由双重化合物激活的强有效的抗癌活性

摘要

本发明提供用于诱导细胞死亡(例如癌细胞死亡)的组合物和方法。本发明公开了化合物的结合物以及相关方法用途，包括化合物在用于治疗癌症和在细胞中选择性诱导细胞凋亡的疗法中的用途。所公开的药物结合物可比其他的化合物和化合物的结合物具有更低的神经毒性效应。

说明书

相关专利申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本专利申请要求2012年3月2日提交 的美国临时申请No.61/605,819的优先权，所述申请以引用的方式纳入 本文。

背景技术

细胞凋亡，或程序性细胞死亡，在所有多细胞生物的发育和动态平 衡中起着重要的角色。癌症的频发性标志是对自然细胞凋亡信号的抵 抗。取决于癌症的类型，这种抵抗通常是由于细胞凋亡级联反应中关键 蛋白质的上调或下调造成的，或由于编码这些蛋白质的基因发生突变造 成的。这些改变发生在内源性细胞凋亡途径(通过线粒体和半胱天冬酶 -9汇集)和外源性细胞凋亡途径(涉及死亡受体和半胱天冬酶-8的作用) 中。例如，已在癌症中观察到蛋白质——如p53、Bim、Bax、Apaf-1、 FLIP和很多其他蛋白质——适当水平的改变。这种改变可导致有缺陷 的细胞凋亡级联反应，在这种有缺陷的细胞凋亡级联反应中，上游促凋 亡信号没有被充分传递来激活执行者(executioner)半胱天冬酶、半胱 天冬酶-3和半胱天冬酶-7。

因为大多数细胞凋亡途径最终涉及半胱天冬酶-3酶原的激活，上游 基因异常有效地“阻断”了细胞凋亡线路，因此这些细胞非典型地增殖。 考虑到细胞凋亡在癌症中的重要作用，已经致力于开发靶向细胞凋亡级 联反应中特定蛋白质的治疗方法。例如，与级联反应成员(如p53和 Bcl家族中的蛋白质)结合的或者与细胞凋亡抑制剂(1AP)蛋白家族 结合的肽结合物(binder)或小分子结合物具有促凋亡活性，并且促进 Apaf-1寡聚化作用的化合物也具有该活性。然而，由于这些化合物靶向 细胞凋亡级联反应中早期(或中间到高)的位置，在那些成员的下游蛋 白质上具有突变的癌症仍然可以抵抗那些化合物的可能的有益效果。

对直接激活细胞凋亡级联反应远端下游的促凋亡蛋白的小分子进 行识别，会对治疗目的有利。这种方法可涉及级联反应中相对较低的位 置，因此使得甚至能够杀死在其上游凋亡机器(machinery)上具有突 变的那些细胞。而且，如果在癌症细胞中所述促凋亡蛋白被上调，，这 种治疗策略会有更高的成功可能性。因此，靶向细胞凋亡下游效应蛋白 的识别小分子——半胱天冬酶-3——会大大有助于目前的癌症治疗。

半胱天冬酶-3酶原到半胱天冬酶-3的转化或激活导致产生活性 “执行者”半胱天冬酶形式，其随后催化多种蛋白质底物的水解。活性 半胱天冬酶-3是异源二聚体的同源二聚体，并且其由半胱天冬酶-3酶原 的蛋白水解产生。在体内，这种蛋白水解的激活通常通过半胱天冬酶-8 或半胱天冬酶-9的作用而发生。为了确保酶原不会被过早地激活，半胱 天冬酶-3酶原含有阻碍进入蛋白水解的ETD位点(氨基酸序列，异亮 氨酸-谷氨酸-苏氨酸-天冬氨酸)的12个氨基酸的“保险栓”。此保险 栓使得半胱天冬酶-3酶原能够抵抗半胱天冬酶-9的自动催化激活和蛋 白水解。诱变研究表明，三个连续的天冬氨酸残基看起来是保险栓的关 键组分。所述保险栓的位置对pH值敏感，因此在细胞酸化时(如在细 胞凋亡过程中发生)，所述保险栓被认为允许进入蛋白水解的位置，并 且可通过半胱天冬酶-9的作用或通过自身激活机制产生活性半胱天冬 酶-3。

在某些癌症中，半胱天冬酶-3酶原的水平相对于正常组织是增高 的。对来自20位结肠癌患者的初级分离物的研究显示，平均而言，相 对于邻近的非癌组织，这种分离物中的半胱天冬酶-3酶原被上调六倍。 另外，半胱天冬酶-3酶原在某些神经母细胞瘤、淋巴瘤和肝癌中被上调。 此外，对被国家癌症研究所(NCI)开发治疗项目用于癌症筛选的60 个细胞系组中半胱天冬酶-3酶原的水平进行了系统性评估，结果表明某 些肺癌、黑色素瘤癌、肾癌及乳腺癌显示出显著增高的半胱天冬酶-3 酶原表达水平。

由于活性半胱天冬酶-3在实现细胞凋亡中的作用，在某些癌细胞类 型中相对高水平的半胱天冬酶-3酶原和令人感兴趣的保险栓介导的对 半胱天冬酶-3酶原自身激活的抑制，直接修饰半胱天冬酶-3酶原的小分 子可能在靶向癌症治疗中具有很大应用。

联合治疗已成为治疗癌症患者的标准。联合治疗药物鸡尾酒疗法的 目标是在化疗药物间实现协同或累加效应，从而有利于缩短治疗时间， 降低毒性，和提高患者存活率。作用于单一生化途径的药物是用于协同 作用或增强作用的特别强的候选药物，因为它们可模拟“合成致死”的 基因组合。例如，如细胞培养、动物模型、和人类临床试验所证明的， 聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP-1)的抑制剂——一种促进DNA损伤 修复的酶——有效地与DNA损伤剂协同作用。然而，仍需要更有效的 疗法用于治疗多种形式的癌症，抗癌药物的新的协同组合将有助于该诉 求。因此，需要识别新的细胞毒性剂，所述新的细胞毒性剂能有效杀死 癌细胞还能保护正常宿主组织免受其不需要的细胞毒性剂的毒性的影 响。

发明内容

本发明主要提供治疗处理的化合物、组合物和方法。在实施方案中， 本发明可适用于多种癌症疾病和癌细胞类型的情况，如乳腺、淋巴瘤、 肾、黑色素瘤、白血病、神经母细胞瘤、肺、脑及本领域已知的其他癌 细胞类型。本文尤其公开了包括能够诱导细胞死亡的小分子的组合物和 方法。在多个实施方案中，所述组合物和方法涉及可直接地或间接地与 程序性细胞死亡途径成员(如半胱天冬酶-3酶原)相互作用的化合物。 在一些实施方案中，所述组合物和方法与其他直接地或间接地与程序性 细胞死亡途径成员(如半胱天冬酶-3酶原)相互作用的化合物相比具有 降低的神经毒性。

联合抗癌治疗可由靶向不同生化途径的药物组成，或由攻击同一途 径中不同靶标的那些药物组成，模拟了“合成致死”基因组合。本公开 内容证实了联合治疗的新概念，即，使用选择性激活同一生物靶标但通 过不同机制的两种化合物来进行酶激活。半胱天冬酶-3酶原激活剂 PAC-1和1541B的结合物在体外半胱天冬酶-3酶原酶活性的激活作用 中表现出相当大的协同作用，在培养的多种癌细胞系中诱导半胱天冬酶 -3酶原快速且惊人的自我成熟(automaturation)，并且有效地诱导培 养的癌细胞的凋亡性死亡至远远超过累加效应的水平。最后，PAC-1 和1541B的结合物有效地降低鼠肿瘤模型中的肿瘤负荷，而单独的化合 物在此模型中具有很小的影响或没有影响。这些数据表明PAC-1/ 1541B结合物用于癌症治疗的潜力，更广义地说，表明差异性作用的酶 激活剂可协同作用以提供显著提高的生物学效应。

因此，本发明提供了一种组合物，包括(a)式(I)的化合物：

其中R是H或甲基；

(b)化合物PAC-1：

和(c)可药用的稀释剂、赋形剂或载体。在一个实施方案中，式(I)的R 是H。在另一个实施方案中，式(I)的R是甲基。载体可包括水，和任 选地缓冲液、环糊精、或其组合。在一个具体实施方案中，环糊精是 2-羟丙基-β-环糊精。

本发明还提供了抑制癌细胞生长或增殖的方法，所述方法包括使癌 细胞与本文所述的有效量的化合物或组合物接触，从而抑制癌细胞的生 长或增殖。所述癌细胞可以是肛门癌细胞、膀胱癌细胞、乳腺癌细胞、 子宫颈癌细胞、结肠直肠癌细胞、胃癌细胞、头颈癌细胞、白血病细胞、 肺癌细胞、霍奇金淋巴瘤细胞、非-霍奇金淋巴瘤细胞、恶性淋巴瘤细 胞、神经母细胞瘤细胞、眼癌细胞、骨癌(osteogenic carcinomas)细 胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、肾癌细胞、黑色素瘤细胞、软组织肉 瘤细胞、甲状腺癌细胞、或维尔姆瘤细胞。在一些实施方案中，所述癌 细胞是乳腺癌细胞、白血病细胞、或淋巴瘤细胞。

本发明还提供了将半胱天冬酶-3酶原激活为半胱天冬酶-3的方法， 所述方法包括使半胱天冬酶-3酶原与本文所述的化合物或组合物接触。 用于本文所述的这个方法或其他方法的接触，可以在体外进行，或所述 接触可以在体内进行。

本发明还提供了增强式(I)的化合物的活性的方法：

其中R是H或甲基；

所述方法包括使癌细胞与式I的化合物和有效激活量的PAC-1的 结合物接触：

其中所述PAC-1增强式(I)的化合物对癌细胞的活性。

本发明还提供了在癌细胞中诱导细胞凋亡的方法，所述方法包括使 癌细胞与有效量的式(I)的化合物和有效量的化合物PAC-1接触：

其中R是H或甲基；

其中由此在所述癌细胞中诱导细胞凋亡。所述癌细胞可同时与式(I) 的化合物和PAC-1接触。或者，在所述癌细胞与PAC-1接触之前将所 述癌细胞与式(I)的化合物接触，或者在将癌细胞与式(I)的化合物接触之 前将所述癌细胞与PAC-1接触。

本发明还提供了治疗有需要的患者的癌症的方法，其中，所述方法 包括同时或依次给予患者治疗有效量的式(I)的化合物和有效量的化 合物PAC-1：

其中R是H或甲基；

其中癌症是乳腺癌、白血病、或淋巴瘤。可同时给予式(I)的化合物 和化合物PAC-1。在另一个实施方案中，可依次给予式(I)的化合物和化 合物PAC-1。在一些实施方案中，在化合物PAC-1之前给予式(I)的化 合物。在其他实施方案中，在化合物PAC-1之后给予式(I)的化合物。

因此，本发明提供了本文所述的组合物用于医药治疗的用途。所述 医药治疗可能是治疗癌症，例如，乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、 结肠癌、和本文列举的其他癌症。本发明还提供了本文所述的组合物用 于制备药物以治疗哺乳动物的疾病(例如人类的癌症)的用途。因此， 本发明提供了本文所述的化合物用于制备用于治疗哺乳动物(例如人 类)的癌症的药物的用途。所述药物可包含可药用的稀释剂、赋形剂、 或载体。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分并被包括以进一步证明本发明的 某些实施方案或多个方面。在某些情况下，可参考随附的附图并结合本 文给出的详细说明来最好地理解本发明的实施方案。所述说明书和随附 的附图可以强调本发明的某一具体实施例或某一方面。但是，本领域的 技术人员会理解可结合本发明的其他实施例或方面，使用所述实施例的 部分或所述方面的部分。

图1.PAC-1和1541B的结构。

图2.在37℃下用化合物1541B(25μM)孵育野生型半胱天冬酶 -3酶原(1μM)或D₃A突变体(1μM)，并且通过在所示时间点取出 等份试样并用Ac-DEVD-AFC底物对它们进行评估以监测半胱天冬酶 -3活性。使用半胱天冬酶-3(1μM)来设置100％的半胱天冬酶-3活性。 图中的线从上到下分别对应图例(1μM PC3-WT+25μM 1541B在上 端)。

图3.在一系列ZnSO₄的浓度的存在下，用化合物1541B(25μM) 孵育野生型半胱天冬酶-3酶原(1μM)，并且使用Ac-DEVD-pNA底 物监测半胱天冬酶-3活性。图中的线从上到下分别对应图例。

图4.用ZnSO₄(1μM)和1541B(25μM)、或1541B(30μM) 和PAC-1(50μM)孵育野生型半胱天冬酶-3酶原(1μM)，并且用 Ac-DEVD-pNA底物监测半胱天冬酶-3活性。图中的线从上到下分别对 应图例。因此，PAC-1增强了1541B活性。

图5.PAC-1/1541B结合物诱导快速的和显著的半胱天冬酶-3酶原 的成熟和激活。A：用PAC-1/1541B结合物治疗后癌细胞裂解物的类- 半胱天冬酶-3/-7活性。STS＝星形孢菌素。B：用PAC-1和1541B结合 物治疗后不同癌细胞系的蛋白印迹(使用细胞信号半胱天冬酶-3抗体)。

图6.类似于图5B的数据，A：HL-60(人白血病)、B：EL4(鼠 淋巴瘤)、C：Hs578T(人乳腺癌)、和D：Jurkat(人白血病)细胞系。

图7-9.PAC-1在多种不同细胞系中显著增强1541B的促细胞凋亡 活性。

图7.PAC-1/1541B结合物诱导培养的癌细胞的快速死亡。用所示 浓度的PAC-1和1541B处理癌细胞系，并对凋亡性死亡进行评估。如 所显示的，所示数据针对U-937、A549和BT-549。虚线代表每种药物 结合物的PAC-1和1541B的累加效应。

图8.在用PAC-1/1541B结合物处理时，在A)HL-60(人早幼粒 细胞性白血病)、B)Hs578T(人乳腺癌)、C)U-87(人成胶质细胞瘤) 和D)EL4(鼠淋巴瘤)细胞系中观察到半胱天冬酶-3酶原向半胱天冬 酶-3的激活，而在单独使用1541B或PAC-1时观察到低的胱天冬酶-3 酶原的激活/观察不到半胱天冬酶-3酶原的激活。虚线代表每种药物结 合物的PAC-1和1541B的累加效应。

图9.通过图7或8所使用的方法获得的其他数据和多种浓度下的 数据。11A)Jurkat细胞；11B)EL-4细胞；1IC)HL-60细胞；1ID)A-549 细胞；和11E)BT-549细胞。虚线代表每种药物结合物的PAC-1和1541B 的累加效应。图例对应柱形图的各个柱，其中最高的图例条目对应最左 边的柱，剩余的图例条目分别对应剩余的柱，从上到下分别对应从左到 右。

图10.泛-半胱天冬酶抑制物Q-VD-OPh(25μM)在MCF-7细胞中 保护免于PAC-1/1541B-介导的细胞死亡。

图11.PAC-1/1541B结合物对MCF-7细胞(MCF-7VRL)的影响 很小，但对通过质粒(MCF-7C3)表达半胱天冬酶-3酶原的MCF-7 细胞有显著的促细胞凋亡作用。A)MCF-7VRL和MCF-7C3的蛋白印 迹。B)使用多种浓度的1541B的蛋白印迹，显示出半胱天冬酶-3的激 活。C)MCF-7细胞死亡数据；C3成对的基因敲入。

图12.(A)PAC-1与1541B在U-937细胞中的协同效应。(B)PAC-1 与1541b在EL4细胞中的协同效应。虚线代表单纯累加效应的预期水 平。图例对应柱形图的柱，其中最上面的图例条目对应最左边的柱，其 余的图例条目对应剩余的柱，从上到下分别对应从左到右。

图13.用递增浓度的1541B和用或不用PAC-1处理的U-937细胞 的半胱天冬酶3酶原激活的蛋白印迹分析。

图14.显示出通过PAC-1和1541B联合激活半胱天冬酶3酶原的 机制示意图。

图15.PAC-1和1541B的结合物在体内具有抗肿瘤作用。将EL4 细胞(10百万细胞/只鼠)皮下注射到小鼠中，将动物分成四组，分别 用媒介物(2-羟丙基-β-环糊精，HPβCD)、1541B(17.5mg/kg，在HPβCD 中)，PAC-1(125mg/kg，在HPβCD中)，或1541b+PAC-1(分别 为17.5和125mg/kg，在HPβCD中)对它们进行处理。八天后处死小 鼠，切除肿瘤并称重。误差柱等于标准误差，所示的p值为相对于媒介 物对照。

具体实施方式

作为进一步的介绍，已发现能够激活通常在癌细胞中以其失活形式 被过度表达或者原本以增加水平存在的酶的化合物。所述化合物可在癌 细胞中诱导程序性细胞死亡(细胞凋亡)，包括在具有上调的或增加的 半胱天冬酶-3酶原水平的那些癌细胞整中。很多癌症耐受常规的化疗。 本文所述的联合治疗可利用可在癌细胞中上调的生物靶标，并因此可证 明甚至在在其凋亡机器中带有缺陷的细胞中有效，同时在当所述结合物 中的一个单独会是低效或无效的条件下提供效力。这些化合物还可在靶 向癌症治疗中是成功的，其中可能在杀死癌细胞的选择性上有优势，而 对含有低水平的半胱天冬酶-3酶原的非癌细胞具有相对降低的不良反 应。这些不良反应可包括毒性，尤其是神经毒性。

本文所述的化合物的结合物、组合物和方法可以通过细胞凋亡或程 序性细胞死亡的调节起作用以有效地治疗癌细胞。在一个实施方案中， 所述细胞凋亡的调节是通过细胞凋亡诱导。在多种实施方案中，化合物 的给药可以是同时的，或者依次的。

因此，本发明提供了用于增强的方法，不是基于作用于单一途径中 的两个靶标的化合物，而是通过差异性作用于同一蛋白质上的两种化合 物。在细胞凋亡的过程中，通过蛋白水解作用将酶原半胱天冬酶-3酶原 激活为半胱天冬酶-3，并且接着该活性半胱天冬酶-3将很多细胞底物裂 解，从而执行了所述细胞凋亡程序。因为半胱天冬酶-3酶原蛋白质水平 在多种肿瘤组织学中升高，作为一种选择性抗癌策略，药物介导的对半 胱天冬酶-3酶原的直接激活可能是高度有效的。

到目前为止，已经公开了两类在体外增强半胱天冬酶-3酶原的活 性和自我成熟并在培养的癌细胞中诱导细胞凋亡的化合物。半胱天冬酶 酶原激活的化合物-1(PAC-1，图1)通过抑制性锌离子的螯合来增强 半胱天冬酶-3酶原的活性，在培养的癌细胞中诱导细胞凋亡，并对多种 鼠肿瘤模型中具有效力。最近，发现化合物1541和1541B(图1)在体 外促进半胱天冬酶-3酶原自我成熟为半胱天冬酶-3并且发现其诱导培 养的癌细胞的凋亡性死亡(Wolan et al.，Science326，853-858(2009))。 所述1541/1541B化合物似乎通过在开关状态平衡中的结合-诱导变换或 通过纳米纤维的形成来激活半胱天冬酶-3酶原，具有可能依赖于化合物 浓度和在其中评估半胱天冬酶-3酶原的系统的复杂性的精确机制。 PAC-1和1541/1541B通过不同的生化机制发挥它们各自对半胱天冬酶 -3酶原的激活效应，表明了在体外、在细胞培养物和在体内的协同作用 的潜力。

治疗剂与活性

如图1所示，PAC-1(2-(4-苄基哌嗪-1-基)-N-[(2-羟基-3-丙-2- 烯基-苯基)亚甲基氨基]乙酰胺)，在癌细胞中选择性诱导细胞凋亡。制 备PAC-1的方法记载于美国专利公布文本2012/0040995(Hergenrother  et al.)。

被称为化合物1541和1541B的药物(以下方案1)可用于诱导半 胱天冬酶-3酶原的自我成熟，其通过诱导增强酶原的潜在活性的半胱天 冬酶-3酶原的“开启-状态”构象、或通过诱导一种使半胱天冬酶-3酶 原成为更好的自我成熟的底物的构象来诱导半胱天冬酶-3酶原的自我 成熟。所述化合物也可以通过结合在1541B纳米纤维上来提高局部浓度 以促进半胱天冬酶-3酶原裂解。

方案1.式(I).

作为协同研究的前奏，进行研究以阐明1541B如何诱导半胱天冬酶 -3酶原的自我成熟。为了进一步阐明该机制，使用了其中三个蛋白水解 裂解位点(D9、D28、D175)被突变为丙氨酸(D9A/D28A/D175A或 ″D₃A″突变型蛋白质)的半胱天冬酶-3酶原的突变体。这种D₃A的“不 可裂解的”形式完全耐受自动加工和通过成熟的半胱天冬酶进行的加 工。由于D₃A突变体受限于酶原形式，故其仅可充当酶，而不能充当 半胱天冬酶底物。之前已经使用D₃A突变体以显示半胱天冬酶-3酶原 本身具有潜在的酶活性，尽管比半胱天冬酶-3低200倍(Bose et al.， Biochemistry42，12298-12310(2003))。在用1541B孵育时，如所预期的， 野生型半胱天冬酶-3酶原被激活，但是1541B对D₃A没有作用(图2)， 表明1541B不增强半胱天冬酶-3酶原的内在酶活性。

之前仅在没有锌的条件下对化合物1541B在体外对半胱天冬酶-3 酶原的激活效应进行了评估，而PAC-1通过抑制性锌的螯合增强了半 胱天冬酶-3酶原与D3A两者的催化活性。由于锌与半胱天冬酶-3酶原 共定位并且抑制其在细胞中裂解成活性形式，因此确定1541B是否能在 低浓度的锌的存在下激活半胱天冬酶-3酶原是令人感兴趣的。如图3 所示，锌的加入完全阻止了1541B在体外激活半胱天冬酶-3酶原的能 力。但是，加入PAC-1使得1541B再次激活半胱天冬酶-3酶原(图4)， 显示了1541B的PAC-1-介导的增强作用。

为了检验PAC-1是否类似地增强培养的癌细胞中半胱天冬酶-3酶 原的1541B-介导的激活作用，用PAC-1和1541B的结合物处理一组癌 细胞系，并用荧光半胱天冬酶底物Ac-DEVD-AFC监测细胞裂解物的半 胱天冬酶-3/-7的活性。如图5A所示，共治疗导致比单独的PAC-1或 1541B显著更快和更急剧增加的DEVDase的裂解；所述结合物诱导了 半胱天冬酶活性，该活性相当或超过了星孢菌素(STS，1μM)诱导的 半胱天冬酶活性。U-937(人类淋巴瘤)、A-549(人类肺癌)和BT-549 (人类乳腺癌)的裂解物的DEVDase活性示于图5A中，并且获得了 HL-60(人白血病)、Jurkat(人白血病)、Hs578T(人乳腺癌)和EL4 (犬淋巴瘤)细胞系的类似数据。

为了确定DEVDase活性的提高是否是由化合物共治疗所促进的半 胱天冬酶-3酶原向半胱天冬酶-3的裂解增强的结果，通过蛋白印迹对用 PAC-1和1541B结合物处理的细胞进行了评估。如图5B所示，在用 PAC-1和1541B结合物处理时，在U-937、A549和BT-549细胞系中观 察到半胱天冬酶-3酶向半胱天冬酶-3的急剧激活，而在所评估的时间和 浓度下，用1541B或PAC-1单独处理时观察到低的半胱天冬酶-3酶原 激活/没有观察到半胱天冬酶-3酶原激活。HL-60、EL4、Hs578T和 Jurkat细胞中的类似结果示于图6A-D中。

由于半胱天冬酶-3酶原向半胱天冬酶-3的裂解是细胞凋亡中主要 事件之一，因此对PAC-1和1541B结合物在培养的多种癌细胞系中诱 导凋亡性死亡的能力进行了评估。在短期孵育时间里进行了这些评估， 反映出在图5中观察到的半胱天冬酶激活的时机，其中没有化合物作为 单独实体试剂而发挥显著的效应。PAC-1显著增强了1541B的促凋亡活 性，对此使用Annexin V/碘化丙啶染色法通过流式细胞术进行了评估 (U-937、HL-60和Jurkat的悬浮细胞系)，或通过磺酰罗丹明B染色 法对贴壁细胞系(A549和BT549)中的细胞死亡进行了评估。U-937、 A549和BT-549细胞的细胞死亡数据示于图7中。HL-60、Hs578T、 U-87和EL4的细胞死亡数据示于图8A-D中。Jurkat、EL4、HL-60、 A549和BT549细胞的细胞死亡数据示于图9A-E中。各图表中的虚线 代表药物结合物的PAC-1和1541B的累加效应。

用泛-半胱天冬酶抑制物Q-VD-OPh阻断PAC-1/1541B结合物的促 凋亡效应，与细胞死亡模型中涉及半胱天冬酶的情况一致(图10)。为 了进一步调查半胱天冬酶-3酶原的激活与由药物结合物诱导的细胞死 亡之间的关系，使用了MCF-7细胞——不表达半胱天冬酶-3酶原的细 胞系。PAC-1/1541B的结合物对MCF-7细胞(MCF-7VRL)具有很小 的效应，但对通过质粒(MCF-7C3)表达半胱天冬酶-3酶原的MCF-7 细胞有显著的促凋亡效应。参见图11A-C。

如上所讨论的，化合物1541B不通过与PAC-1和相关化合物的作 用模式相同的的锌螯合机制来激活半胱天冬酶-3酶原。而1541通过变 构结合和激活机制来起作用。如U-937和EL4肿瘤细胞系所证明的， 还发现PAC-1和1541B的结合物是用于治疗淋巴瘤和白血病的协同结 合物。PAC-1被证明与两种淋巴瘤/白血病细胞系中的1541B协同作用， 其中在用化合物的结合物治疗时的细胞死亡百分比显著大于基于单纯 累加效应所预期的(图12)。蛋白印迹分析证明，用所述结合物实现了 更高水平的半胱天冬酶3激活(图13)，并且与图14中显示出的机制 一致。

为了探索此双重半胱天冬酶-3酶原激活策略的治疗用途，在鼠肿瘤 模型中检验了PAC-1和1541B的结合物。由于PAC-1和1541B协同诱 导EL4细胞系的显著的细胞死亡，选择了EL4同系模型，并且由于肿 瘤的快速生长，该模型是一种挑战性的治疗模型。

用单独的PAC-1(125mg/kg)、单独的1541B(17.5mg/kg)、和 PAC-1+1541B(分别是125mg/kg和17.5mg/kg)连续三天，一天一 次处理植入有EL4(鼠淋巴瘤)细胞的C57/BL6小鼠。所选的剂量基 于最大耐受剂量(MTD)研究(参见MTD研究的表1和2)。

表1.1541B MTD研究。

表2.结合物MTD研究。

8天以后，当媒介物-治疗的小鼠中的肿瘤已达到最大尺寸(～1500 mm³)时，处死所有的小鼠，切除肿瘤并称重。如图15所示，在此模 型中，1541B治疗对肿瘤生长不具有作用，并且PAC-1治疗对肿瘤生 长只具有很小的作用。但是，PAC-1和1541B的结合物显著延缓了肿 瘤生长。

虽然使用作用于不同靶标的药物的结合物对抗癌策略有明显好处， 本文所述的工作证实了使用在同一生物靶标上通过不同机制起作用的 化合物可观察到显著的协同作用。当探寻酶的激活作用时，多靶向方法 可能具有特别的优势。如在体外所示，在锌存在时1541B不能激活半胱 天冬酶-3酶原，但加入PAC-1使得1541B再次发挥其效应。PAC-1螯 合来自半胱天冬酶-3酶原的不稳定的抑制性锌，因而引发此酶原被 1541B有力且有效地激活。

类似地，在细胞培养物中在6-12小时时没有化合物具有显著的细 胞死亡效应，但是使用PAC-1/1541B结合物则观察到细胞死亡的急剧 增加(大于累加效应)。如蛋白印迹和细胞裂解物中的半胱天冬酶-3 酶活性所示，这种细胞死亡依赖于PAC-1/1541B诱导半胱天冬酶-3酶 原快速转变为半胱天冬酶-3的能力。

PAC-1在哺乳动物中是安全的，并且PAC-1的一种衍生物在具有 淋巴瘤的宠物狗的I期临床试验中是有效的(Peterson et al.，Cancer  Res70，7232-7241(2010))，因此所观察到的与1541B的协同作用应具 有显著的临床影响。对用小分子来激活酶的兴趣正在快速提升。本文所 述的数据表明使用具有不同激活机制的两种小分子的靶向策略是用于 急剧增强预期生物学效应的通用方法，并且由于其效力应该具有相当大 的临床影响。

本发明的方法

本发明提供了在癌细胞中选择性诱导细胞凋亡的方法，所述方法包 括对癌细胞给予能够修饰所述癌细胞的半胱天冬酶-3酶原分子的化合 物的结合物；其中所述化合物的结合物是PAC-1和式I的化合物(例 如，化合物1541或化合物1541B)。还提供了在癌细胞中选择性诱导 细胞凋亡的方法，所述方法对癌细胞给予能够修饰所述癌细胞的半胱天 冬酶-3酶原分子的化合物的结合物；其中所述化合物的结合物是PAC-1 和式I的化合物(例如，化合物1541或化合物1541B)，其中所述癌 细胞在需要治疗的患者中。

本发明还提供了其他方法，其中所述化合物的结合物为PAC-1和 式I的化合物(如化合物1541或化合物1541B)。因此，本发明还提 供了处理癌细胞的方法，所述方法包括(a)鉴定对用半胱天冬酶酶原 激活剂化合物处理癌细胞的潜在敏感性；和(b)将癌细胞暴露于有效 量的半胱天冬酶酶原激活剂化合物的结合物。还提供了处理癌细胞的方 法，所述方法包括(a)鉴定对用半胱天冬酶酶原激活剂化合物处理癌 细胞的潜在敏感性；(b)将所述癌细胞暴露于有效量的半胱天冬酶酶 原激活剂化合物的结合物；其中所述半胱天冬酶酶原激活剂化合物能够 激活半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7中的至少一种。还提供了在癌细胞中 诱导死亡的方法(例如杀死癌细胞)，所述方法包含对癌细胞给予能够 激活所述癌细胞的半胱天冬酶-3酶原分子的化合物的结合物。

本发明还提供了包含有效量的PAC-1和式I的化合物的结合物的药 物。所述药物可被用于在细胞中诱导细胞凋亡的方法中。在一些实施方 案中，所述化合物的结合物在患者体内不穿过血脑屏障以达到引起明显 的神经毒性效应的程度。本发明的方法包括在体内或体外使一种或多种 细胞与有效量的本文所述的化合物的结合物接触。因此，本发明还提供 了处理细胞的方法，包括使细胞与有效量的本文所述的化合物的结合物 接触。

定义

如本文中所使用的，所列举的术语具有以下含义。本说明书使用的 所有其他术语和短语具有如本领域技术人员会理解的其普通的含义。所 述普通含义可通过参考技术字典获得，如Hawley’s Condensed  Chemical Dictionary第14版，by R.J.Lewis，John Wiley&Sons，New  York，N.Y.，2001。

说明书中提到的“一个实施方案”、“实施方案”等，表示所述的实 施方案可包括具体的方面、特征、结构、部分或特性，但不是每个实施 方案必须包括所述方面、特征、结构、部分或特性。而且，这样的短语 可以，但是不是必须，指的是本说明书中其他部分提及的同一实施方案。 而且，当与一个实施方案一起描述具体的方面、特征、结构、部分或特 性时，不管是否明确描述，本领域的技术人员会知晓所述方面、特征、 结构、部分或特性影响其他实施方案或与其他实施方案结合。

除非上下文中另有明确说明，单数形式“一个”(“a”，“an”)和“所 述”(“the”)包括复数指代对象。因此，例如，提到“化合物”表示包 括多个这种化合物，使化合物X包括多个化合物X。还要注意，可起草 权利要求以排除任何任选要素。因此，本声明旨在充当使用排他性术语 的先行基础，如“单独地”、“仅”等等，与权利要求要素的列举或“否 定性”限定的使用有关。

术语“和/或”意指与该术语相关的所述项中的任何一项、所述项 的任何组合、或所述项的所有项。短语“一个或多个”是本领域普通技 术人员很容易理解的，尤其是在其使用的上下文中读到时。例如，苯环 上的一个或多个取代基是指一到五个、或一到四个，例如如果该苯环被 双取代。

术语“约”可指具体指明的数值的±5％、±10％、±20％、或±25％ 的变化。例如，“约50”百分比在一些实施方案中可具有45到55百分 比的变化。对于整数范围，术语“约”可包括比在所述范围两端所列举 的整数多和/或少一个或两个整数。除非本文另有说明，术语“约”意 欲包括接近所述范围的数值(例如重量百分比)，所述数值就单独成分、 组合物或实施方案的功能而言是等价的。

技术人员会理解，所有的数目，包括那些表示成分、特性如分子量、 反应条件等的量，都是近似值并且理解为在所有情况下任选被术语“约” 修饰。这些值可取决于本领域的普通技术人员利用本说明书的教导而得 到的所寻求的所需特性而不同。还可以理解，这样的数值固有地包含由 它们各自的测试测量中存在的标准偏差所必然造成的变量。

本领域技术人员会理解，出于任何和所有目的，特别是在提供书面 说明方面，本文所述的所有范围还包含任何和所有的可能的子范围和其 子范围的组合，以及组成所述范围的单个数值，尤其是整数值。列举的 范围(例如重量百分比或碳基团)，包括所述范围内各个具体的数值、 整数、小数或恒等式。任何列出的范围可容易地被认为充分说明并使得 同一范围能被分解为至少两等份、三等份、四等份、五等份或十等份。 作为非限制性实例，本文所述的每个范围可被轻易地分解为下三分之 一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还会理解，所有的语 言如“最高达”、“至少”、“大于”、“小于”、“多于”、“或更多”等都包 括列举的数字并且所述术语是指随后可被分解为如上所述的子范围的 范围。以同样的方式，本文列举的所有比例也包括落在更宽比例中的所 有子比例。因此，为基团、取代基和范围所列举的具体数值仅用于说明； 它们不排除其他限定的数值或为基团和取代基所限定的范围内的其他 数值。

本领域普通技术人员还会很容易地理解，以常用的方式将成员分组 在一起，如马库氏(Markush)基团，本发明不仅包含作为整体列举的 整个组，还独立地包含组的每个成员和主要组的所有可能的亚组。另外， 出于所有目的，本发明不仅包含主要组，还包含缺少一个或多个组成员 的主要组。因此本发明设想明确排除所述组的任何一个或多个成员。因 此，限制性条件可以用于所公开的类别或实施方案中的任何一个，由此， 可将所列举的要素、种类、或实施方案中的任何一个或多个从所述类别 或实施方案中排除(例如，如在明确的否定限制中使用的)。

术语“接触”是指接触、使接触、或使其非常或极为接近的行为， 包括在细胞或分子水平上，例如，在溶液中、在反应混合物中、在体外、 或在体内引起生理反应、化学反应、或物理变化。

“同时”意指(1)时间上同时地，或(2)在常规治疗方案过程中 的不同时间。

“依次”是指给予所述方法中使用的一种活性剂后给予另一种活性 剂。在给予一种活性剂后，可在第一种之后立刻给予下一种活性剂，或 者可在给予第一种活性剂后的有效时间段之后给予下一种活性剂；有效 时间段是用于从第一种活性剂给予中实现最大效益而给出的时间量。

“有效量”是指治疗疾病、障碍和/或病症，或带来所述效果(如 激活或抑制)的有效量。例如，有效量可以是降低正被治疗的病症或症 状的进展或严重性的有效量。确定治疗有效量在本领域技术人员的能力 范围之内。术语“有效量”意欲包括本文所述化合物的量，或本文所述 化合物的结合物的量，例如，在宿主中治疗或预防疾病或障碍，或治疗 疾病或障碍的症状的有效量。因此，“有效量”一般意指提供了所需效 应的量。在一个实施方案中，有效量是指本文所述的活性剂在单独或与 药物载体结合时以单剂量或多剂量给药至细胞或受试者(例如患者)时 抑制生长或增殖、诱导杀死、或预防过度增殖性细胞的生长的有效量。 这种生长抑制或杀死可以表现为受试者存活的延长(例如患者的存活超 出无此治疗时所预期的)，或相对于无此治疗时受试者预后的任何改善。

术语“治疗”包括(i)预防疾病、病理学或医学病症的发生(例如， 预防)；(ii)抑制疾病、病理学或医学病症或阻止其发展；(iii)缓解疾 病、病理学或医学病症；和/或(iv)减少与疾病、病理学或医学病症相 关的症状。因此，术语“治疗”可延伸到预防，可包括预防、降低、阻 止或逆转正被治疗的病症或症状的进展或严重性。因此，如果合适，术 语“治疗”可包括医用的、治疗的、和/或预防的给药。在一些实施方 案中，术语“处理”可指(i)预防肿瘤生长或肿瘤再生(预防)，(ii)减 少或消除目感兴趣的疾病或症状(治疗)或(iii)消除或破坏肿瘤(治 愈)。

术语“抑制”是指减缓、停止或逆转疾病、感染、病症或细胞群的 生长或进展。例如，与无治疗或接触时发生的生长或进展相比，所述抑 制可大于约20％、40％、60％、80％、90％、95％或99％。此外，术 语“诱导”、“抑制”、“增强”、“提高”、“增加”、“降低”等表示两种状 态间的定量差异，并且可指两种状态之间的至少统计学上显著的差异。 例如，“有效抑制过度增殖性细胞的生长的量”意指在一些实施方案中， 细胞的生长速度可至少在统计学上显著不同于未处理的细胞。例如，这 些术语在本文可被应用于例如增殖的速率。

短语“抑制过度增殖性细胞(例如肿瘤细胞)的生长或增殖”，是 指减缓、中断、阻止或终止该细胞的生长和转移，并且不一定表示完全 消除肿瘤生长。

术语“癌症”通常是指由异常细胞不受控制的生长所引起的一组超 过100种疾病中的任意一种。癌症可采取实体瘤和淋巴瘤，和非实体癌 症如白血病的形式。与复制直到成熟然后只在需要时才取代受损细胞的 正常细胞不一样，癌细胞可无休止地生长和分裂，排挤附近的细胞并且 最终扩散到身体的其他部分。

本发明提供了治疗癌症和癌性病症的方法。术语“癌性病症”涉及 其中细胞处于异常状态的任何病症或由快速增殖或肿瘤形成所表征的 病症。癌性病症在本质上可以是恶性的或非恶性的(例如癌前病症)。 为了进一步描述“癌性病症”，可使用术语“过度增殖的”、“增生的”、 “增生”、“恶性的”、“肿瘤的”和“肿瘤形成”。这些术语可互换使用 并意指包括所有类型的过度增殖性生长、增生生长、癌性生长或致癌过 程、肿瘤转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不考虑组织病理 学的类型、侵染的阶段、或癌性测定(例如恶性的和非恶性的)。

术语“肿瘤形成”是指导致对正常生长控制丧失响应性的新的细胞 生长，如肿瘤细胞生长。“增生”是指经历异常高的生长速率的的细胞。 然而，这些术语可互换使用，如它们的内容所揭示的，通常是指正在经 历异常的细胞生长速率的细胞。“肿瘤形成”和“增生”包括肿瘤，所 述肿瘤可能是良性的、癌变前的、原位癌、恶性的、实体的或非实体的。 在本发明范围内的一些癌性病症的实例包括，但不限于，肛门癌、转移 性细胞膀胱癌、骨癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、 卡波西肉瘤、白血病、肺癌如原发性支气管肺癌、小细胞肺癌、和非小 细胞肺癌、霍杰金淋巴瘤、非霍杰金淋巴瘤、恶性淋巴瘤、成神经细胞 瘤、成骨癌(如骨癌)、眼癌(如视网膜母细胞瘤和其他眼癌)、卵巢癌， 前列腺癌、肾癌、皮肤癌如黑素瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌和维尔姆斯 肿瘤。在本发明范围内的非恶性过度增殖性病症的其他实例包括，但不 限于，腺癌、软骨瘤、内生软骨瘤、纤维瘤、肌瘤、粘液瘤、神经鞘瘤、 成骨细胞瘤、成骨软骨细胞瘤、骨瘤、乳头状瘤等。

术语“白血病”或“白血病性癌”是指造血和免疫系统(血液和淋 巴系统)的所有癌症或肿瘤形成。这些术语是指成血器官的进行性的、 恶性疾病，以血液和骨髓中的白细胞及其前体的异常增殖和发育为标 志。骨髓瘤是指其他类型的血液和骨髓细胞的肿瘤。淋巴瘤是指淋巴组 织的肿瘤。白血病的实例包括急性骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴 细胞性白血病(ALL)和慢性髓细胞性白血病(CML)。

药物制剂

可将本文所述的化合物用于制备治疗性药物组合物，例如，通过将 所述化合物与可药用的稀释剂、赋形剂或载体结合。可将所述化合物加 到盐或溶剂化物形式的载体中。例如，在化合物具有足够的碱性或酸性 以形成稳定的无毒性酸盐或碱盐的情况下，作为盐的化合物的给予可能 是合适的。可药用的盐的实例是与形成生理上可接受的阴离子的酸所形 成的有机酸加成盐，例如，甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、 丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸 盐和β-甘油磷酸盐。也可形成适合的无机盐，包括氢氯化物、卤化物、 硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。

可使用本领域熟知的标准方法获得可药用的盐，例如，通过使足够 碱性的化合物(例如胺)与合适的酸反应以提供生理上可接受的离子化 合物。也可通过类似的方法制备羧酸的碱金属(例如，钠、钾或锂)或 碱土金属(例如钙)盐。

可将本文所述的化合物制成药物组合物并将其以多种形式给予哺 乳动物宿主(例如人类患者)。所述形式尤其适于所选择的给药途径， 所述途径例如口服或胃肠外给药，通过静脉内、肌肉内、局部或皮下途 径。

可将本文所述的化合物与可药用的载体(如惰性稀释剂或可吸收的 食用载体)结合来全身给药。可通过使用环糊精(例如2-羟丙基-β-环 糊精)来提高活性物质的溶解度。对于口服给药，可将化合物包封在硬 壳或者软壳明胶胶囊中，压缩成片剂、或直接掺入到患者饮食的食物中。 化合物也可与一种或多种赋形剂结合，并以可吸收的片剂、口含片、锭 剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、薄片剂等形式使用。这样的组合物 和制剂通常包含至少0.1％的活性化合物。所述组合物和制剂的百分比 可以改变并且可方便地为给定的单位剂量形式的重量的约1％到约 60％，或约2％到约25％。活性化合物在这种治疗有效的组合物中的量 使得可获得有效的剂量水平。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等也可包含下面的一种或多种：粘合剂 如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸氢钙；崩解剂如 玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁。可以添加甜味 剂如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或调味剂如薄荷、冬青油、或樱桃 调味剂。当所述单位剂型是胶囊时，除了上述类型的材料，其可能还包 含液态载体如植物油或聚乙二醇。多种其他材料可能作为涂层存在或者 另外用于修饰固体单位剂型的物理形式。例如，可用明胶、蜡、紫胶或 糖等涂覆片剂、丸剂或胶囊剂。糖浆剂或酏剂可包含活性化合物、作为 甜味剂的蔗糖或果糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸 丙酯、染料和调味香料如樱桃或甜橙香料。用于制备任何单位剂型的任 何材料应为可药用的并且所用的量基本无毒性。此外，可将活性化合物 掺入到缓释制剂和设备中。

可通过输注或注射将活性化合物静脉内或腹腔内给药。可在水中制 备活性化合物或其盐的溶液，任意地与无毒的表面活性剂混合。可在甘 油、液体聚乙二醇、三乙酸甘油酯或其混合物，或在可药用的油中制备 分散剂。在正常的存储和使用的条件下，制剂可包含防腐剂以防止微生 物的生长。

适用于注射或输注的药用剂型可包括含有活性组分的无菌水溶液、 分散剂或无菌粉末，所述活性成分适用于无菌的可注射的或可输注的溶 液或分散剂的即用制剂，任选地被包封在脂质体中。最终的剂型在生产 和储藏的条件下应该是无菌的、流体的和稳定的。所述液体载体或媒介 物可能是溶剂或液体分散介质，其包含例如，水、乙醇、多元醇(例如， 甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒性甘油酯、和它们合 适的混合物。例如，可通过形成脂质体、通过在分散剂的情况下维持所 需的颗粒大小、或通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可通过多 种抗菌剂和杀真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨 酸、乙基汞硫代水杨酸钠等)来预防微生物活动。在很多情况中，优选 包括等渗剂，例如糖、缓冲液或氯化钠。可通过药剂延迟吸收(例如单 硬脂酸铝和/或明胶)来引起可注射的组合物的延长的吸收。

可通过将合适溶剂中的活性化合物以所需量与以上列举的各种其 他成分整合(根据需要，任选随后进行过滤灭菌)来制备无菌的可注射 溶液。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法可 包括真空干燥和冷冻干燥技术，其产生之前无菌过滤的溶液中存在的活 性成分和任何其他所需成分的粉末。

通过比较本文所述化合物在动物模型中的体外活性和体内活性来 确定它们的有用剂量。将小鼠和其他动物中的有效剂量外推至人类的方 法是本领域已知的；例如，参见美国专利4,938,949(Borch et al.)。用 于治疗所需的化合物、或其活性盐或衍生物的量不仅会随着所选择的具 体化合物或盐而改变，还随着给药途径、正被治疗的病症的性质、以及 患者的年龄和状况而改变，并且最后听凭主治医师或临床医生的决定。

化合物的结合物可方便地以单位剂型给予，例如，每单位剂型包含 100-5,000mg/m²、300-4,000mg/m²、370-3,700mg/m²、50-750mg/m²、 或750-4,000mg/m²的活性成分。每个化合物也可单独或组合地以约1 mg/kg-约250mg/kg、约10mg/kg-约100mg/kg、约10mg/kg-约50 mg/kg、约50mg/kg-约100mg/kg、约10mg/kg-约50mg/kg、或约10 mg/kg、约25mg/kg、约50mg/kg、约75mg/kg、约100mg/kg、或约 150mg/kg，或从上述值中任何一个到上述值中任何其他一个的范围给 药。还可将所述化合物给予受试者以提供单独或组合的约1μmol/L-约 25μmol/L、或约10μmol/L、或约15μmol/L的稳定-状态血浆浓度的药 物。

在一些实施方案中，本发明提供了约10nM到约100μM的有效浓 度的化合物。在另一个实施方案中，有效浓度从约200nM到约50μM， 约500nM到约40μM，约750nM到约25μM，约1μM到约20μM， 或约1μM到约10μM。在另一个实施方案中，有效浓度被认为是一个 值，如在直接的半胱天冬酶酶原激活试验中、细胞凋亡诱导试验中、或 动物临床治疗评估中的50％的活性浓度。在一个实施方案中，所述值 小于约200μM。在另一个实施方案中，所述值小于约10μM，但大于 约10nM。所需剂量可方便地以单一剂量存在，或作为以合适的间隔给 药的分开剂量(例如，每天两个、三个、四个或更多个子剂量)存在。 所述子剂量本身可被进一步分成，例如，很多离散松散间隔的给药。

本文所述的化合物可以是有效的抗肿瘤剂并且与任何单一药剂的 给药相比具有更高的效力和/或降低的毒性。本发明提供在哺乳动物中 治疗癌症的治疗方法，所述方法包括将本文所述的有效量的化合物或组 合物给予具有癌症的哺乳动物。哺乳动物包括灵长类动物、人类、啮齿 动物、犬、猫、牛、羊、马、猪、山羊、牛等。癌症是指任何多种类型 的恶性肿瘤，例如，本文所述的其中的结肠癌、乳腺癌、黑素瘤和白血 病，并且通常癌症由不需要的细胞增殖(例如不受调控的生长、分化的 缺乏、局部组织侵入、和肿瘤转移)来表征。

可通过使用本领域熟知的试验来确定本发明化合物治疗癌症的能 力。例如，治疗方案的设计、毒性评估、数据分析、肿瘤细胞杀死数量、 以及使用可移植肿瘤筛选的生物意义都是已知的。另外，可使用上述以 及本文引用的文献和专利文件中的实验来确定化合物治疗癌症的能力。

本发明还提供化合物的前药形式。会在体内被转化以提供PAC-1 或式I的化合物的任何化合物都是前药。形成前药的多种方法是本领域 熟知的。前药和制备它们的方法的实例存在于，尤其是，Design of  Prodrugs，由H.Bundgaard编辑，(Elsevier，1985)，Methods in  Enzymology，Vol.42，at pp.309-396，由K.Widder，et.al.编辑(Academic  Press，1985)；A Textbook of Drug Design and Development，由 Krosgaard-Larsen and H.Bundgaard编辑，Chapter 5，″Design and  Application of Prodrugs，″by H.Bundgaard，at pp.113-191，1991)；H. Bundgaard，Advanced Drug Delivery Reviews，Vol.8，p.1-38(1992)；H. Bundgaard，et al.，Journal of Pharmaceutical Sciences，Vol.77，p.285 (1988)；and Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A Biochemical  Approach，Oxford University Press，New York，pages 388-392)。

另外，在一些实施方案中，可将PAC-1替换为PAC-1衍生物或其 他抑制剂，如记载于美国专利7,632,972(Hergenrother et al.)、美国专 利公布文本2012/0040995(Hergenrother et al.)和2007/0049602 (Hergenrother et al.)，以及美国申请序列号12/597,287(Hergenrother et  al.)中的化合物。可与本文公开内容结合使用的用于癌症治疗的有用的 化合物、方法和技术记载于上述文件、以及美国专利6,303,329 (Heinrikson et al.)、6,403,765(Alnemri)、6,878,743(Choong et al.)和 7,041,784(Wang et al.)、和美国专利公布文本2004/0180828(Shi)中。

如Putt et al.，Nature Chemical Biology2006，2(10)，543-550； Peterson et al.，J.Mol.Biol.2009，388，144-158；和Peterson et al.，Cancer  Res.2010，70(18)，7232-7241所记载的，可进行用于执行测试和评价癌 细胞系的方法。

以下实施例意欲说明以上发明并不应被理解为缩小它的范围。本领 域技术人员会很容易地意识到实施例暗示了可实施本发明的许多其他 方法。应理解，可以做出许多改变和修改，但是仍在本发明的范围内。

具体实施方式

实施例1.药物剂型

以下制剂举例说明了代表性的可用于本文所述的组合化合物、或其 可药用的盐或溶剂化物的治疗或预防性给药的药用剂型(下文称为“化 合物X”)：

可用药学领域中公知的常规方法制备这些制剂。可以理解，可根据 公知的制药技术将上述药物组合物进行改变以容纳不同的量和类型的 活性成分“化合物X”。气溶胶制剂(vi)可与标准的、计量剂量气溶 胶分配器联用。另外，具体的成分和比例用于说明性目的。根据所需的 目的剂型的特性，可将成分换成适当的等价物并且可改变比例。

当参考公开的实施方案和实施例如上描述具体的实施方案时，这样 的实施方案只是说明性的，并不限制本发明的范围。可根据本领域普通 技术人员做出改变和修饰，而不背离如下面的权利要求中所定义的具有 更宽泛方面的本发明。

所有的出版物、专利和专利文件均通过引用的方式纳入本文，尽管 通过引用单独纳入。与本公开内容不一致的限定不应理解为来自本公开 内容。参考各种具体的和优选的实施方案和技术对本发明进行了描述。 但是，应理解可在本发明的精神和范围内做出很多改变和修改。