施马伦贝格病毒(SBV)疫苗、其制备方法及用途

摘要

本发明涉及用于预防和治疗反刍动物传染病的疫苗及药物领域。本发明特别涉及用灭活的施马伦贝格病毒(SBV)作为疫苗或药物，用来预防或治疗SBV诱发的病毒血症、传播及临床症状、特别是新生反刍动物如牛、绵羊和山羊的畸形。

说明书

序列表

本申请包含已经以ASCII格式通过EFS-Web提交的序列表，其完整内 容通过援引并入本申请中。所述ASCII拷贝命名为01-2825-PCT-SEQ.txt， 大小为33696字节。

发明背景

技术领域

本发明属于用于预防和治疗传染病的疫苗和药物领域。特别地，本发 明涉及用灭活的病毒作为疫苗或药物来预防或治疗病毒血症、其传播和临 床症状，特别是施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus，SBV)诱发的新生反 刍动物如牛、绵羊和山羊的畸形。

背景技术

2011年11月在欧洲发现一种新的正布尼亚病毒(orthobunyavirus)施马 伦贝格病毒(SBV)。首次检测之后，绵羊、牛和山羊的SBV报告病例在一 些欧洲国家急剧积累，积累了数千例PCR阳性的畸形羊羔和牛犊(1，2)。 该病毒在弗里德里希洛弗勒研究所(FLI)通过宏基因组学在有奶量下降和发 热的牛的样品中检测到。调查的样本采集自施马伦贝格市(德国北莱茵-威斯 特法伦州)附近的一个农场，因此该病毒命名为施马伦贝格病毒(SBV)。SBV 是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)中正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)的成员。 它与所谓的辛波血清群病毒(Simbuserogroup virus)有关(1)。

正布尼亚病毒具有一个分段的负链RNA基因组，并且主要是由蠓虫和 蚊子等昆虫媒介传播。正布尼亚病毒基因组中的三个片段(S、M和L)允许 基因重组(reassortment)，其自然发生并导致具有新生物学性质的病毒的出 现(3)。最大的L片段编码RNA依赖性RNA聚合酶。M片段编码病毒表面 糖蛋白Gn与Gc，其负责细胞融合、病毒附着和诱导中和抗体。小片段S 编码也参与补体结合的核衣壳N(4)。正布尼亚病毒之间的关系过去常常仅 通过血清学交叉反应性来确定(5)。在DNA测序的时代，通过部分基因组 序列(N基因的全部和Gc基因的部分)的比较，已经额外地评估系统发生学 (6)。因此，可用的公开全长基因组的基因组序列信息不多。因而难以进行 深入的系统发生学分析。总之，SBV的详细和可靠的系统分类无法进行。 初步调查显示，M片段和L片段的序列与部分AKAV和艾诺病毒(AINOV) 序列具有相似性。N基因与沙门达病毒(Shamonda virus,SHAV)的相关性最 密切(1)。

SBV像赤羽病毒(Akabane virus，AKAV)一样，能在妊娠的易感阶段中 越过怀孕母牛和羊的胎盘屏障，感染胚胎并引起致命的先天性缺陷(2)。根 据原型病毒命名的辛波血清群是正布尼亚病毒属中最大的血清群，包含至 少25种病毒，其中医学上重要的病毒如赤羽病毒、奥罗普切病毒(Oropouche  virus)、萨苏伯里病毒(Sathuperi virus)或道格拉斯病毒(Douglas virus)，其中 大部分可引起新生反刍动物的畸形，而且人类也可能会受到影响。例如， 赤羽病毒导致反刍动物的先天性缺陷并在亚洲、大洋洲和非洲传播，而奥 罗普切病毒引起奥罗普切热在南美洲人群中的大流行，这是一种类似于登 革热的人畜共患疾病。萨苏伯里病毒的名字被借用来命名萨苏伯里血清群， 道格拉斯病毒和SBV也属于该血清群。

SBV是第一种在欧洲检测到的辛波血清群的正布尼亚病毒。该病毒似 乎是通过节肢动物媒介传播。蠓(biting midge)可能在传播中发挥重要的作 用。据目前所知，反刍动物易于感染SBV。即使发病，成年动物可能发病 轻微。然而，经胎盘感染时常发生，并且可导致羔羊、儿童和牛犊的严重 的脊柱先天性畸形(脊柱后凸、前凸、脊柱侧弯以及斜颈)与头颅先天畸形(大 头畸形、短颈)，以及各种大脑畸形(脑积水(hydracephaly)、脑穿通畸形、小 脑发育不全以及脑干发育不全)和脊髓畸形。感染在欧洲西北部的大部分地 区迅速蔓延。比利时、德国、法国、意大利、卢森堡、荷兰、西班牙和英 国至今都受到影响。

因此，由于当前没有可用的疫苗，SBV严重地威胁欧洲的反刍类家畜。

所以，迫切需要实现快速诱导中和抗体的疫苗和药物来对施马伦贝格 病毒感染进行预防和治疗。

发明内容

通过说明书和权利要求中体现的实施方案来解决上述技术问题。

因此，根据权利要求实施本发明的不同方面。

在一个方面，本发明提供含有一种或多种施马伦贝格病毒(SBV)抗原的 免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物优选包含SBV。

因此，优选地，本发明组合物含有SBV作为一种或多种SBV抗原， 或者优选地所述一种或多种SBV抗原分别为SBV。因此，本发明的免疫原 性组合物特别是包含施马伦贝格病毒(SBV)的免疫原性组合物。

本文所用的术语“抗原”特别是指能够引发免疫应答的任意分子、部分 或实体。所述免疫应答包括细胞和/或体液免疫应答。取决于组合物的预期 功能，其可以包含一种或多种抗原。

在另一个优选方面，本发明的免疫原性组合物包含的SBV抗原或SBV 是灭活的。

因此，根据一个方面，本发明的免疫原性组合物优选为包含灭活的施 马伦贝格病毒(SBV)的免疫原性组合物。

本文所用的术语“灭活”意思是将抗原施用到哺乳动物宿主时不会引起 疾病，或者在宿主细胞中不会复制。

本发明也提供一种包含SBV或SBV抗原的免疫原性组合物，其中SBV 包含：

·小(S)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:1 或SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少97.8％、优选至少99％的序列相同性 的核酸序列反向互补，

·中等(M)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:2 的核酸序列具有至少82.2％的序列相同性的核酸序列反向互补，和/或

·大(L)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:3 的核酸序列具有至少93％的序列相同性的核酸序列反向互补。

优选地，所述SBV包含所述小(S)RNA片段、所述中等(M)RNA片段 以及所述大(L)RNA片段。

根据另一个方面，所述SBV或者所述SBV抗原可通过灭活SBV或SBV 抗原获得，其中所述SBV包含：

·小(S)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:1 或SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少97.8％、优选至少99％的序列相同性 的核酸序列反向互补，

·中等(M)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:2 的核酸序列具有至少82.2％的序列相同性的核酸序列反向互补，和/或

·大(L)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:3 的核酸序列具有至少93％的序列相同性的核酸序列反向互补。

序列表的所有序列按5'-3'的方向输入。序列SEQ ID NO：1-3和SEQ ID  NO：7编码具有正极性的cDNA(+链)。术语“反向互补”意思是该序列反向 平行于参考序列。

优选地，所述SBV包含所述小(S)RNA片段、所述中等(M)RNA片段 以及所述大(L)RNA片段。

应当理解，本文所用的术语“RNA片段”相当于在施马伦贝格病毒语境 中经常使用的“基因组片段”或“片段”。

优选地，本文提到的小(S)RNA片段具有和DNA序列反向互补的RNA 序列，所述DNA序列同SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少97.8％、更优选 地至少98.5％、更优选地至少99％、更进一步优选地至少99.5％或者尤其是 100％的序列相同性；或者优选地，本文所描述的小(S)RNA片段具有和DNA 序列反向互补的RNA序列，所述DNA序列同SEQ ID NO:7的核酸序列具 有至少97.8％、更优选地至少98.5％、更进一步优选地至少99％、更进一步 优选地至少99.5％或者尤其是100％的序列相同性。

优选地，本文提到的中等(M)RNA片段具有和DNA序列反向互补的 RNA序列，所述DNA序列同SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少83％、更 优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、更进一步优选地至少95％或者 尤其是100％的序列相同性。

优选地，本文提到的大(L)RNA片段具有和DNA序列反向互补的RNA 序列，所述DNA序列同SEQ ID NO:3的核酸序列具有至少94％、更优选 地至少96％、更进一步优选地至少98％或者尤其是100％的序列相同性。

本文所用的术语“免疫原性组合物”具体是指在已经暴露于组合物的哺 乳动物和/或昆虫中会引起免疫应答的组合物。免疫应答可以包含抗体的诱 导和/或T细胞应答的诱导。

应当理解，本发明上下文中的序列相同性基于双序列比对。出于本发 明的目的，使用Mega5(K.Tamura et.al.,MEGA5:Molecular Evolutionary  Genetics Analysis using Maximum Likelihood,Evolutionary Distance,and  Maximum Parsimony Methods.Mol.Biol.Evol.28,2731-2739(2011))中的 ClustalW实施双序列比对，采用默认设置(空位开放罚分为15以及空位拓 展罚分为6.66；DNA权重矩阵：ClustalW 1.6；转换权重为0.5)。比对序列 的序列相同性使用BioEdit的7.0.9.0.版本进行计算。

应当理解，本文所用的术语“同…的序列相同性”在本文中相当于术语 “同…的核酸序列的序列相同性”。因此本文提到的术语“同SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO:8的序列相同性”相当于术语“同SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8 的核酸序列的序列相同性”，术语“同SEQ ID NO:5的序列相同性”相当于术 语“同SEQ ID NO:5的核酸序列的序列相同性”，以及术语“同SEQ ID NO:6 的序列相同性”相当于术语“同SEQ ID NO:6的核酸序列的序列相同性”。

尤其应当理解，本文中所用的术语“同SEQ ID NO:X的核酸序列的序 列相同性”分别相当于术语“在SEQ ID NO:X长度范围的SEQ ID NO:X的 核酸序列的序列相同性”或术语“在SEQ ID NO:X整个长度范围的SEQ ID  NO:X的核酸序列的序列相同性”。在该上下文中，“X”为选自1-8的任意 整数，以使“SEQ ID NO:X”代表本文中提的所有SEQ ID NO中的任意一个。

在本发明的另一个优选方面，本文提到的SBV包含：

·S RNA片段，其特征在于所述S RNA片段具有这样的序列，所述序 列同SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8具有至少97.8％、优选地至少99％的序 列相同性，

·M RNA片段，其特征在于所述M RNA片段具有这样的序列，所述 序列同SEQ ID NO:5具有至少82.2％的序列相同性，和/或

·L RNA片段，其特征在于所述L RNA片段具有这样的序列，所述序 列同SEQ ID NO:6具有至少93％的序列相同性，

并且，特别是其中所述的SBV包含所述小(S)RNA片段、所述中等 (M)RNA片段和所述(L)RNA片段。

优选地，本文提到的所述SBV包含：

·S RNA片段，其特征在于所述S RNA片段具有

-同SEQ ID NO:4具有至少97.8％、更优选地至少98.5％、甚至更优 选地至少99％、更进一步优选地至少99.5％或者尤其是100％的序列相同性 的RNA序列，或者

-同SEQ ID NO:8具有至少97.8％、更优选地至少98.5％、甚至更优 选地至少99％、更进一步优选地至少99.5％或者尤其是100％的序列相同性 的RNA序列；和/或

·M RNA片段，其特征在于所述M RNA片段具有同SEQ ID NO:5具 有至少83％、更优选地至少85％、甚至更优选地至少90％、更进一步优选 地至少95％或者尤其是100％的序列相同性的RNA序列；和/或

·L RNA片段，其特征在于所述L RNA片段具有同SEQ ID NO:6具 有至少94％、更优选地至少96％、更进一步优选地至少98％或者尤其是 100％的序列相同性的RNA序列。

本文所用的术语“具有100％的序列相同性”也被理解为相当于术语“相 同”。

优选地，灭活的SBV可通过热处理或优选使用病毒灭活剂将SBV灭 活获得，其中具体使用氮丙啶化合物、最优选二乙烯亚胺(binary  ethyleneimine,BEI)进行灭活。

根据一个优选的方面，将终浓度为10mM或更低的BEI添加到抗原， 其中已经令人惊奇地发现，低于4mM的终浓度足以灭活抗原。因此，优 选地，向抗原添加终浓度低于4mM的BEI，更优选的终浓度为0.5-3.5mM， 最优选的终浓度为1-3mM。

添加BEI以后，优选地，将混合物保持搅拌48小时或更少，优选24 小时或更少，最优选为6-18小时，例如12小时。在搅拌混合物时，混合 物的温度优选为37+/-5℃，最优选为37+/-1℃。

此外，已经发现只要一个灭活步骤，例如通过向抗原添加BEI，就足 以灭活抗原。

灭活步骤以后，优选地，通过向混合物添加中和剂将残余病毒灭活剂 中和，相比于添加到抗原的病毒灭活剂的量，特别地，所述中和剂为摩尔 过量的。如果使用氮丙啶化合物进行灭活，那么优选使用打开三元环的亲 核试剂进行中和。优选地，通过添加硫代硫酸钠来中和BEI，相比于添加 到抗原的BEI的量，硫代硫酸钠特别为1.1-10倍、最优选为2-8倍的摩尔 过量。

在一个优选方面，本发明的免疫原性组合物包含的SBV的量相当于每 剂量至少约10⁵TCID₅₀/mL、优选每剂量10⁵-10⁷TCID₅₀/mL、更优选每剂量 约10⁶TCID₅₀/mL的病毒滴度。

已经令人惊奇地发现包含相当于每剂量少于10^5.5TCID₅₀/ml、优选每剂 量少于10⁵TCID₅₀/ml的病毒滴度的SBV量的本发明的免疫原性组合物足 以预防动物、特别是绵羊中的SBV RNA血症。

因此，优选地，本发明的免疫原性组合物包含的SBV的量相当于每剂 量少于10^5.5TCID₅₀/ml、优选每剂量少于10⁵TCID₅₀/ml、更优选每剂量为 10³-10⁵TCID₅₀/mL、最优选每剂量为10⁴-10⁵TCID₅₀/mL的病毒滴度，特别 是用于诱导对SBV的免疫应答和/或用于预防或减少SBV诱发的病毒血症 或畸形和/或用于预防或减少SBV传播的方法中，优选在绵羊中。

本文所述的“RNA血症(RNAemia)”具体理解为检测(例如通过基于核酸 序列的扩增或逆转录聚合酶链式反应(PCR))动物样品、特别是血浆、血清 或全血样品中的RNA。

因此，特别应当理解，根据本发明，SBV诱发的病毒血症与动物血清 样本中的SBV RNA血症分别同时或伴随出现，SBV RNA血症出现在动物 的血清样本中。因此，可以通过检测动物血清中特定的SBV RNA对SBV 诱发的病毒血症进行检查。

在另一个优选方面，本发明的免疫原性组合物含有SBV，所述SBV具 有每毫升至少约10⁶SBV颗粒、优选每毫升10⁶-10⁸TCID₅₀/mL SBV颗粒、 更优选每毫升约10⁷SBV颗粒的预灭活滴度。

本文所用的术语“预灭活滴度(pre-inactivation titre)”具体是指灭活的悬 浮SBV的量。

特别地，本发明的免疫原性组合物进一步含有一种或多种药学上可接 受的载体或赋形剂，其中优选所述一种或多种药学上可接受的载体或赋形 剂选自溶剂、分散介质、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗 真菌剂、等渗剂和吸附延迟剂。

在一个特别优选的方面，本发明的免疫原性组合物进一步含有一种或 多种佐剂，优选氢氧化铝和/或皂苷，例如铝胶(Alhydrogel)和/或Quil-A， 其中最优选的是氢氧化铝和皂苷的组合。

另一方面涉及本发明的免疫原性组合物，其用作药物，优选用作疫苗。

又一方面涉及本发明的免疫原性组合物，其用于诱导对SBV的免疫应 答，和/或用于预防或减少SBV诱发的病毒血症或畸形，和/或用于预防或 减少SBV传播的方法中。

这一方面特别涉及本发明的免疫原性组合物，其用于在反刍动物和/或 昆虫中诱导对SBV的免疫应答、和/或用于预防或减少反刍动物和/或昆虫 的病毒血症、和/或用于预防或减少SBV诱发的反刍动物胚胎或新生畸形、 和/或用于预防或减少SBV通过节肢动物媒介、优选昆虫进行传播和/或用 于预防或减少SBV从怀孕动物(母体)向胚胎传播的方法中。

本文所用的术语“诱导”对抗原或组合物的“免疫应答”是指动物中对有 益的组合物中存在的抗原产生体液和/或细胞免疫应答。

本文所用的术语“预防(prevention)”、“减少(reduction)”、“预防 (preventing)”或“减少(reducing)”分别是指但不限于这样的过程，其包括给动 物施用SBV抗原，即施用包含在本发明组合物中的本发明的SBV抗原， 其中所述SBV抗原在给所述动物施用时在动物中引发或能够引发对SBV 的免疫应答。总之，这种治疗分别减少了SBV引起的疾病的临床体征 (clinical sign)或者与SBV感染相关的临床体征。更具体地，本文所用的术 语“预防”通常是指预防过程，其中动物在SBV引起的病程诱导或发作之前 暴露于本发明的免疫原性组合物。

本文中“减少与SBV感染相关的临床体征”是指但不限于，相比于野生 型感染，减少组内被感染对象的数量，减少或消除显示出感染的临床体征 的对象的数量，或者降低对象中存在的任意临床体征的严重程度。例如， 其指任意病原体含量减少、病原体脱落、病原体传播减少或者SBV感染症 状的任意临床体征减少，特别是从母体向胚胎的SBV传播减少或者反刍动 物胚胎或新生儿中SBV诱发的畸形减少。优选地，相比于没有接受本发明 组合物并且可能被感染的对象，在接受本发明组合物的对象中这些临床体 征减少至少10％。更优选地，在接受本发明组合物的对象中这些临床体征 减少至少20％、优选至少30％、更优选至少40％并且甚至更优选至少50％。

术语“减少SBV诱发的病毒血症”(或者，“减少SBV诱发的RNA血症”) 是指但不限于减少进入动物血流的SBV病毒，其中相比于没有接受本发明 组合物并且可能被感染的对象，接受本发明组合物的对象的血清中的病毒 血症水平，即每毫升血清中SBV RNA拷贝数或者每分升血清中噬斑形成 菌落数，降低至少50％。更优选地，接受本发明组合物的对象中的病毒血 症水平降低至少90％，优选至少99.9％，更优选至少99.99％并且甚至更优 选至少99.999％。

本文所用的术语“病毒血症”应特别理解为施马伦贝格病毒颗粒在动 物，特别是哺乳动物或昆虫的血流中复制并且循环的状态。

本文所用的术语“动物”特别地涉及哺乳动物或昆虫。

优选地，本文提到的哺乳动物是反刍动物。更优选地，本文提到的反 刍动物选自牛、绵羊、山羊、鹿、麋鹿、长颈鹿、野牛、驼鹿、牦牛、水 牛、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和蓝牛羚。最优选地，本文提到 的哺乳动物或反刍动物选自牛、绵羊和山羊。

优选本文提到的昆虫选自蠓，尤其是库蠓属(Culicoides spp.)、咬蝇 (biting fly)和蚊子。

此外，本发明提供一种疫苗组合物，用于治疗或预防SBV、或者预防 或减少SBV诱发的畸形类病毒血症和/或预防或减少SBV传播，其中所述 疫苗包含本发明的免疫原性组合物。

特别地，本发明提供一种疫苗组合物，其包含本发明的免疫原性组合 物，用于在反刍动物和/或昆虫中诱导对SBV的免疫应答、和/或用于预防 或减少反刍动物和/或昆虫的病毒血症、和/或用于预防或减少SBV诱发的 反刍动物胎儿或新生儿畸形和/或用于预防或减少SBV通过节肢动物载体 优选昆虫进行传播的方法中。

本文所用的术语“畸形”特别涉及选自脊柱先天性畸形(脊柱后凸、脊柱 前凸、脊柱侧弯、斜颈)和/或头颅先天性畸形(大头畸形、短颈)、各种大脑 畸形(脑积水)、脑穿通畸形、小脑发育不全、脑干发育不全)和各种脊髓畸 形、前腿和/或后腿僵硬和/或畸形等畸形。更特别地，术语“畸形”涉及羔羊、 儿童和牛犊的畸形。

本发明还提供一种用于制备感染性SBV的方法，其包括步骤：

-用SBV感染细胞，优选哺乳动物细胞或昆虫细胞，

-培养感染的细胞，

-收获所述细胞产生的SBV。

本文所用的术语“感染”特别指例如通过接种用SBV接触细胞的过程。

所述用SBV感染细胞具体包含病毒附着到细胞、病毒进入细胞、细胞 质中病毒粒子脱壳、病毒基因组复制及转录、病毒蛋白表达以及新的感染 性病毒颗粒组装和释放。

本文所用的术语“培养”特别是指在适宜条件下细胞的维持，优选细胞 的生长。

本文所用的术语“收获”特别是指例如通过对包含感染病毒的细胞的培 养液的容器进行离心以及随后倾析细胞上清液而获取包含病毒颗粒的细胞 上清液。

出乎意料地，已经发现当SBV在昆虫细胞和哺乳动物细胞之间交替传 代时，SBV保持感染性并因此也保持它的抗原潜力。

因此，本发明特别涉及一种用于制备优选地具有感染性的SBV的方法， 特别是上述方法，其中SBV在昆虫细胞和哺乳动物细胞之间交替传代。

因此，根据本发明的用于制备感染性SBV的方法特别包括步骤：

(a)用SBV感染昆虫细胞，

(b)培养步骤(a)的被感染细胞，

(c)收获步骤(b)中所述细胞产生的SBV，

(d)用步骤(c)中收获的SBV感染哺乳动物细胞，

(e)培养步骤(d)的被感染细胞，以及

(f)收获步骤(e)中所述细胞产生的SBV，

或者包括步骤：

(d)用SBV感染哺乳动物细胞，

(e)培养步骤(d)的被感染细胞，

(f)收获步骤(e)中所述细胞产生的SBV，

(g)用步骤(f)中收获的SBV感染昆虫细胞，

(h)培养步骤(g)的被感染细胞，以及

(i)收获步骤(h)中所述细胞产生的SBV。

在此方面，步骤(d)-(i)的编号相当于编号(a′)-(f′)，并且鉴于本文描述的 其它步骤(从步骤“(j)”开始)，为清晰起见已经选择该编号。

优选地，本发明中用于制备SBV的方法包括步骤：

(a)用SBV感染昆虫细胞，

(b)培养步骤(a)的被感染细胞，

(c)收获步骤(b)中所述细胞产生的SBV，

(d)用步骤(c)中收获的SBV感染哺乳动物细胞，

(e)培养步骤(d)的被感染细胞，

(f)收获步骤(e)中所述细胞产生的SBV，

(g)用步骤(f)中收获的SBV感染昆虫细胞，

(h)培养步骤(g)的被感染细胞，以及

(i)收获步骤(h)中所述细胞产生的SBV。

更优选地，根据本发明的用于制备感染性SBV的方法进一步包括步骤：

(j)用步骤(i)中收获的SBV感染哺乳动物细胞，

(k)培养步骤(j)的被感染细胞，以及

(l)收获步骤(k)中所述细胞产生的SBV，

以及任选地

(m)用步骤(l)中收获的SBV感染昆虫细胞，

(n)培养步骤(m)的被感染细胞，以及

(o)收获步骤(n)中所述细胞产生的SBV。

因此，在一个方面，根据本发明的用于制备感染性SBV的方法包括步 骤：

(a)用SBV感染昆虫细胞，

(b)培养步骤(a)的被感染细胞，

(c)收获步骤(b)中所述细胞产生的SBV，

(d)用步骤(c)中收获的SBV感染哺乳动物细胞，

(e)培养步骤(d)的被感染细胞，

(f)收获步骤(e)中所述细胞产生的SBV，

(g)用步骤(f)中收获的SBV感染昆虫细胞，

(h)培养步骤(g)的被感染细胞，

(i)收获步骤(h)中所述细胞产生的SBV，

(j)用步骤(i)中收获的SBV感染哺乳动物细胞，

(k)培养步骤(j)的被感染细胞，以及

(l)收获步骤(k)中所述细胞产生的SBV，

以及任选地

(m)用步骤(l)中收获的SBV感染昆虫细胞，

(n)培养步骤(m)的被感染细胞，以及

(o)收获步骤(n)中所述细胞产生的SBV。

在本发明的用于制备SBV的方法中使用的昆虫细胞优选为KC细胞。

在根据本发明的用于制备SBV的方法中，优选使用BHK细胞、特别 是BHK-21细胞作为哺乳动物细胞。

最优选地，在根据本发明的用于制备SBV的方法中，昆虫细胞为KC 细胞，并且哺乳动物细胞为BHK细胞，特别是BHK-21细胞。

此外，本发明还包括可通过根据本发明的用于制备SBV的方法获得的 SBV。

本发明进一步提供一种本发明的用于制备灭活SBV或免疫原性组合物 的方法，其包括步骤：

(A)用SBV感染细胞，其中所述细胞特别是猴肾细胞，优选Ma104细 胞或Ma104-AK细胞，或者其中所述细胞是BHK细胞，优选BHK-21细胞，

(B)培养所述被感染细胞，

(C)收获所述细胞产生的SBV，以及

(D)通过热处理或使用病毒灭活剂灭活所述SBV

如果在用于制备本发明的灭活SBV或免疫原性组合物的方法中优选使 用Ma104细胞或Ma104-AK细胞，那么将通过所述方法制备的灭活SBV 或免疫原性组合物施用给动物时，具有可以减小或最小化不良反应、特别 是过敏反应的优点。

特别地，优选在本发明的用于制备灭活SBV或免疫原性组合物的方法 的步骤(A)中，使用可通过本发明的用于制备SBV的方法获得的SBV感染 细胞。

因此，本发明还提供(i)制备本发明的感染性SBV的方法和(ii)用于制 备本发明的灭活SBV或免疫原性组合物的方法的组合，其中所述方法依次 进行。

优选地，在本发明的用于制备感染性SBV的方法和/或用于制备根据本 发明的灭活SBV或免疫原性组合物的方法中，使用MOI为0.00001-0.01、 优选为0.0001-0.001的SBV感染细胞。

特别地，优选在本发明的用于制备SBV的方法和/或用于制备本发明的 灭活SBV或免疫原性组合物的方法中，在包含1-10％FCS、更优选包含 2-6％FCS的培养基中培养细胞，和/或在25-38℃、优选36-38℃、更优选 约37℃的温度下培养细胞。也可能在不存在FCS的情况下培养细胞。

此外，本发明包含SBV，其可通过用于制备本发明的灭活SBV或免疫 原性组合物的方法获得，并且，此外本发明还提供灭活的SBV，其可通过 (i)本发明的制备感染性SBV的方法和(ii)用于制备本发明的灭活SBV或免 疫原性组合物的方法的组合获得，其中所述方法依次进行。

在另一个方面，优选在本发明的用于制备感染性SBV的方法和/或用于 制备本发明的灭活SBV或免疫原性组合物的方法中，SBV包含：

·小(S)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:1 或SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少97.8％、优选至少99％的序列相同性 的核酸序列反向互补，

·中等(M)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:2 的核酸序列具有至少82.2％的序列相同性的核酸序列反向互补，和/或

·大(L)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:3 的核酸序列具有至少93％的序列相同性的核酸序列反向互补；

和/或

其中所述SBV包含：

·S RNA片段，其特征在于所述S RNA片段具有这样的序列，所述序 列同SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8具有至少97.8％、优选地至少99％的序 列相同性，

·M RNA片段，其特征在于所述M RNA片段具有这样的序列，所述 序列同SEQ ID NO:5具有至少82.2％的序列相同性，和/或

·L RNA片段，其特征在于所述L RNA片段具有这样的序列，所述序 列同SEQ ID NO:6具有至少93％的序列相同性。

本发明还提供一种SBV，优选分离的SBV，其包含：

·小(S)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:1 或SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少97.8％、优选至少99％的序列相同性 的核酸序列反向互补，

·中等(M)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:2 的核酸序列具有至少82.2％的序列相同性的核酸序列反向互补，和/或

·大(L)RNA片段，其具有这样的序列，所述序列与同SEQ ID NO:3 的核酸序列具有至少93％的序列相同性的核酸序列反向互补。

本发明进一步提供优选分离的SBV，特别是上述SBV，其包含：

·S RNA片段，其特征在于所述S RNA片段具有这样的序列，所述序 列同SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8具有至少97.8％的序列相同性，

·M RNA片段，其特征在于所述M RNA片段具有这样的序列，所述 序列同SEQ ID NO:5具有至少82.2％的序列相同性，和/或

·L RNA片段，其特征在于所述L RNA片段具有这样的序列，所述序 列同SEQ ID NO:6具有至少93％的序列相同性。

此外，本发明包含可通过上述任意方法获得的物质的组合物，其中所 述组合物优选为免疫原性组合物，特别是疫苗。

本发明的另一个方面涉及本发明的免疫原性组合物在制备用于治疗或 预防SBV和/或治疗或预防SBV诱发的病毒血症或畸形和/或预防或减少 SBV在需要所述治疗的动物中的传播的药物中的应用。

此外，本发明提供一种在动物中产生对SBV的免疫应答的方法，其包 括对所述动物施用本发明的免疫原性组合物。

在另一个方面，本发明提供一种治疗或预防SBV或者治疗或预防由需 要所述治疗的动物中SBV诱发的病毒血症或畸形的方法，其包括对所述动 物施用治疗有效量的本发明疫苗组合物。

本发明进一步提供用于诱导对SBV的免疫应答和/或防止或减少SBV 诱发的病毒血症或畸形和/或预防或减少SBV在动物或动物群体中传播的 方法，其包括对有此需要的动物施用本发明的免疫原性组合物的步骤。

在上述方法中，本发明免疫原性组合物或本发明疫苗分别优选以单个 剂量或更优选以两个剂量施用。

实施例

实施例1

SBV首次分离详述

BHK-21细胞已经广泛用于正布尼亚病毒生长。此后，在2011年11月， 由FLI研究人员采用该细胞系首次成功分离出SBV病毒。除了BHK，还 使用了库蠓(Culicoides variipennis)幼虫细胞(德国格赖夫斯瓦尔德-里姆斯 岛(Greifswald-Insel Riems)弗里德里希洛弗勒研究所(Friedrich- Loeffler-Institut)兽医的细胞系保藏中称为KC细胞)。使用在施耐德培养基 (Schneider’s media)中稀释的超声破碎血液将KC细胞温育10天。然后通过 冻融裂解细胞。使用裂解产物接种单层的幼仓鼠肾细胞-21(BHK，克隆13)。 1小时后除去接种物并用伊格尔氏基本成分培养基(EMEM)代替。5天后， 可见到很强的细胞病变效应，并且该培养物上清液检测出呈新型病毒阳性， 该新型病毒(分离株2)在特定cRT-qPCR中Cq值约为14，并且每毫升 TCID50为3x10⁶。

制备过程(概述)

如下所述的制备过程根据标准制备方法进行，例如在无菌条件下并且 对正确操作条件例如空气过滤进行确认以后。

制备过程描述：

1、制备MSV(病毒原型株，master stock virus)

SBV分离株2用于制备MSV(病毒原型株)。涂布有BHK-21细胞(5x10⁷细胞)的转瓶在moi为0.0001时进行感染。温育54小时以后，将转瓶在-20℃ 下冷冻、解冻并且在2000g下离心5分钟。收集上清液并且将分装成1ml 在-80℃下存储备用。

2、制备SBV抗原

将BHK-21细胞(细胞工作母液-WCS)冷冻存储在液氮中。使用EMEM 培养基和10％伽马照射过的FCS将WCS解冻并在细胞培养瓶(T160cm²)上 扩增。使用重组(非动物来源)胰蛋白酶对细胞进行胰蛋白酶消化。一个T160 烧瓶在包含2％FCS的150ml EMEM培养基中进行胰蛋白酶消化和重悬。 使用这种细胞悬浮液在一个转瓶(495cm²)中接种。将包含细胞悬浮液的转瓶 放在37℃的保温箱和0.5rpm的转筒中。涂布12-16小时以后，将细胞以 每瓶5x10⁷的密度进行涂布。采用moi为0.0001的感染。细胞在37℃下持 续温育并且在0.5rpm下转动50-56小时，直到特定的SBV细胞病变效应 (CPE)没有达到细胞的约60-70％。此时，将整个转瓶培养瓶在-20℃下冷冻 以及在37℃水浴中解冻并在-80℃下存储备用。

病毒滴定根据以下步骤进行：

所需材料

1、BHK-21细胞(克隆13)

2、T75烧瓶

3、96孔平底板

4、48孔平底板

5、Thermo 8道Matrix移液器+吸头

6、Eppendorf 8道移液器50-1250+吸头

7、用于多道移液器的容器

8、胰蛋白酶(Trypisn)+乙二胺四乙酸(EDTA)

9、ZB5培养基

10、5ml、10ml和25ml移液器

11、Pipetboy移液器

12、倒置显微镜

步骤

·高度融合的T75烧瓶进行胰蛋白酶消化并且细胞很好地悬浮在20 ml培养基(10％FCS)中

·添加100ml培养基(0％FCS)并且混合均匀

·将该细胞悬浮液倒入用于多道移液器的容器中

·使用多道移液器将100μl的细胞悬浮液填充到96孔板的前8列的孔 中

·孔板在37℃下CO₂保温箱中放置6-12小时以进行附着

·此后，准备48孔板并且在每个孔中填充1080μl的无血清培养基

·在第一列的孔中，接种120μl用于滴定的材料

·使用带P/M程序(移液120μl并且混合620μl 4次)的Eppendorf 8道 移液器，先混合接种有该材料的第一列

·丢掉吸头

·从第一列的孔(用新吸头)将120μl移液到第二列并且混合

·丢掉吸头

·重复该过程直到完成最后一列

·使用Matrix移液器从48孔板(其含有一个样品的系列稀释液)的第一 行吸取800μl

·当接吸头时，将吸头按牢，但是不要太用力，否则Matrix功能不会 起作用

·将100μl分到96孔板的8行中

·在37℃下温育3-4天

·在倒置显微镜上读取结果

3、疫苗配制

3.1灭活步骤

最终抗原的灭活过程总共持续72小时，并且所用BEI的浓度为15mM。 通过以每升被灭活的抗原比100ml的比例添加0.1M BEI(终浓度10mM)， 将最终抗原灭活。添加BEI以后，将混合物均质至少15分钟并且检验pH。 均质处理以后，将混合物倾入无菌容器中，在该容器中将混合物在37+/-1℃ 下保持搅拌24小时。24小时以后，通过以每升被灭活的抗原比50ml的比 例添加0.1M BEI(最终浓度5mM)对最终抗原进行第二次灭活。第二次添 加BEI以后，在与上述第一次添加相同的条件下重复该过程，但保持搅拌 该混合物48小时。3.2中和残余的BEI 一旦灭活过程已经完成，以每升已灭活的抗原比5ml的比例添加1M 硫代硫酸钠(最终浓度5mM)，以中和BEI。在混合物已经被均质后，检验 pH。如果需要的话，使用盐酸进行调整以获得7.2+-0.2的pH。

3.3佐剂

将铝胶(氢氧化铝)和Quil-A(皂苷)用作佐剂。

4、对牛进行的概念验证实验

使用18只7个月大的牛进行实验。将动物分成四组，每组四只动物， 而另外两只动物用作接触对照。所用动物在实验开始时呈SBV血清阴性。 第一组(四只动物)接种的疫苗剂量含有10⁶SBV TCID50/ml，第二组为10⁵SBV TCID50/ml，第三组为10⁴SBV TCID50/ml，并且最后的第四组以及接 触对照中的两只动物没有接种疫苗。每组中的4只动物通过皮下途径接种 疫苗(2mL)并且3周后再次接种。再次接种后两周对该研究中除了接触对 照组动物以外的所有动物进行攻毒(攻毒剂量＝10⁷TCID50活病毒/动物)。所 有未接种疫苗的动物一受到SBV攻毒就患上了病毒血症，该SBV攻毒在3 dpi(感染后天数)时开始并且持续2-3天。在受到SBV攻毒后，相比于没有 接种疫苗的动物，接种疫苗的动物表现出显著减轻的病毒血症并且减少到 无临床症状。

实施例2

1、简介

在该研究中，已经产生了几种灭活的疫苗制剂，并且随后在绵羊和牛 中对这些疫苗制剂在实验攻毒感染后诱导中和抗体和预防病毒血症的能力 进行了测试。

2、材料及方法

疫苗

产生五种不同的原型疫苗制剂(表1)；所有这些疫苗制剂为灭活的SBV 制剂水溶液。SBV或者生长在两种不同的幼仓鼠肾(BHK-21)细胞系上(疫苗 “BHKCT-HT”、“BHK13-HT”、“BHK13-LT”)或者生长在MA-104细胞上(疫 苗“MA-HT”和“MA-LT”)。

在用二乙烯亚胺(BEI)灭活之前，使用SBV的感染性滴度配制抗原浓 度，该BEI灭活过程或者使用长时间方案(使用10mM BEI在37℃下灭活 72小时)或者使用短时间方案(使用2mM BEI在37℃下灭活12小时)。

候选疫苗含有的抗原浓度如下：每毫升的组织培养物半数致死剂量 (TCID₅₀/ml)为6.1log10(MA-HT)或者5.7log10TCID₅₀/ml(BHKCT-HT、 BHK13-HT、MA-LT)或者4.7log10TCID₅₀/ml(BHK13-LT)。皂苷和氢氧化 铝用作佐剂(在所有候选疫苗制剂中，每1毫升使用0.125μg皂苷以及每毫 升使用6.65mg氢氧化铝)。测试所有制剂没有细菌污染，并且设重复通过 BHK-21细胞中两次连续传代测试灭活成功。在20℃下调节每种原型疫苗 的pH值至6.8-7.2。将疫苗保持在4℃备用。

表1：疫苗及动物组

动物

将25只欧洲家养品种的无SBV绵羊(7-9月龄)分配为5组，每组5只 动物，用原型疫苗(参见表1)中的一种对这些动物进行皮下免疫。还有5只 绵羊作为未接种疫苗的对照组。平均分配雄性和雌性动物。

此外，将22只SBV抗体阴性的雌性荷斯坦-弗里生牛(Holstein-Friesian  cattle)分配到四组，每组四只(H组)或六只动物(G组、I组和K组)。G组、 H组和I组中的动物分别使用疫苗BHKCT-HT、MA-HT和MA-LT进行皮 下免疫。K组中的牛作为未接种疫苗的对照组。在第一次接种疫苗当天， 动物为8-12月龄。

在每一种情况下，以三周的间隔对动物接种疫苗两次，并且在第二次 接种疫苗三周后，对接种疫苗的动物和参照组动物都接种2x 0.5ml的只在 天然宿主中传代的SBV野生株。在整个研究期间，每天测量直肠体温，并 且由兽医检查这些动物的临床体征。

取样、实时RT-PCR及血清学

第一次接种疫苗之后，在第0、3、4、7天以及之后的每周采集血清样 本。在第二次接种疫苗以后，每周采集一次血清样本。攻毒感染之后，在 前八天以及第14天和第21天，每天采集一次血清样本。在攻毒感染后第 22-29天时解剖采集脾脏、扁桃体和肠系膜淋巴结及下颌淋巴结样本，并且 在1ml MEM中均质。

使用自动提取用的MagAttract Virus Mini M48试剂盒(Qiagen，德国)根 据制造商建议从解剖采集的血清和组织样本中提取RNA。通过逆转录实时 PCR(RT-qPCR)(7)使用基于S基因组片段的外部标准物来确定SBV基因组 含量(load)。此外，使用市售的SBV抗体ELISA(IDvirus Indirect，IDvet，法国)和标准微中和反应检验法分析血清样本，该 ELISA相比于阳性对照采用推荐的70％相对光密度临界值。

3、结果

临床观察及尸体检查

在第一次接种疫苗原型之后，没有观察到不良副作用；没有动物出现 发热或任何其它临床体征。在第二次接种疫苗以后，使用疫苗MA-HT免 疫的一只牛(H组)在注射部位有两天出现低度肿胀。

攻毒感染以后，一只未接种疫苗的牛在第三天出现发热，另一只有三 天出现轻度腹泻。I组中的一只动物有一天流鼻涕。

对这些动物的解剖没有发现任何显著的眼观病变。除了一只未接种疫 苗的动物(S30)之外，所有动物的肠系膜淋巴结皆为PCR阳性；检测到每毫 克平均2.86E+03基因组拷贝(拷贝/毫克)。此外，在5只未接种疫苗绵羊中 的3只(S27-S29)以及所有对照组的牛的下颌淋巴结中(平均2.68E+01拷贝/ 毫克)、S27-S29以及C18-C20的扁桃体中(平均9.90E+01拷贝/毫克)和5只 未接种疫苗绵羊中的4只的脾脏中(S26-S29；平均4.57E+03拷贝/毫克)以 及两只对照组的牛的脾脏中(C17和C21；平均1.40E+01拷贝/毫克)发现了 SBV的RNA。在任意一只接种疫苗的动物中都没有检测到病毒RNA。

抗体反应

在第一次接种疫苗当天，所有动物在两项血清学检测中都呈阴性。

攻毒感染之前，在未接种疫苗的动物中未能检测到抗体。感染后三周， 除了一只对照组绵羊(S30)和一只牛，所有动物在中和检验中都呈阳性。还 在牛以及5只未接种疫苗绵羊中的2只(S26和S29)中通过ELISA发现了抗 体。尽管样本的光密度(OD)相对于阳性对照组OD值(S/P)增加了，对照组 绵羊S27和S28在ELISA中呈阴性。

使用疫苗BHKCT-HT、BHK13-HT或BHK13-LT第一次免疫(SBV生 长在BHK细胞上)三周以后，所有绵羊和牛在ELISA中都呈阴性，而在S07、 S08、S10(BHKCT-HT)和S04(BHK13-HT)中通过中和检验检测到低抗体滴 度。第二次接种疫苗之后，在至少一项血清学检验中检测到抗体，大多数 情况下，可看到中和抗体显著增加。攻毒感染三周以后，15只绵羊中的八 只(S04、S06、S07、S09、S10、S11、S12和S15)以及6只牛中的五只(C01-C05) 在两项检验中都呈阳性，七只绵羊(S01-S03、S05、S08、S13和S14)和剩 下的一只牛(C6)仅在中和测试呈阳性，并且S15仅在ELISA检验呈阳性。

使用疫苗MA-HT或MA-LT进行一次免疫(SBV生长在MA-104细胞 上)以后，所有牛和除两只外的所有绵羊在两项血清学检验中都呈阴性。S22 和S23在中和检验中滴度分别为1:5和1:7。第二次接种疫苗之后，未能在 S19、S24、C08和C14中检测到抗体。S16、S21、C07、C09和C10在两 项血清学检验中都呈阳性，而剩下的动物仅在中和检验中呈阳性。攻毒感 染后三周，D组中的所有绵羊和E组五只绵羊中的四只绵羊在中和检验中 呈阳性，通过ELISA在动物S16中检测到抗体，而在两项检验中动物S24 都呈阴性。在H组(高SBV滴度)的所有牛中，可通过ELISA和中和检验检 测到抗体。C12和C13(I组，低SBV滴度)同样如此，C11、C15和C16仅 在中和检验中呈阳性，并且通过任何测试都未能在C14中检测到抗体。

第二次免疫后，观察到平均中和抗体滴度增加了，而攻毒感染后，在 所有接种疫苗的组中大多数中和滴度保持恒定。

实时RT-PCR

第一次接种疫苗之后，任何动物中都没有检测到SBV基因组(未示出 数据)，证实SBV通过短时间和长时间BEI灭活步骤被成功灭活。

攻毒感染以后，在第二天到第四天(S27-S29)或者第2天到第五天(S26)， 除了一只未接种疫苗的绵羊(S30)以外所有绵羊在RT-qPCR中都呈阳性。六 只未接种疫苗的牛中有一只(C19)在感染后的第一天可首次检测到SBV基 因组，另外五只牛在第二天首次呈阳性。直到第五天(C17、C19-C21)、第 六天(C22)或者第七天(C18)都可以检测到SBV基因组。用疫苗MA-LT免疫 的六只牛中有三只(C12、C13、C16)第三天在RT-qPCR中呈阳性，而用 MA-HT接种的动物受到攻毒时没有出现RNA血症(血液中RNA)。

攻毒感染之后，在从所有接种疫苗的绵羊、对照组绵羊S30和G组和 H组(高滴度疫苗组)所有牛中采集的血清样本中，不能检测到病毒RNA。

4、结论

已经研制五种不同的灭活疫苗制剂并且随后在牛和绵羊中进行了测 试。在实验中，所有动物都没有显示出显著的不良副作用并且所有动物一 旦接种疫苗都进行了血清转化。此外，一旦接种疫苗，大多数而非所有的 动物出现了可检测的SBV中和抗体水平。重要的是，一旦攻毒感染，通过 四种原型疫苗完全预防了RNA血症，并且第五种减少了RNA血症。这些 数据表明，通过中和抗体仅部分地介导保护以免受病毒感染，并且一旦受 到SBV攻毒，很有可能与细胞免疫相关的其他尚未确定的机理关键性地有 助于病毒的清除。灭活疫苗的两个主要特征是(i)完全灭活感染性病毒，其 在第一次免疫后通过细胞培养物传代和没有RNA血症已经得到证明，以及 (ii)诱导保护性免疫。在攻毒感染之前，虽然在每只动物中都没有检测到中 和抗体，但是通过四种原型疫苗完全预防了RNA血症并且第五种大幅减少 了RNA血症。在本研究中，除了RNA血症，对淋巴网状系统中病毒RNA 的检测也用作诊断工具。相比于对照组，所有接种疫苗的动物对肠系膜淋 巴结之类的淋巴系统(解剖时的淋巴器官)中的SBV-RNA明显呈阴性。攻毒 感染以后，一只未接种疫苗的对照组绵羊既没有显示出RNA血症，也没有 RT-qPCR阳性组织样本，也没有血清转换，出现这些观测结果的原因尚不 清楚。可能的解释是注射失败或者对SBV感染的(天然)抵抗力状态。

然而，根据多数疫苗组无可检测RNA可得出结论：如果(在血清中)连 病毒基因组都不能检测到，就无攻毒病毒可以传播给胎儿。

虽然通过接种疫苗防止了或显著减少了RNA血症，但在每个测试中攻 毒感染之前每只动物中并没有检测到抗体。总而言之，ELISA测试和中和 检验之间的关联在牛样本中比在绵羊样本中大，特别是在未接种疫苗的动 物攻毒感染之后。

在攻毒感染未接种疫苗的绵羊之后，通过中和测试检测到所有绵羊组 中最高的抗体水平。使用几种Rift Valley发热疫苗免疫并且随后攻毒以后， 观察到相同效果(8)，但是，其中应用的疫苗没有提供无病毒免疫，而只减 少了病毒血症。与此相反，尽管中和抗体水平较低，但是SBV疫苗原型在 该研究中的特征在于完全预防了绵羊的RNA血症。

在我们的研究中，中和抗体的滴度受制备细胞系以及灭活前病毒滴度 的影响。还描述了AKAV的用于疫苗制备的细胞培养物上清液的剂量依赖 性，无论是否使用灭活疫苗的或减毒活疫苗(9；10)。据报道，研制疫苗必 需至少10^5.5TCID₅₀/ml的病毒。虽然含有生长在MA-104细胞上的病毒(6.1 log10TCID₅₀/ml)的2ml疫苗完全预防了RNA血症，但是在使用5.7log10 TCID₅₀/ml病毒基因组免疫的半数的牛犊中，病毒基因组在一天之中都可检 测到，假定SBV可以取相似的最小剂量。但是，在BHK-21细胞上制备的 疫苗中，较低的病毒滴度(5.7log10TCID50/ml)完全预防了两种动物中RNA 血症，对于绵羊仅需要4.7log10TCID50/ml。

总之，在该不同候选疫苗的概念验证(proof-of-concept)表征中，可以证 明用在两种主要目标物种中的五种SBV疫苗原型中有四种具有高效力。结 果，证明开发出了针对施马伦贝格病毒的对牛和绵羊是高效安全的死疫苗。 该研究中得到的结果显示出灭活的SBV疫苗可以被成功地用在家养反刍动 物中以支持对SBV传播的控制以及疾病预防。

实施例3

在下文中，对可选的灭活步骤和随后的中和过程进行描述，其还允许 制备(该制备的其它步骤根据实施例1进行)用于成功预防SBV感染的有效 疫苗：

灭活步骤

最终抗原的灭活过程总共持续12小时，并且使用的BEI浓度是2mM。 通过以每升被灭活的抗原比11.9ml的比例添加0.17M的BEI(终浓度2 mM)将最终抗原灭活。添加BEI以后，在37+/-1℃下保持搅拌该混合物12 小时。

中和残余BEI

一旦灭活过程已经完成，以每升已灭活的抗原比10ml的比例添加1M 硫代硫酸钠溶液(最终浓度10mM)，以中和BEI。

实施例4

在下文中，描述了MSV(病毒原型株)的替代制备方法，其同样能够制 备(该制备过程的其它步骤根据实施例1进行，其中灭活步骤如实施例3所 述进行)用于成功预防SBV感染的有效疫苗：

5、制备MSV(病毒原型株)

SBV分离株2用于制备MSV(病毒原型株)。涂布有Ma104-Ak(5x10⁷个细胞)的转瓶在moi为0.0001时进行感染。温育54小时以后，在-20℃ 下将转瓶冷冻、解冻并且在2000g下离心5分钟。收集上清液并且分装成1 ml在-80℃下存储备用。

6、制备SBV抗原

将Ma104-Ak(细胞工作母液-WCS)冷冻存储在液氮中。使用EMEM培 养基和10％伽马照射过的FCS将WCS解冻并在细胞培养瓶(T160cm²)上扩 大。使用重组(非动物来源)胰蛋白酶对细胞进行胰蛋白酶消化。一个T160 烧瓶在包含2％FCS的150ml EMEM培养基中进行胰蛋白酶消化和重悬。 使用这种细胞悬浮液在一个转瓶(495cm²)中接种。将包含细胞悬浮液的转瓶 放在37℃的保温箱和0.5rpm的转筒中。涂布12-16小时以后，将细胞以 每瓶5x10⁷的密度进行涂布。采用moi为0.001的感染。细胞在37℃下持 续温育并且在0.5rpm下转动72-96小时，直到特定的SBV细胞病变效应 (CPE)没有达到细胞的约60-70％。此时，将整个转瓶培养瓶在-20℃下冷冻 以及在37℃水浴中解冻并在-80℃下存储备用。

在序列列表中：

SEQ ID NO:1对应于感染性施马伦贝格病毒(BH80/11-4)S片段的完整 基因组序列，

SEQ ID NO:2对应于感染性施马伦贝格病毒(BH80/11-4)M片段的完整 基因组序列，

SEQ ID NO:3对应于感染性施马伦贝格病毒(BH80/11-4)L片段的完整 基因组序列，

SEQ ID NO:4对应于SEQ ID NO:1的反平行(即互补和逆向)RNA序列，

SEQ ID NO:5对应于SEQ ID NO:2的反平行RNA序列，

SEQ ID NO:6对应于SEQ ID NO:3的反平行RNA序列，

SEQ ID NO:7对应于SEQ ID NO:1，其中核苷酸位点9处是“a”而不是 “g”，并且

SEQ ID NO:8对应于SEQ ID NO:7的反平行RNA序列并因此对应于 SEQ ID NO:4，其中核苷酸位点831处为“u”而不是“c”。

参考文献：

本文引用的所有参考文献的全部内容通过援引并入本申请中。

1、B.Hoffmann.,M.Scheuch,D.R.Jungblut,M.Holsteg,H.Schirrmeier,M. Eschbaumer,K.V.Goller,K.Wernike,M.Fischer,A.Breithaupt,T,C.Mettenleiter,M.Beer, Novel orthobunyavirus in Cattle,Europe,2011.Emerg.Infect.Dis.18,469-472(2012).

2、M.-M.Gariglinany et al.,Schmallenberg virus in calf born at term with porencephaly, Belgium.Emerg.Infect.Dis.18(2012),doi:10.3201/eid1806.120104.

3、M.D.Bowen et al.,A reassortant bunyavirus isolated from acute hemorrhagic fever  cases in Kenya and Somalia.Virology.291,185-190(2001).

4、A.M.Q.King,M.J.Adams,E.B.Carstens,E.J.Lefkowitz编著，病毒分类：第九 届国际病毒分类委员会报告(爱思唯尔，美国圣地亚哥，2011)，第725-731页(A.M.Q. King,M.J.Adams,E.B.Carstens,E.J.Lefkowitz,Eds.,Virus Taxonomy:Ninth Report of  the International Committee on Taxonomy of Viruses.(Elsevier,SanDiego,USA,2011),pp 725-731).

5、R.M.Kinney,C.H.Calisher,Antigenic relationships among Simbu serogroup (Bunyaviridae)viruses.Am.J.Trop.Med.Hyg.30,1307-1318(1981).

6、M.F.Saeed,L.Li,H.Wang,S.C.Weaver,A.D.Barrett,Phylogeny of the Simbu  serogroup of the genus Bunyavirus.J.Gen.Virol.82,2173-2181(2001).

7、Bilk S,Schulze C,Fischer M,Beer M,Hlinak A,Hoffmann B.Organ distribution of  Schmallenberg virus RNA in malformed newborns.Veterinary microbiology 2012Mar 30.

8、Kortekaas J,Antonis AF,Kant J,Vloet RP,Vogel A,Oreshkova N,et al.Efficacy of  three candidate Rift Valley fever vaccines in sheep.Vaccine 2012May 14；30(23):3423-9.

9、Kurogi H,Inaba Y,Takahashi E,Sato K,Goto Y,Satoda K,et al.Development of  inactivated vaccine for Akabane disease.National Institute of Animal Health quarterly 1978 Winter；18(3-4):97-108.

10、Kurogi H,Inaba Y,Akashi H,Takahashi E,Sato K,Satoda K,et al.Immune  response of various animals to Akabane disease live virus vaccine.National Institute of  Animal Health quarterly 1979Summer；19(1-2):23-31.