一种以离子液体作为绿色介质酶催化拆分DL-薄荷醇的方法

摘要

一种以离子液体作为绿色介质酶催化拆分DL-薄荷醇的方法，属于生物催化技术领域。本发明包括（1）在DL-薄荷醇和酸酐混合液中加入一定量的脂肪酶和离子液体酶催化拆分DL-薄荷醇；（2）拆分物间隔时间取样在10%碳酸氢钠水溶液和正己烷中，使之萃取完全；反应混合物离心，上层为产品D-薄荷醇和L-薄荷醇的酯，下层为离子液体与酶的混合悬浮液；上层清液取样在正己烷中以乙酸苄酯为内标进行气相色谱分析；（3）在离子液体与酶混合悬浮液中继续加入新鲜底物DL-薄荷醇和酸酐，重复上述步骤，实现酶与离子液体的回收再利用。本发明用于生物拆分DL-薄荷醇，获得D-薄荷醇和L-薄荷醇的酯，反应转化率与对映体过量率高，离子液体与酶可回收再利用，工艺绿色、高效、环保。

说明书

技术领域

本发明涉及一种以离子液体作为绿色介质酶催化拆分DL-薄荷醇的方法，属于生物催化技术领域。

背景技术

L-薄荷醇是天然薄荷油的主要成分，可从天然薄荷油中提取得到。由于具有明显的清凉效果，L-薄荷醇及其酯类化合物已成为重要的香原料，广泛应用于食品、烟草、医药和化妆品等领域（McCoy M. Chemical and Engineering News, 2010, 88: 15-16; Ashley M, Dixon M, Sisodiya A, et al. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2012, 63: 381-390）。近年来，天然提取的L-薄荷醇的产量已无法满足工业需要，而常规化学法合成的大多为外消旋薄荷醇（DL-薄荷醇），用不对称合成法制备L-薄荷醇的工艺又不够成熟，很难找到合适的催化剂，生产成本高。因此，采用化学法合成DL-薄荷醇，再利用生物技术（酶或微生物法）对消旋体进行拆分，这种有机合成与生物催化相结合的生产方法，是获得L-薄荷醇的新途径（Chen H, Wu J P, Yang L R, et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2014, 102: 81-87; 袁毅, 白姝, 姜晓妍.化学工业与工程，2006，23: 480-485）。

离子液体是一种环境友好的绿色溶剂，可替代易挥发性有机溶剂应用于酶催化反应。离子液体具有极低的蒸汽压、不挥发、良好的热稳定性、黏度和密度大等特点，还可以通过改变阴、阳离子的组合来调节其极性、溶解性等性质（Anderson J L, Armstrong D W, Wei G T.  Ionic liquids in analytical chemistry[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(9): 2892-2902）。目前，应用最广的憎水型离子液体是1-烷基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐。然而，此类离子液体仅能改变咪唑环1-位N上的烷基链长，受液程范围小的限制烷基链的碳原子数通常小于8，离子液体的可设计性差。为了克服以上不足，我们采用新型C₂-对称烃基咪唑离子液体（式1）。由于在咪唑环的1,3-位上同时引入两个相同的烃基，利用阳离子与阴离子的更大不对称性扩大了离子液体的液程，并增加了对极性较小的有机化合物的溶解能力。以新型C₂-对称烃基咪唑离子液体为溶剂酶催化拆分DL-薄荷醇，获得了良好的转化率和对映体选择率，明显高于现有技术。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有生物催化拆分DL-薄荷醇技术中转化率较低、对映体选择率较低的不足，提供一种新的以C₂-对称烃基咪唑离子液体作为绿色介质生物拆分DL-薄荷醇的方法。本发明人经过广泛的研究和反复的试验发现，以新型C₂-对称烃基咪唑憎水型离子液体为溶剂，合适的脂肪酶为催化剂，可实现DL-薄荷醇的高效拆分。该方法显著提高了酶在离子液体中的活性与稳定性，反应转化率与对映体过量率高，而且脂肪酶与离子液体重复使用十次后催化活性没有明显减少，可循环使用，绿色环保。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案：一种以离子液体作为绿色介质酶催化拆分DL-薄荷醇的方法：

所述的离子液体为C₂-对称烃基咪唑型离子液体，其阳离子具有式1的结构，其中，R是取代基，R为碳原子数在1-20之间的烷烃、烯烃、炔烃基或芳香基，

式1

而阴离子包括六氟磷酸根离子(PF₆^-)、双三氟甲基磺酰亚胺离子(NTf₂^-)、四氰基硼酸根离子(B(CN)₄^–)、三氟甲基磺酸根离子(CF₃SO₃^–)或甲氧基磺酸根离子(CH₃OSO₃^–)；

所述的C₂-对称烃基咪唑型离子液体是选自式1中的任何一种阳离子与选自上述任何一种阴离子组成的化合物，或其混合物；

所述的酶催化所用酶为脂肪酶，选自褶皱假丝酵母脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶中的任一种，或其混合物。

所述的酸酐，选自乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、安息香酸酐中的任一种。

所述的拆分方法，具体包括以下步骤：

（1）拆分：将0.156 g（1.0 mmol）DL-薄荷醇和1.0 mmol酸酐加入10 mL具塞锥形瓶中，再加入一定量的脂肪酶（30 mg~100 mg）和离子液体（1.0 mL~4.0 mL），混合均匀后置于气浴恒温振荡器中，控制温度为30℃，转速为180 r/min，反应一定时间（6~48 h）；

（2）萃取、检测：间隔时间取样300 μL加入到装有500 μL 10%碳酸氢钠和500 μL正己烷的5 mL离心管中，充分混匀，静置10 min，使之萃取完全；反应混合物在3000 r/min离心15 min，上层为产品D-薄荷醇和L-薄荷醇的酯，而下层为离子液体与酶的混合悬浮液；取100 μL上层清液加入500 μL正己烷中，再加入20 μL内标（乙酸苄酯）后用气相色谱进行分析；

气相色谱条件为：色谱柱为β-DEX120手性气相毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度为200℃，检测器温度为250℃，载气（N₂）流速为2 mL/min；初始柱温100℃，保温5 min，随后以4℃/min升温至150℃，再以2℃/min升温至160℃，保温10 min；

薄荷醇转化率的计算公式如式2所示，其中c代表转化率，P_-和P₊分别代表产物L-薄荷醇的酯和D-薄荷醇的酯在反应混合物中所占的比例，S代表未反应底物的含量；反应的手性选择性由对映体过量率e.e.(_P-)%来表示，计算公式如式3所示：

（3）酶与离子液体的回收再利用：在离子液体与酶的混合悬浮液中继续加入新鲜底物DL-薄荷醇和酸酐，重复步骤（1）和（2），可实现酶与离子液体的回收再利用。

本发明用于生物拆分DL-薄荷醇，获得D-薄荷醇和L-薄荷醇的酯，反应转化率与对映体选择率高，而且，在不分离酶的情况下，可实现离子液体与酶的回收再利用，操作更方便，工艺简便、绿色、高效、环保。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明的有益效果：相比于现有技术，本发明具有以下优点和效果，以C₂-对称烃基咪唑离子液体作为绿色介质生物拆分DL-薄荷醇，获得D-薄荷醇和L-薄荷醇的酯，转化率和对映体过量率高，工艺简便，在不分离酶的情况下，可实现离子液体与酶的回收再利用，绿色环保，具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明

图1实施例4典型的气相色谱分析结果。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例1

将0.156 g（1.0 mmol）DL-薄荷醇、50 mg褶皱假丝酵母脂肪酶、1.0 mmol丙酸酐和1.0 mL 1,3-二仲丁基咪唑双三氟甲基磺酰亚胺盐离子液体依次加入10 mL具塞锥形瓶中，混合均匀后置于气浴恒温振荡器中，控制温度为30 ℃，转速为180 r/min，反应6 h，取样300 μL加入到装有500 μL 10%碳酸氢钠和500 μL正己烷的5 mL离心管中，充分混匀，静置10 min，使之萃取完全。反应混合物在3000 r/min离心15 min，上层为产品D-薄荷醇和L-丙酸薄荷酯，而下层为离子液体与酶的混合悬浮液。取100 μL上层清液加入500 μL正己烷中，再加入20 μL内标（乙酸苄酯）后用气相色谱进行分析，反应转化率42.4%，e.e.值96.1%。

实施例2

将0.156 g（1.0 mmol）DL-薄荷醇、60 mg洋葱假单胞菌脂肪酶、1.0 mmol丁酸酐和2.0 mL 1,3-二丙烯基咪唑四氰基硼酸盐离子液体依次加入10 mL具塞锥形瓶中，混合均匀后置于气浴恒温振荡器中，控制温度为30℃，转速为180 r/min，反应8 h，取样300 μL加入到装有500 μL 10%碳酸氢钠和500 μL正己烷的5 mL离心管中，充分混匀，静置10 min，使之萃取完全。反应混合物在3000 r/min离心15 min，上层为产品D-薄荷醇和L-丁酸薄荷酯，而下层为离子液体与酶的混合悬浮液。取100 μL上层清液加入500 μL正己烷中，再加入20 μL内标（乙酸苄酯）后用气相色谱进行分析，反应转化率48.2%，e.e.值98.1%。

实施例3

将0.156 g（1.0 mmol）DL-薄荷醇、70 mg南极假丝酵母脂肪酶、1.0 mmol安息香酸酐和3.0 mL 1,3-二异戊基咪唑三氟甲基磺酸盐离子液体依次加入10 mL具塞锥形瓶中，混合均匀后置于气浴恒温振荡器中，控制温度为30℃，转速为180 r/min，反应12 h，取样300 μL加入到装有500 μL 10%碳酸氢钠和500 μL正己烷的5 mL离心管中，充分混匀，静置10 min，使之萃取完全。反应混合物在3000 r/min离心15 min，上层为产品D-薄荷醇和L-安息香酸薄荷酯，而下层为离子液体与酶的混合悬浮液。取100 μL上层清液加入500 μL正己烷中，再加入20 μL内标（乙酸苄酯）后用气相色谱进行分析，反应转化率44.7%，e.e.值95.3%。

实施例4

将0.156 g（1.0 mmol）DL-薄荷醇、80 mg褶皱假丝酵母脂肪酶、1.0 mmol丙酸酐和4.0 mL 1,3-二正辛基咪唑六氟磷酸盐离子液体依次加入10 mL具塞锥形瓶中，混合均匀后置于气浴恒温振荡器中，控制温度为30℃，转速为180 r/min，反应20 h，取样300 μL加入到装有500 μL 10%碳酸氢钠和500 μL正己烷的5 mL离心管中，充分混匀，静置10 min，使之萃取完全。反应混合物在3000 r/min离心15 min，上层为产品D-薄荷醇和L-丙酸薄荷酯，而下层为离子液体与酶的混合悬浮液。取100 μL上层清液加入500 μL正己烷中，再加入20 μL内标（乙酸苄酯）后用气相色谱进行分析，反应转化率48.1%，e.e.值98.1%。

典型的气相色谱分析结果如附图1所示。样品保留时间分别为：D-薄荷醇15.383 min，L-薄荷醇15.519 min，L-丙酸薄荷酯18.224 min，D-丙酸薄荷酯18.416 min。

实施例5

将0.156 g（1.0 mmol）DL-薄荷醇、40 mg洋葱假单胞菌脂肪酶、1.0 mmol丁酸酐和3.0 mL 1,3-二乙基咪唑双三氟甲基磺酰亚胺盐离子液体依次加入10 mL具塞锥形瓶中，混合均匀后置于气浴恒温振荡器中，控制温度为30 ℃，转速为180 r/min，反应24 h，取样300 μL加入到装有500 μL 10%碳酸氢钠和500 μL正己烷的5 mL离心管中，充分混匀，静置10 min，使之萃取完全。反应混合物在3000 r/min离心15 min，上层为产品D-薄荷醇和L-丁酸薄荷酯，而下层为离子液体与酶的混合悬浮液。取100 μL上层清液加入500 μL正己烷中，再加入20 μL内标（乙酸苄酯）后用气相色谱进行分析，反应转化率47.9%，e.e.值96.6%。

实施例6

将0.156 g（1.0 mmol）DL-薄荷醇、30 mg南极假丝酵母脂肪酶、1.0 mmol乙酸酐和2.0 mL 1,3-二苯甲基咪唑甲氧基磺酸盐离子液体依次加入10 mL具塞锥形瓶中，混合均匀后置于气浴恒温振荡器中，控制温度为30℃，转速为180 r/min，反应48 h，取样300 μL加入到装有500 μL 10%碳酸氢钠和500 μL正己烷的5 mL离心管中，充分混匀，静置10 min，使之萃取完全。反应混合物在3000 r/min离心15 min，上层为产品D-薄荷醇和L-乙酸薄荷酯，而下层为离子液体与酶的混合悬浮液。取100 μL上层清液加入500 μL正己烷中，再加入20 μL内标（乙酸苄酯）后用气相色谱进行分析，反应转化率40.3%，e.e.值92.0%。