一株基因工程菌噬菌体(EECP)的分离与鉴定

摘要

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒,是生物界中一类非细胞形态的低级生命形式。由于种类众多、结构简单、基因组较小且易于培养与操作,噬菌体已成为研究DNA、RNA和蛋白质间相互作用的重要分子模型和理想材料,在基本生命现象的揭示、生物体多样性的研究、难治性耐药菌感染的防治、环境污染的治理等多方面均发挥着十分重要的作用。因此,自上世纪20年代,Frederick W.Towrt(1915年)和Felix d'Herelle(1917年)首次发现噬菌体以来,噬菌体及其基因组学的研究一直处于微生物学及分子生物学研究的热点领域。截止2008年4月底,完成全基因组测序并登录GenBank的噬菌体就已有484株,但相对于噬菌体极大的生物多样性(有报道指出,生物圈中的噬菌体有1031之多)而言,这只是冰山之一角。因此,分离和鉴定新的噬菌体有着特别的意义。
　　 基因工程菌是采用基因工程方法进行了人工改造的菌株,它是分子生物学研究与应用中重要的生物学工具与材料,被广泛应用生命科学研究、食品工业、医药卫生、农牧业、环境保护等领域。大肠杆菌来源的基因工程菌是使用最为频繁的工程菌之一,迄今为止,已构建成功的大肠杆菌来源的基因工程菌已达近百种之多,常用的就有50种以上。在应用基因工程菌规模化制备生物活性制剂的过程中,需要高密度培养基因工程菌。而噬菌体感染是基因工程菌培养中最大的威胁,一旦生产车间或科研实验室被相关噬菌体污染,造成的危害将是灾难性的。因此,分离和深入研究基因工程菌噬菌体,摸清其生物学特性,获取相关的实验资料,对于防御相应噬菌体的感染有着相当重要的意义。虽然目前已分离鉴定且完成测序的肠道杆菌噬菌体已达100+株,但迄今未见大肠杆菌基因工程菌噬菌体的任何报道。本研究报道了一株全新的大肠杆菌基因工程菌噬菌体,并对其生物学特性及理化耐受性进行了初步研究。研究内容及结果主要包括以下几个方面:
　　 1、大肠杆菌基因工程菌噬菌体的发现。EECP是我室在用大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)感受态细菌进行电转化实验时偶然发现的一株噬菌体。通过回收、克隆两条EECP基因组DNA经BamHⅠ酶切后的片段(分子量大小分别约为1,700 bp和700bp)并测序,测序结果的Blastn分析比对提示该噬菌体为一株全新的大肠杆菌基因工程菌噬菌体(engineered E.coli phage,EECP)。
　　 2、噬菌体EECP可裂解我室保存的10株大肠杆菌来源的基因工程菌。对EECP的宿主谱研究显示:EECP能裂解我室保存的10株大肠杆菌基因工程菌,它们分别是BL21(DE3)、DH10B、DH5α、JM109、M15(PREP4)、Rosetta、Rosetta-gami、S17-1、S17-1λPir+、TOP10。但对于5株大肠杆菌临床分离株,仅裂解其中1株,也不能裂解用作对照的铜绿假单胞菌及葡萄球菌。因此,噬菌体EECP对于大肠杆菌来源的基因工程菌具有相对广的宿主谱特性。
　　 3、噬菌体EECP可能是一株具有“运动”能力的噬菌体。电镜下观察,EECP有一个多面体立体对称的头部(直径约为79-83nm)和一条呈波浪状弯曲的长尾(长约180-210nm,宽约7-8nm)。从形态上看EECP的尾部仿佛为一个具有柔性的结构,类似细菌的单鞭毛,给人一种噬菌体能借助该尾部进行运动的印象。在进行噬斑实验时,我们发现部分噬斑会出现“拖尾现象”,似乎是噬菌体定向移动后留下的痕迹,这一发现更强化了该噬菌体可以“运动”的印象。可以“运动的噬菌体”从未有人报道。
　　 4、EECP的基本生物学特性。①EECP为溶原性噬菌体,感染宿主菌后多形成直径约1-2mm的圆形噬斑,噬斑呈双层环状,中心较为透亮,外环呈半透明云雾状,部分噬斑出现拖尾现象或呈条形噬斑。②根据噬菌体颗粒在电镜下的形态学特征、无囊膜以及双链DNA特性判断,该噬菌体应属于肌尾噬菌体。③EECP感染其宿主菌BL21(DE3)的最佳感染复数是0.01。④根据一步生长曲线可知,EECP感染宿主菌BL21(DE3)的潜伏期约为10-15min,爆发期约为30-40min,爆发量约为375±43。⑤酶切分析表明EECP基因组为双链环状DNA分子,分子量大小约为45kb。⑥SDS-PAGE结果显示EECP至少含有9个结构蛋白,分子量分别约为136.38,91.47,63.91,45.20,36.66,29.19,24.20,21.88,15.84 kD(依次称为＃1-＃9蛋白),其中,45.20kD蛋白(即＃4蛋白)是其主要的结构蛋白。氨基酸测序结果显示＃2、＃3、＃4、＃6、＃9蛋白的N-端5个氨基酸残基序列分别为ADQAA、TVNVD、SLTVF、GYQLP和MLDSI。⑦全基因组测序表明,EECP基因组由40061bp序列组成,EECP基因组的G+C含量为54.65％,共发现225个ORF和59个推定基因。⑧结合结构蛋白的N-端氨基酸测序结果和59个推定基因的氨基酸序列分析,初步确定136.38kD、91.47kD、63.91kD、29.19kD、15.84kD5个EECP衣壳蛋白的编码基因分别是orf24、orf30、orf52、orf33、orf46。
　　 5、EECP的理化抗性研究。①EECP具有较强的温度耐受能力。在噬菌体滴度较高时,90℃45min也不能完全灭活噬菌体。但温度越高,噬菌体失活越多,95℃5min处理后即检测不到活的噬菌体存在。②EECP对乙醇的耐受能力较强,即使75％及100％的乙醇溶液处理45min也不能彻底杀死所有噬菌体,提示EECP可能不具有脂质包膜。③噬菌体EECP耐碱不耐酸,PH2～3环境对EECP的杀伤能力极强。在37℃下,EECP对酸性环境的敏感性高于25℃。④当培养基中有Na+存在时,EECP的裂菌活性弱于无Na+环境,且Ca2+及Mg2+能进一步的降低EECP的裂菌活性。
　　 综上所述,本研究分离、鉴定了一株全新的大肠杆菌来源的基因工程菌噬菌体;噬菌体颗粒形态学及噬斑特性提示该噬菌体可能是一株有“动力”的噬菌体;研究完成了该噬菌体的基本生物学特性及部分理化抗性的初步分析;进而还进行了该噬菌体的全基因组测序,为随后的基因组注释和功能基因组学研究奠定了基础;理化抗性参数的明确为大肠工程菌发酵产业中防止该噬菌体污染提供了实验依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写一览表、氨基酸缩写

前言

第一章 噬菌体EECP的发现及其初步鉴定

第一节 噬菌体EECP的发现

第二节 噬菌体EECP的噬斑特性及培养滴度测定

试剂与材料

实验方法

结果与讨论

第三节 噬菌体EECP的电镜下形态

试剂与材料

实验方法

结果与讨论

第四节 噬菌体EECP的核酸性质鉴定及基因组大小分析

试剂与材料

实验方法

结果与讨论

第五节 噬菌体EECP是否为一株全新的噬菌体?

试剂与材料

实验方法

结果与讨论

第六节 噬菌体EECP的全基因组测序

分析方法

结果与讨论

第二章 噬菌体EECP的生物学特性

第一节 噬菌体EECP宿主谱的初步鉴定

试剂与材料

实验方法

结果与讨论

第二节 噬菌体EECP最佳感染复数的测定

实验方法

结果与讨论

第三节 噬菌体EECP一步生长曲线的绘制

实验方法

结果与讨论

第四节 噬菌体EECP结构蛋白的分析

试剂与材料

实验方法

结果与讨论

第三章 噬菌体EECP的理化抗性研究

第一节 噬菌体EECP的温度耐受实验

实验方法

结果与讨论

第二节 噬菌体EECP的乙醇耐受实验

实验方法

结果与讨论

第三节 噬菌体EECP对不同PH环境的耐受力研究

试剂与材料

实验方法

结果与讨论

第四节 不同阳离子对噬菌体EECP裂菌能力的影响

试剂与材料

实验方法

结果与讨论

全文总结

致谢

参考文献

文献综述一 前噬菌体及其对宿主菌进化的影响

文献综述二 噬菌体与细菌毒力

攻读博士学位期间发表的文章

英文论著