一种肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白和制备方法及其应用

摘要

发明公开了一种肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白及其应用，所述截短蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。还公开了制备上述重组截短蛋白的方法，包括构建表达载体，筛选阳性转化子，提取重组质粒，转化到原核表达宿主菌中表达后分离纯化得到带His标签的MAGE-D4融合蛋白。本发明首次体外表达并获得具有活性的氨基酸序列如SEQ NO.1所示的MAGE-D4重组截短蛋白（1-398aa），该蛋白其具有更强免疫原性和特异性，为下一步制备MAGE-D4多克隆抗体及MAGE-D4血清抗体检测打下基础，为肿瘤的辅助诊断和免疫治疗提供一种新试剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肿瘤相关抗原重组截短蛋白，尤其是一种肿瘤相关抗原MAGE-D4的重组截短蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤，尤其是恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，已成为男性第二位死因，女性第三位死因。近年来，尽管人们在生物医学领域已经取得了长足的进步，但恶性肿瘤的预后结局并没有明显的改善。为此，人们开始寻找新的治疗手段，作为对传统治疗方法的重要补充。其中，肿瘤的免疫治疗因其在预防肿瘤复发、转移、治疗微小残留肿瘤病灶等方面具有独特的优势而引起人们的广泛关注。其分子基础是肿瘤细胞表达的自身特异性抗原不仅可以通过与主要组织相容性复合体（MHC分子）结合激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL），从而特异性杀伤该抗原阳性的肿瘤细胞，同时还能诱导机体产生体液免疫反应，成为肿瘤免疫治疗时早期诊断的重要分子标记物。筛选和鉴定有价值的肿瘤抗原是发展肿瘤免疫治疗手段的重要前提。

MAGE-D4属于黑色素瘤相关抗原（Melanoma-associate antigen, MAGE）家族Ⅱ型基因的新成员，于2001年由Sasaki等采用基因表达系列分析（Serial analysis of gene expression, SAGE）技术时发现。MAGE-D4基因定位于人染色体Xp11，全长7643bp，由13个外显子组成，其中第2、3、12外显子在转录过程中选择性剪接可产生a、b、c 3个变异体，它们在翻译时使用相同的起始密码子，但终止密码子却不同，因此所编码的三种产物的N端348个氨基酸都相同，C端有差异：D4b与D4a相比缺少了C末端的2个氨基酸，D4c则缺少了C端的大部分区域，具有一个独特的66个氨基酸尾部。其中D4a和D4b蛋白含有MAGE家族同源保守序列（MAGE homology domain, MHD），位于421aa-600aa上。

近年来的研究表明，MAGE-D4在人类正常组织中的表达仅限于卵巢和脑，而在胶质瘤、非小细胞肺癌、口腔鳞状细胞癌、乳腺癌、食管癌、肝细胞癌等许多恶性肿瘤中均呈现高表达状态，且与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为有关。也有研究显示MAGE-D4表达阳性与阴性的肿瘤病人在结局预后及对辅助化疗的反应上亦有明显的差别，这些均表明MAGE-D4有可能成为具有潜在应用前景的肿瘤相关抗原，在肿瘤的早期诊断、个体化治疗以及预后预测等方面起重要作用。

目前，一些生物医药公司已经在进行生产抗-MAGE-D4的抗体，例如Sigma aldrich公司针对1-116aa制备的抗体HPA003554；Santa Cruz公司针对23-310aa制备的抗体sc-393203，尽管制备这些抗体的抗原氨基酸序列避开了MHD，但是并没有充分覆盖B细胞抗原表位，因而由这些抗原所制备的抗体，其免疫原性可能存在不足。而针对MAGE-D4全长的抗体，由于MHD的存在，则有可能存在着特异性不足的问题。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的之一是提供一种肿瘤相关抗原MAGE-D4的重组截短蛋白,该重组截短蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。该重组截短蛋白的分子量大小为45 kD。作为可选方式，所述蛋白中还含有his标签，其氨基酸序列如SEQ NO.2所示,即在SEQ NO.1所示截短蛋白首尾增加相应的氨基酸序列,其中1-5aa以及410aa、411aa为外围的非功能（不具备免疫原性）的序列，6-11aa为his标签对应的序列（不具备免疫原性），his标签的存在有利于蛋白的纯化，该蛋白对应的基因序列如SEQ NO.4所示。

本发明的目的之二是提供编码上述肿瘤相关抗原MAGE-D4截短蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ NO.3所示。

本发明的目的之三是提供一种所述SEQ NO.3或SEQ NO.4所示的DNA的获得方法如下：设计合成扩增SEQ NO.3或SEQ NO.4所述基因的PCR引物，以MAGE-D4 mRNA表达阳性的人胶质瘤组织cDNA为模板进行目的基因的扩增,扩增产物经琼脂糖电泳，回收1200bp左右DNA片段。

作为可选方式，所述如SEQ NO.4所示基因的制备方法，具体为：设计合成扩增SEQ NO.4的PCR引物，以MAGE-D4 mRNA表达阳性的人胶质瘤组织cDNA为模板进行目的基因的扩增, 上游引物:5’-GGGAATTC CATATGGCTGAGGGAAGCTTCAGT GCG-3’（下划线为NdeⅠ酶切位点），下游引物:5’-CTAG TCTAGAGGGTATCTGGGACCTCGGGGCCAT-3’（下划线为XbaⅠ酶切位点）,扩增产物经琼脂糖电泳，回收1200bp左右DNA片段。

本发明的目的之四是提供一种上述肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白的制备方法，将SEQ NO.3 或SEQ NO.4所示的DNA序列连接到原核表达质粒，构建表达载体，转化到克隆宿主菌中并筛选得到阳性转化子，提取重组表达质粒，转化到原核表达宿主菌中，经LB（Luria-Bertani）液体培养、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导后，破碎菌体，分离纯化得到MAGE-D4融合蛋白或带有His（组氨酸）标签的MAGE-D4融合蛋白即是MAGE-D4重组截短蛋白。

具体地，一种肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白的方法，包括：

（1）构建重组表达质粒：PCR扩增得到SEQ NO.3或SEQ NO.4所示的DNA序列，连接到pColdⅡ质粒，转化JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选出阳性菌落，提取重组质粒，经PCR验证并测序鉴定正确后，得到阳性转化子；

（2）原核表达及纯化：提取重组质粒，转化到原核表达宿主菌BL-21(DE3)pLyss中，经LB液体培养、IPTG诱导后，破碎菌体，分离纯化得到MAGE-D4融合蛋白或带有His标签的MAGE-D4融合蛋白。

更具体地，一种肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白的方法，包括：

（1）构建重组表达质粒：设计合成扩增SEQ NO.4的PCR引物，以MAGE-D4 mRNA表达阳性的人胶质瘤组织cDNA为模板进行目的基因的扩增, 上游引物:5’-GGGAATTC CATATGGCTGAGGGAAGCTTCAGT GCG-3’（下划线为NdeⅠ酶切位点），下游引物:5’-CTAG TCTAGAGGGTATCTGGGACCTCGGGGCCAT-3’（下划线为XbaⅠ酶切位点）,扩增产物经琼脂糖电泳，回收1200bp左右DNA片段，与pColdⅡ质粒连接，转化JM109感受态细胞，经蓝白斑筛选出阳性菌落，提取重组质粒，经PCR验证并测序鉴定正确后，得到阳性转化子；

（2）原核表达：提取重组质粒，将重组质粒转化到BL-21(DE3)pLyss菌株，得到含有表达载体的宿主菌，将宿主菌接种到LB液体培养基，经扩大培养，加入IPTG低温诱导表达，取出菌液离心，菌体用裂解缓冲液重悬，在冰浴条件下超声破碎，离心，上清液即含融合蛋白；

（3）纯化：将获得的上清液与Ni-NTA纯化树脂结合，冰上孵育2h后，用结合缓冲液充分洗柱，再用含150mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，分管收集，即得到纯化的融合蛋白即重组截短蛋白。

优选的，当上述加入的IPTG的终浓度为1.1mmol/L时融合蛋白的表达量最高。

优选的，加入IPTG后，20℃诱导培养24小时融合蛋白的表达量最高。

本发明的目的之五是提供上述肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白在制备抗肿瘤抗体中的应用。

本发明采用BepiPred方法对MAGE-D4全长蛋白进行抗原表位预测时发现，在6-42aa、317-380aa、384-398aa处存在着3个较强的B细胞抗原表位，经NCBI同源性（conserved domain architecture retrieval tool）比较未发现该区域存在同源保守序列，而这些表位没有完全被现有的商品化抗体（例如Sigma aldrich公司针对1-116aa制备的抗体HPA003554；Santa Cruz公司针对23-310aa制备的抗体sc-393203）所覆盖，发明人认为，这可能是影响抗-MAGE-D4多克隆抗体的效率的原因。

因此，本发明重新设计了新的MAGE-D4的重组截短蛋白（1-398aa），该截短蛋白截去了C端的MAGE家族同源保守序列，排除了MAGE家族其它成员的干扰，尽可能多的覆盖了MAGE-D4的B细胞抗原表位，并在上游引入了对人体无免疫原性的6×His组氨酸标签以方便纯化。利用该截断蛋白制备的多克隆抗体，为广泛应用于WB、IP、IF、ELISA等检测打下基础。

本发明首次在体外表达并获得了具有活性的氨基酸序列如SEQ NO.1所示的MAGE-D4重组截短蛋白（1-398aa），并且实验证实，其具有更强的免疫原性和特异性，为下一步制备MAGE-D4多克隆抗体打下基础，为肿瘤的早期诊断和免疫治疗提供一种新的试剂。

本发明的目的之六是提供上述肿瘤相关抗原MAGE-D4重组截短蛋白在相关抗体检测中的应用。具体为将所述截短蛋白制成相应的抗原性检测试剂，用于检测样品中（如血清中）的是否存在相应的抗体。并可将检测结果作为肿瘤早期诊断的指标。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1 是PCR扩增MAGE-D4基因（SEQ NO.4序列）的电泳图谱，其中1：Marker，2、3：扩增产物。

图2 是PCR鉴定阳性转化子的电泳图谱，1：Marker，2、3：阳性菌落PCR扩增，4：阴性菌落PCR扩增产物。

图3 是pColdⅡ/MAGE-D4（MAGE-D4B）重组质粒的诱导表达的电泳结果；1：Marker，2：pColdⅡ空质粒诱导前，3：pColdⅡ空质粒无诱导，4：pColdⅡ空质粒经IPTG诱导后，5：pColdⅡ/MAGE-D4（MAGE-D4B）重组质粒诱导前，6：pColdⅡ/MAGE-D4（MAGE-D4B）重组质粒无诱导，7：pColdⅡ/MAGE-D4（MAGE-D4B）重组质粒经IPTG诱导后。

图4是MAGE-D4重组截断蛋白的表达形式的电泳鉴定结果；1：Marker，2：菌液离心上清，3：超声处理表达菌BL-21(DE3)pLyss后的上清液，4：超声处理表达菌BL-21(DE3)pLyss后的沉淀。

图5是 Western-blotting鉴定目的蛋白的电泳结果；1：pColdⅡ/MAGE-D4（MAGE-D4B）重组质粒经IPTG诱导后的上清液，2：pColdⅡ空质粒经IPTG诱导后的上清液。

图6 是MAGE-D4融合蛋白的质谱鉴定图。

图7MAGE-D4融合蛋白的分离纯化；1：Marker，2：过柱前的蛋白上清液，3：流穿液，4-6：洗涤液，7-8：含150 mmol/L咪唑的洗脱液。

图8是不同IPTG浓度诱导的MAGE-D4融合蛋白表达量分析电泳图；1：Marker，2-10：IPTG浓度梯度诱导（浓度依次为0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.5、2.0mmol/L）。

图9 是不同诱导时间的MAGE-D4融合蛋白表达量分析电泳图；1：Marker，2：pColdⅡ/MAGE-D4（MAGE-D4B）重组质粒诱导前，3-8：IPTG时间梯度诱导（诱导时间依次为8h、12h、16h、20h、24h、32h）。

图10是三种脑肿瘤患者血清抗MAGE-D4抗体的阳性率。

图11是正常人和肿瘤病人血清抗MAGE-D4抗体值散点图。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书（包括任何附加权利要求、摘要和附图）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1 一种肿瘤相关抗原的MAGE-D4重组截短蛋白，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

实施例2 MAGE-D4重组截短蛋白的表达纯化

1、重组质粒的构建：

（1）确定重组截断蛋白序列：

检索MAGE-D4蛋白序列，联合使用BepiPred 1.0 Server和IEDB系统的BepiPred方法预测MAGE-D4蛋白的B细胞抗原表位，阈值设定为0.35。

根据MAGE家族同源保守序列（MAGE homology domain, MHD）的位置和上述B细胞抗原表位预测结果，申请人确定本发明的截短蛋白区域为1AA-398AA，如SEQ NO.1所示，该区域位于MAGE-D4的N端，截去了起始的信号肽和C端的同源保守序列（421AA-600AA）。

（2）PCR扩增重组截断蛋白的基因并构建相应的原核重组表达质粒

根据截短蛋白区域所对应的mRNA序列，利用Oligo 7软件设计特异性引物：F01 5’-GGGAATTC CAT ATG GCT GAG GGA AGC TTC AGT GCG-3’，R01 5’-CTAG TCTAGA GGG TAT CTG GGA CCT CGG GGC CAT-3’。以MAGE-D4 mRNA表达阳性的人胶质瘤组织cDNA为模板、以F01、R01为引物，参照Takara PrimeSTAR^? HS DNA Polymerase说明书进行目的基因的扩增。反应体系50μl：5×Buffer(含Mg²⁺) 10μl，2.5mol/L dNTP 4μl，上下游引物（20pmol/L）各0.5μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶（2.5U/μl）0.5 μl，胶质瘤cDNA 1μl及灭菌ddH₂O 34.5 μl。PCR扩增条件：95℃ 预变性5min，98℃变性10sec，59℃退火5sec，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃充分延伸5min，4℃保存。所述扩增反应产物的核苷酸序列如SEQ NO.4所示，大小为1233bp，命名为CTF991，其中扩增片段中的核心序列大小为1194bp,(如SEQ NO.3所示)。

将反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳（见图1），用Takara的胶回收试剂盒回收1200bp位置的DNA片段后，进行NdeⅠ、XbaⅠ双酶切，经DNA片段纯化后，与NdeⅠ、XbaⅠ双酶切处理后的pColdⅡ质粒（Takara公司）连接过夜，转化到JM109菌株进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落进行PCR验证（见图2）及DNA测序鉴定，得到阳性转化子。提取阳性转化子的质粒，即得到重组质粒，保存于-20℃备用。

2、原核表达及纯化

（3）原核表达重组截断蛋白

将上述重组质粒转化至BL-21(DE3)pLyss大肠杆菌，37℃倒置培养过夜，得到BL-21(DE3)pLyss重组菌。挑取单菌落接种于20ml LB培养液中，37℃振荡培养8～10h。4000rpm离心5min收集菌体，重悬于3ml LB培养液中。取1 ml上述重悬液转接于20ml LB培养液中，37℃振荡培养2.5h，至OD₆₀₀达到0.4～0.6时，冷却培养液到15℃，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，20℃继续振荡培养24h。4℃离心收集菌体沉淀。按每克菌体沉淀加入3ml过柱平衡液（50mmol/L NaH2PO4;300 mmol/L NaCl; pH 8.0）和4μl PMSF（100mmol/L），反复冻融三次，置冰浴中超声破菌，功率80W，超声0.8sec，间歇0.2sec，共5min。4℃，14,000rmp离心20min，分别取培养液、上清液及沉淀进行10% SDS-PAGE电泳分析（见图3、图4）。从图3和图4中看出，在55KD处出现特异的、大量表达的蛋白条带，表达量占菌体总蛋白的49%。

（4）western-blotting鉴定

按《分子克隆手册》所述方法，取蛋白上清进行Western-blotting鉴定。一抗为抗His-tag小鼠单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L），显色剂为碧云天公司的超敏ECL化学发光试剂盒。结果在55KD处出现单一条带，与SDS-PAGE电泳分析结果一致（见图5）。

SDS-PAGE电泳结束后，取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗30min，将甲醇浸泡过的与胶同样大小的PVDF膜和滤纸，按纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫的结构，装入转印夹。转膜时凝胶侧接负极，PVDF膜侧接正极，电泳槽冰浴，100mA横流转膜1.5h。转膜结束后，用PBST漂洗膜3次，每次5min，然后置于5%的脱脂牛奶中封闭2h；取出PVDF膜置于稀释好的His-tag一抗中，4℃孵育过夜；PBST洗涤3次，每次5min；再用稀释好的二抗溶液室温孵育2h；PBST洗涤3次，每次5min；最后将PVDF膜用ECL化学发光曝光X-光片，显影，定影。

(5)质谱鉴定

在步骤（3）的SDS-PAGE电泳后，将55KD处的目的条带从胶上切下，用ABI4700质谱仪进行MALDI-TOF-TOF MS/MS蛋白质谱鉴定，通过肽段同源性分析证实纯化得到的基因工程蛋白为MAGE-D4截短蛋白（如图6所示）。

（6）重组截断蛋白的分离纯化

取250ml诱导表达的BL-21(DE3) pLyss菌液，经超声裂菌、离心后得到上清液，取上清液用Ni-NTA树脂结合，用12倍柱床体积的过柱平衡液（50mmol/L NaH2PO4;300 mmol/L NaCl; pH 8.0）洗去非特异结合的杂蛋白，含150mmol/L咪唑的洗脱缓冲液（50mmol/L NaH2PO4;300 mmol/L NaCl;150mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗脱带有His标签的融合蛋白，收集蛋白洗脱液，得到了纯化的融合蛋白即本发明的重组截断蛋白目的蛋白，经SDS-PAGE电泳鉴定其纯度，如图7所示。

实施例3 MAGE-D4重组截短蛋白的保存备用

按照实施例2的方法大量诱导BL-21(DE3) pLyss菌液表达目的蛋白，超声离心提取蛋白，并过柱纯化，将收集的蛋白洗脱液在4℃对蒸馏水透析48h，每8h换一次液。透析后的蛋白样品进行冷冻干燥，-80℃保存备用。

实施例4  MAGE-D4重组截短蛋白表达中IPTG浓度的优化

采用本实施例对本发明的重组截断蛋白表达中IPTG的浓度进行优化，其他方法步骤与实施例2相同，不一致的在于以下步骤：

将37℃培养过夜的BL-21(DE3)pLyss重组菌按1∶50转接于含100μg/ml氨卞青霉素及34μg/ml氯霉素的LB培养液，37℃剧烈振荡至OD₆₀₀为0.4～0.6，加入IPTG终浓度分别为0.1mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L、0.9 mmol/L、1.1 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L，20℃继续培养24h后，进行10%SDS-PAGE电泳，观察不同的IPTG浓度对融合蛋白表达量的影响，结果如图8所示。结果显示，在细菌进入对数生长期时（OD₆₀₀约为0.4～0.6），加入终浓度为1.1 mmol/L的IPTG 时，蛋白表达量最高，约占菌体总蛋白的49%；IPTG终浓度在0.1-0.9 mmol/L时，目的蛋白表达量没有明显差别；而当IPTG浓度>1.1 mmol/L时，由于其对细胞的毒性作用反而使蛋白表达量下降。

实施例5 MAGE-D4重组截短蛋白表达中诱导时间的优化

采用本实施例对本发明的重组截断蛋白表达中加入IPTG后的诱导时间进行优化，其他方法步骤与实施例1相同，不一致的在于以下步骤：

将37℃培养过夜的BL-21(DE3)pLys重组菌按1∶50转接于含100μg/ml氨卞青霉素及34μg/ml氯霉素的LB培养液，37℃剧烈振荡至OD₆₀₀为0.4～0.6，加入IPTG终浓度为1.1mmol/L，20℃分别培养8h、12h、16h、20h、24h、32h。进行10%SDS-PAGE电泳，观察不同的诱导时间对融合蛋白表达量的影响，结果如图9所示。电泳图谱经凝胶扫描软件分析的图9显示，在诱导24h时融合蛋白表达量最高，约占菌体总蛋白的49%（见图9）。

实施例6  MAGE-D4抗体血清学检测

将上述除盐、冻干后获得的蛋白溶解于1×PBS缓冲液中，按如下操作步骤进行检测：

①包被：用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液将MAGE-D4蛋白稀释至2μg/ml，每孔100μl包被酶标板，4℃湿盒过夜。次日，弃去孔内液体，PBST（1×PBS+（0.1%）Tween20）洗涤3次，每次3min。

② 封闭：每孔加入200μl 5%脱脂奶粉（1g脱脂奶粉溶于20ml1×PBST中），37℃孵育1hr，洗涤3次。

③ 加血清一抗：加入稀释度为1：200的待检血清、阳性血清和阴性血清，以PBST为空白对照，每孔100μl，37℃孵育1hr，洗涤3次。

④ 加酶标二抗：加入生物素-绵羊抗人IgG单克隆抗体（1：4000）， 每孔100μl ，37℃孵育1hr，洗涤3次。

⑤ 加链霉亲和素：加入HRP-streptavidin（1：4000），每孔100μl,37℃孵育30min，洗涤3次。

⑥ 显色：每孔加入100μl临时配制的TMB显色液，37℃避光15min。

⑦ 终止：每孔加入50μl 2 mol/L H₂SO₄。

⑧ 酶标仪450nm和630nm双波长读数。

检测结果如图10、图11所示。根据图11所述，对63例正常人血清抗MAGE-D4抗体值进行统计分析，划定阳性结果检测阈值（阈值为正常人血清的平均OD450值+3倍标准差，结果为1.0761），当样本的检测值低于该值时判定检测结果为阴性，当样本的检测值高于该值时判定检测结果为阳性，说明检测对象有较大可能患有肿瘤，该检测指标可以作为肿瘤早期诊断的依据之一。按照该阳性阈值，用该重组截短蛋白检测175例脑肿瘤病人血清中抗MAGE-D4抗体，具有较好的效果，胶质瘤患者血清MAGE-D4抗体阳性率为23.8%，与国外文献报道的结果相似（阳性率为17%）（见图10）。

实验证实，采用如SEQ NO.1所示或如SEQ NO.2所示的蛋白作为抗原性检测试剂，进行本实施例所示的MAGE-D4抗体血清学检测的结果是一致的。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。