一株海洋噬菌体与一株分离于病毒浓缩液的海洋细菌的分离与鉴定

摘要

海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最高，多样性极为丰富，生物量仅次于原核生物的有机体.由于对宿主的侵染和裂解作用，海洋浮游病毒影响和调节着微生物的群落结构和生物地球化学特征以及海洋生态系统中的物质和能量的流动.
　　 为从个体水平上了解海洋浮游病毒及其与宿主的相互作用，本研究一方面从海洋噬菌体的分离入手，在中国东海海域分离得到一株侵染海洋副球菌的噬菌体PMJL(φ)1，并在此基础上，从生理与基因水平上对该病毒进行了研究和描述;另一方面，在取于同一站位的在4℃中存放一年之久的海洋病毒浓缩液分离得到一株海洋细菌JLT2000.由于其独特的分离得到途径，研究其长久的耐寒及抗病毒机制有很大的意义.另外，由于其与已鉴定菌株较低的相似性，我们首先对其作了细菌学鉴定.本文的研究结果如下:
　　 (1)在中国东海海域分离得到的噬菌体PMJL(φ)1从形态上看属于长尾噬菌体，有一个直径约50 nm的等轴的头部，长约122 nm，宽约10 nm的可弯曲，不可收缩的尾部.侵染宿主JL65的潜伏期及裂解量分别约为30 min和27.对氯仿的敏感度具有浓度依赖性.此外，PMJL(φ)1为双链DNA病毒，基因组为环状，总长度为42，093 bp，G+C含量为56.37％.在该病毒基因组中预测得到53个ORF,其中大约55％的基因是未知的.有推测功能的基因包括DNA复制相关的基因，编码结构蛋白相关的基因及其它参与到DNA代谢，氨基酸代谢，转录调节等过程的基因.另外值得注意的是在病毒的基因组中存在4个与GTA类似的基因.PMJL(φ)1的53个ORF中有22个与一株分离于假单胞菌的噬菌体PA73有最高及较高的相似性，8个ORF与本实验室一株分离鉴定并全基因组测序的海洋细菌Citromicrobium sp.JLT1363有着最高及较高的相似性.
　　 (2) JLT2000为一株革兰氏阴性菌，严格好氧，化能异养，氧化酶，接触酶阳性.菌体形态为拟杆状，具有运动性，可以在6-9的pH值范围内，4-40℃的温度范围内，0-12％的盐度范围内生长.它可以利用D-半乳糖，甘露醇，海藻糖，二水D-葡萄糖酸钠，丙酮酸钠，α-乳糖，纤维二糖，山梨醇，肌醇，L-谷氨酸钠，葡萄糖等单碳源;并且可以利用甘露醇，葡萄糖，蔗糖，乳糖，纤维二糖，海藻糖，肌醇，D-半乳糖等糖醇类产酸.可以水解七叶苷，淀粉，几丁质，酪素，不能水解琼脂，纤维素，明胶，尿素，DNA.脂肪酸的主要组分有iso-C15:0，iso-C15:03-OH，iso-C17:03-OH，Sum In Feature3(16∶1 w7c/16∶1 w6c).极性脂成分较为单一，包括一种磷脂酰甘油(PG)，和两种心磷脂(DPG1，DPG2).JLT2000对四环素，氯霉素，红霉素，麦迪霉素，万古霉素，氧氟沙星，环丙沙星，克拉霉素，克林霉素敏感.JLT2000与Marivirga sericea LMG13021T有最高的的相似性，为96.1％，与Marivirgatractuosa KCTC2958T的16S相似性为95.77％.

目录

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摘要

第一章 综述

1．1 海洋浮游病毒学的研究概况

1．2 海洋浮游病毒的基本特征及其主要类群

1．3 病毒的生活周期

1．4 海洋浮游病毒的基本生态特征

1．4．1 海洋浮游病毒在海洋生物地球化学过程中的作用

1．4．2 病毒对水平基因转移的影响

1．4．3 病毒对宿主多样性及群落结构的影响

1．4．4 病毒编码的宿主基因

1．5 海洋浮游病毒生态学的基本研究方法

1．5．1 病毒丰度的计数方法

1．5．2 病毒生产力和宿主死亡率的估算方法

1．5．3 海洋浮游病毒多样性的研究方法

1．5．4 海洋浮游病毒的分离

第二章 一株海洋副球菌噬菌体PMJLφ1的分离鉴定及全基因序列分析

2．1 材料与方法

2．1．1 宿主菌株的培养和噬菌体的分离

2．1．2 噬菌体电镜观测

2．1．3 噬菌体宿主范围检测

2．1．4 噬菌体一步生长曲线

2．1．5 氯仿敏感性检测

2．1．6 噬菌体浓缩纯化

2．1．7 噬菌体基因组DNA的提取

2．1．8 噬菌体基因组DNA纯度测试及测序

2．1．9 噬菌体基因组序列的生物信息学分析

2．2 结果与讨论

2．2．1 病毒分离使用的菌株及分离结果

2．2．2 噬菌斑特征及噬菌体形态

2．2．3 PMJLφ1 Paracoccus属内宿主范围检测

2．2．4 一步生长曲线

2．2．5 氯仿敏感性检测

2．2．6 基因组DNA纯度检测

2．2．7 全基因组序列分析

第三章 一株分离于病毒浓缩液的海洋细菌的鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株来源

3．1．2 培养基

3．1．3 鉴定方法

3．1．4 菌体细胞脂肪酸测定

3．1．5 细胞极性脂测定

3．1．6 抗生素敏感性实验

3．1．7 菌体基因组DNA G+C％测定

3．1．8 进化树构建

3．2 结果与讨论

3．2．1 待鉴定菌株序列测定结果

3．2．2 菌落形态与菌体形态

3．2．3 碳源利用

3．2．4 产酸实验

3．2．5 各项生理生化指标及与参照菌株的对比分析

3．2．6 抗生素敏感性实验

3．2．7 脂肪酸含量分析

3．2．8 极性脂测定结果

3．2．9 对比分析总结

3．3 JLT2000的整体描述

主要结论及创新点

参考文献

致谢