用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器

摘要

本发明属于传感器领域，具体涉及用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器。该传感器包括碳化氮纳米材料、银离子、DNA探针，所述的DNA探针基因为：5'-CCCCCCTGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGACCCCCC-3'；银离子、DNA探针形成发夹结构，在靶分子血管内皮生长因子的诱导下，DNA探针与靶分子结合形成G-四链体结构，银离子释放出来，猝灭碳化氮纳米材料的荧光信号。该荧光生物传感器用于乳腺癌的早期诊断时，对血管内皮生长因子的检测限为3.5 pmol/L，将本发明的荧光生物传感器用于临床应用时，提供了一种更加准确、灵敏、经济、简便、无创的检测新技术，具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于传感器领域，具体涉及用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器。

背景技术

近年来，随着分子生物学等新技术的发展，在肿瘤疾病的研究中，肿瘤标记物的检测已受到许多学者的关注。肿瘤标记物是指肿瘤发生及其增殖过程中由肿瘤细胞合成的、释放或宿主细胞对肿瘤反应而产生的一类物质，常以抗原、酶、激素等代谢产物的形式存在。已有研究发现，乳腺癌的发生和进展过程与血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)有着密切的联系，通过检测它的水平对乳腺癌的监测、判断预后、治疗等有重要的意义。血管内皮生长因子 (VEGF) 是一种重要的调节血管生成的因子，由于肿瘤在生长增殖过程中，促进大量新生血管的形成，由于这些新生血管具有管壁薄和基底膜不完整等生理特点，为肿瘤的浸润和转移提供了基础条件，因此VEGF在肿瘤血管的形成、生长、转移过程中有着重要的作用，是重要的乳腺癌肿瘤标记物之一。常用的检测方法是酶联免疫法，但是这种方法存在着具有成本高，操作繁琐等缺点，因此有必要寻找一种更加准确、灵敏、经济、简便、无创的检测新技术来检测这一肿瘤标记物。

核酸适体(aptamer)是通过一种指数富集配体系统进化技术（SELEX）经体外筛选所到的寡聚核苷酸，它是一种单链的DNA或RNA，具有类似于抗体的功能，能识别特异性的靶分子，例如蛋白质、小分子、甚至整个细胞等。由于核酸适体具有分子量小、易于修饰和标记、化学稳定性、靶标分子范围广好等优点，科研工作者们开始对基于核酸适体的生物传感器进行了大量的研究，发现它在生物医学领域的研究和临床诊断显示出很好的应用前景。特别是Ronit Freemand等人筛选出VEGF的核酸适体并将其应用在生物传感器的研制上，为肿癌标记物VEGF高灵敏度检测提供了一种新的思路。

下面所述的为本发明人率先将具有简便、灵敏、经济等优点的荧光生物传感器用于快速检测乳腺癌中血管内皮生长因子，并设计出一种测定乳腺癌蛋白的荧光生物传感器：当靶分子VEGF不存在时，DNA探针与银离子结合形成发夹结构，碳化氮纳米材料的荧光信号不受影响；当靶分子VEGF存在时，DNA探针与VEGF结合形成G-四链体结构，探针的发夹结构被打开，银离子释放出来，猝灭碳化氮纳米材料的荧光信号。通过DNA探针对VEGF的识别作用，从而建立了高灵敏度、高特异性的乳腺癌蛋白检测方法，有望应用于乳腺癌的早期诊断及筛选抗肿瘤新药工作中，因而本发明具有巨大的潜在应用价值和深远的意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器。该荧光生物传感器制备方法简单，所制得的传感器用于乳腺癌的检测时，灵敏度高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器，包括碳化氮纳米材料、银离子、DNA探针，所述的DNA探针基因为：5'-CCCCCCTGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGACCCCCC-3'；其中基因片段5'-TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGA-3'是VEGF的核酸适体部分，可在VEGF存在时折叠成G-四链体结构；银离子、DNA探针混合反应形成发夹结构，加入到碳化氮纳米材料溶液中，测其荧光；然后该体系在靶分子血管内皮生长因子的诱导下，DNA探针与靶分子结合形成G-四链体结构，发夹结构打开，银离子被释放出来，猝灭碳化氮纳米材料的荧光信号。

一种制备如上所述的用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器的方法，包括以下步骤：

1）碳化氮纳米材料的制备：将2 mL甲酰胺置于微波管中，160~180℃下反应30 min，用双蒸水洗3~4遍，真空干燥8 h后，用去离子水溶解，超声剥离24 h；将得到的液体以15000 r/min 离心1 h，取上清液得碳化氮纳米片混悬液；

2）将10 μL 10 mmol/L的硝酸银溶液和50 μL 1 μmol/L的探针基因混合，并加入3-吗啉丙磺酸缓冲液稀释至100 μL，混匀，反应1 h；

3）将步骤2）的混合体系加入到900 μL 的碳化氮纳米片溶液中，混匀，检测其荧光强度，即得荧光传感器。

所制得的荧光生物传感器，用于乳腺癌的早期诊断时，对血管内皮生长因子的检测限为3.5 pmol/L。

本发明通过对探针基因的设计，将3'末端和5'末端含有胞嘧啶(C)和能在VEGF诱导下折叠成G-四链体结构的特殊序列的探针基因与硝酸银溶液混合，通过C-Ag⁺-C的共价结合方式将探针基因折叠成发夹结构；当靶分子存在时，探针基因与靶蛋白结合形成G-四链体结构，发夹结构打开并释放出银离子，银离子与碳化氮纳米材料结合猝灭其荧光，实现了对乳腺癌的早期诊断。该方法对VEGF的检测限为3.5 pmol/L。

本发明的有益效果在于：

1）本发明的荧光传感器不含对人体有毒、污染环境的材料，稳定性好、灵敏度高、重现性好，抗环境中其它常见离子干扰的能力强，而且传感器易于制备；

2）本发明利用碳化氮纳米材料在银离子、探针基因和VEGF存在下的荧光猝灭-恢复的性质，制得荧光生物传感器；该传感器实现了对VEGF的灵敏特异性检测，提供了一种更加准确、灵敏、经济、简便、无创的检测新技术，具有巨大的应用前景。

附图说明

图1是碳化氮纳米材料的光谱图，(A)为紫外光谱，(B) 为荧光光谱；

图2是碳化氮纳米材料的激发发射光谱；

图3为加入银离子或不同的VEGF后碳化氮纳米材料荧光信号的变化；图中：（a）碳化氮纳米材料的荧光信号，（d）碳化氮纳米材料中加入银离子的荧光信号，（b）碳化氮中加入银离子和探针基因后的荧光信号，（c）碳化氮中加入银离子和探针基因后再加入靶标蛋白的荧光信号；

图4为本发明的荧光信号检测图。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

荧光生物传感器的制备方法为：

1）碳化氮纳米材料的制备：将2 mL甲酰胺置于微波管中，170℃下反应30 min，用双蒸水洗3遍，真空干燥8 h后用去离子水溶解，超声剥离24 h；将得到的液体15000 r/min 离心1 h，取上清液即得碳化氮纳米片混悬液；其光谱如图1和图2所示；

 2）3-吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲溶液配制：称取0.5232 g的MOPS 和2.1248 g的NaNO₃，用双蒸水溶解后，转移到250 mL容量中，定容，即得10 mmol/L MOPS溶液；用0.1 mol/L的NaOH溶液调pH至7.0；

3）探针基因：5'-CCCCCCTGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGACCCCCC-3'（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）；靶标蛋白：VEGF（从SIGNMA公司购买）；将探针基因和靶标蛋白分别溶于去离子水中制成100 μmol/L的探针溶液和100 μmol/L的靶蛋白溶液；

4）50 μL 1 μmol/L探针基因与10 μL 10 mmol/L的硝酸银溶液混合，用MOPS缓冲液稀释至100 μL，混匀并反应1 h；将此混合体系加入到900 μL的碳化氮纳米片悬浮液中，混合均匀，测其荧光强度；继续往上述体系中加入50 μL 1 μmol/L 靶标蛋白，混匀反应1h，检测其荧光强度的变化；从实验结果可知（图3），银离子对碳化氮的荧光（a）有猝灭作用，通过银离子与碳化氮中的CN_X结合作用制备Ag/碳化氮，由于银离子对碳化氮的猝灭作用，使碳化氮的光致发光很弱（d）；在探针基因存在下，碳化氮表面结合的银离子可以与胞嘧啶共价结合，形成更稳定的C-Ag⁺-C错配结构，从而使探针回折形成发夹结构，减弱了银离子与氮化碳之间的猝灭作用，使碳化氮溶液的荧光恢复（b）；当VEGF存在下，探针基因与VEGF结合形成G-四链体结构，此时C-Ag⁺-C结构被打开，同时银离子被解离出来，再次与碳化氮结合，使得碳化氮的荧光再次被猝灭（c）。

通过以上方法即可得到所需的传感器。

实施例2

本发明的荧光传感器用于检测VEGF，具体检测方法为：将含有探针基因、银离子和碳化氮纳米片的混合体系中加入含有一定浓度的VEGF溶液，混匀反应。上述反应液用荧光分析法检测。

本发明运用现有技术的荧光分析法检测技术观察碳化氮纳米材料的荧光信号变化；实验结果见附图4，由图可知，一定范围内，随着靶标蛋白浓度增加（从10 pmol/L增加到70 pmol/L），发夹结构的探针基因与蛋白结合形成G-四链体结构而打开并释放出银离子量越多，猝灭碳化氮的荧光程度越强，荧光信号越弱；碳化氮的发射波长为396 nm；

测定的条件：测定介质为MOPS缓冲溶液，pH =7.0。荧光分析法测定参数：λ_ex=330 nm，激发和发射光狭缝值均为5 nm，PMT检测电压为600 V。其线性范围为：10 pmol/L~70 pmol/L。回归方程为F=156.3-1.7972C，线性相关系数r为0.9939，该方法对特定序列DNA的最低检测下限为3.5 pmol/L。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  福建医科大学

 

<120>  用于乳腺癌中血管内皮生长因子检测的荧光生物传感器

 

<130>  1

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  37

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cccccctgtg ggggtggacg ggccgggtag acccccc                              37