4-6h后计数。由表可知，RDP-SA-16033最适生长pH为中性环境。结果如图3所示。

在不同 p H 条件下培养 1 h 后，噬菌体RDP-SA-16033在pH5.0−8.0范围能维持较好的活性，噬菌体滴度没有明显变化，而且在 p H 为 7.0 时，噬菌体效价最高。随着 pH 值的升高或降低，噬菌体的滴度下降明显。表明噬菌体RDP-SA-16033能耐受弱酸和弱碱条件，具有良好的酸碱耐受性。

实施例7最佳感染复数的测定

按照感染复数为100 、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。结果如表1所示。

表1最佳感染复数的测定结果

管号S5奇异变形杆菌数（cfu/mL）RDP-SA-16033噬菌体数（pfu/mL）感染复数8h噬菌体效价（pfu/mL）11*10⁸1*10¹⁰1001.83*10¹²21*10⁸1*10⁹102.51*10¹²31*10⁹1*10⁹16.03*10¹²41*10⁹1*10⁸0.17.23*10¹²51*10⁹1*10⁷0.019.86*10¹²61*10⁹1*10⁶0.0014.23*10¹²71*10⁹1*10⁵0.00011.06*10¹²

结果显示，当感染复数为0.01时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP-SA-16033的最佳感染复数为0.01。

实施例8噬菌体对宿主裂解曲线的测定

在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线。将培养6h的宿主菌悬液以1:100的比例接种到100mLLB培养基中，以最佳感染复数，向其中3个加入噬菌体增殖液，同时以不加噬菌体的作为对照，结果取其平均值。结果如图4所示。

由图4可知，未加入噬菌体的宿主，随着宿主的增值，其OD600逐渐增加，在330min达到平衡，而加入噬菌体的宿主，在前20min，噬菌体处于对宿主的吸附、侵染阶段，OD600有所增加，随着噬菌体的数量的指数增加，在40min后，噬菌体裂解宿主，其OD600没有明显的提升，但随着时间的延长，其OD600逐渐增大。

奇异变形杆菌噬菌体RDP-SA-16033加入到宿主菌S5菌悬液中，作用40分钟后出现一定的裂解效果，与对照组相比，未加入噬菌体的宿主OD600增加明显，说明该噬菌体对宿主有较强的裂解能力，能够持续的对宿主菌进行裂解。由于前20分钟，噬菌体处于对宿主菌的吸附、侵染阶段，只有少部分噬菌体开始裂解宿主，因此，其裂解宿主的量远远小于宿主的增长量，因此，OD600在在前20分钟内，依旧保持一定的上升趋势，伴随着噬菌体数量的指数增加，在40分钟后，其裂解宿主数量大于宿主的增殖速度，所以OD600值开始逐渐降低，混合菌液达最澄清。持续作用270min后，混合菌液出现返浊，原敏感菌被噬菌体裂解，被突变的耐受菌所取代的一种菌群交替。因此，为获得高效价的噬菌体，应控制混合菌液在达到最高清晰度至返浊现象开始之前这一时间范围内，从而避免对噬菌体效价的影响。

实施例9噬菌体热稳定性的测定

将噬菌体原液分装到EP管中，分别在40℃、50℃、60℃、70℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍比稀释后，铺双平板测定其效价。结果如图5示。

由图5可知，随温度的升高和时间的延长，噬菌体的活性有一定程度的降低（分别下降1.1和1.2个数量级），说明RDP-SA-16033对温度有一定的耐受性。。

实施例10稳定性遗传实验的研究：

将RDP-SA-16033连续传代29次，每代培养基中加入等量的RDP-SA-16033和S5，每代培养时间6h，然后铺双平板，测定其效价。结果如图6所示。

由图6可知，将RDP-SA-16033连续传29代后，其效价稳定在10¹²pfu/mL以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产。

实施例11噬菌体对宿主的裂解试验

无菌条件下，分别取1mL样品和1mL宿主菌菌液（1×10⁵CFU/mL），37℃孵育15分钟，混匀后用生理盐水稀释至10^-1-10^-3个梯度，每个梯度取100μL涂布于LB琼脂平板上，置于37℃，培养24小时，每个梯度重复两次。同时取1mL生理盐水和1mL宿主菌菌液（1×10⁵CFU/mL）作为空白对照，重复以上步骤。选取30-300个菌落数的平板进行计数。该试验重复3次，取其平均值。噬菌体裂解率=（1-处理组菌落数/对照组菌落数）×100%。

经计算，RDP-SA-16033的裂解率达98%，对宿主有较好的裂解效果，适合在养殖过程中使用。

实施例12RTD实验

在平板上划分区域，将一滴宿主菌（约100 μL）滴加到区域中心处，晾干，将不同稀释度的一滴噬菌体液滴加到宿主菌的斑点上，晾干，37℃培养16-24h。根据宿主菌生长状况，凡是不能连片生长的，称为CL浓度（CL浓度是可以完全性裂解环境中宿主菌的浓度，可以用于指导生产实践的稀释方案）。研究表明：RDP-SA-16033在稀释10⁸倍后对宿主菌仍有较好的裂解效果。

实施例13 噬菌体入血实验

肉鸡在口服6h后，用PCR的方法进行噬菌体的检测，结果表明，噬菌体在心肝、肺、肾、胸腺和血清均能检测到，说明该噬菌体可以通过口服进入血液，通过血液循环到达心、肝、肺、肾和胸腺。

本发明噬菌体效价高，可达10¹²pfu/mL以上,对温度和pH均有较好的耐受性，在连续传代29次后，其效价仍然保持在10¹²pfu/mL以上，遗传性能较好，在稀释10⁸倍后，仍对宿主有较好的裂解效果，通过饲喂后，在心肝、肺、肾、胸腺和血清种均能检测到该噬菌体的存在，进一步通过动物实验，在治疗鸡奇异变形杆菌病中，具有较好的效果，且使用后没有不良反应。通过全基因测序后，发现该噬菌体基因中不存在溶原性基因和毒力基因，又进一步验证了其安全性。

应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。