糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶

摘要

本发明的主题是糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段，其中根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQID:2（野生型）的选自N2、N168和N346的至少一个天冬酰胺残基已被不适于糖基化的一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点。源自成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQID:2（野生型）的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段具有以下取代N2S、N168P、N168SP和N346D的一个或更多个。

说明书

发明简述

本发明的主题是糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)，其中根据成熟米曲霉(Aspergillus oryzae) FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基的至少一个已被不适于糖基化的一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点。

特别地，本发明的主题是糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)，其中：

- 与根据SEQ ID NO: 1的糖基化FAD-GDH相比，所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶显示出了改善了的干燥条件下的温度稳定性，其中所述根据SEQ ID NO: 1的FAD-GDH是通过在米曲霉中的表达可获得的，以及

- 其中根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基的至少一个已被一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点。

本发明进一步涉及生产所述同样的酶的方法，编码所述酶的核酸、载体、宿主细胞，使用所述酶和包含所述酶的装置检测、确定或测量样品中葡萄糖的方法。

发明领域

血糖自我监测对于患有糖尿病的人知道他们的通常葡萄糖水平并将它们用于其治疗来说是重要的。具有葡萄糖底物的酶被用作血糖自我监测的传感器。这些酶的例子包括葡糖氧化酶(EC 1.1.3.4)。葡糖氧化酶具有对葡萄糖的高特异性和具有高的热稳定性这些优点。由于这个原因，在血糖传感器中已使用它作为酶。这样的性质的首次公开追溯到40年以前那么久。在利用葡糖氧化酶的血糖传感器中，当通过氧化将葡萄糖转变为D-葡萄糖酸-d-内酯的过程中所产生的电子经由介质传导给电极时测量血糖水平。然而，葡糖氧化酶存在一个问题，即它往往会将反应产生的质子转移给氧，导致溶解氧不利地影响了测量值。

为解决这样的问题，例如，在血糖传感器中使用NAD(P)依赖性葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)或吡咯喹啉醌（以下在说明书中也称为“PQQ”）依赖性葡萄糖脱氢酶(EC1.1.5.2 (以前为EC1.1.99.17)) 作为酶。它们具有不受溶解氧影响的优点。然而，前一种酶，即NAD(P)依赖性葡萄糖脱氢酶（以下在说明书中也称为“NADGDH”），具有较差的稳定性且很麻烦，需要加入辅酶。后一种酶，即PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶（以下在说明书中也称为“PQQGDH”），具有较差的底物特异性且与葡萄糖以外的其它糖类(saccharides)（例如麦芽糖和乳糖）起反应的缺点，从而损害了测量值的准确度。

进一步地，WO-A1 2004/058958披露了曲霉菌属-结合黄素的葡萄糖脱氢酶。由于该酶对木糖的活性仅有对葡萄糖活性的10%，在测量一个正在进行木糖耐受测试的人的血糖水平的情况下，测量值的准确度可能降低。在50℃下处理15分钟后，该酶具有大约89％的残留活性比，因而显示了良好的热稳定性。WO-A1 2006/101239披露了该酶的基因序列和氨基酸序列。

US-B2 7,662,600提供了经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)，它具有比源自野生型FAD-GDH的FAD-GDH改善了的液体中的热稳定性，经修饰的FAD-GDH优选源自真核生物，更优选丝状真菌，并且进一步优选曲霉菌属真菌，并且，例如那些具有基本结构且至少一个氨基酸取代、缺失、插入或添加到FAD-GDH。

US 2008/220460 A1描述了源自曲霉菌属真菌（例如米曲霉或土曲霉(Aspergillus terreus)）的具有与野生型FAD-GDH相比改善了热稳定性的经修饰的FAD-GDH。US 2008/220460 A1仅专注于由大肠杆菌中的基因重组生产的经修饰的FAD-GDH。因此，所述FAD-GDH是非糖基化的酶变体，它们也仅仅在US 2008/220460 A1中的液体条件下进行了筛选。因此，该文献没有提到对核苷酸序列的特定修饰以获得糖基化的并具有由于潜在糖基化位点的消除或失活而导致的干燥条件下改善了的热稳定性的FAD-GDH变体。

对于FAD-GDH的一些用途来说，干燥条件下的热稳定性是特别重要的。例如，就用于血糖测量的测试条而言，需要改善干化学法(dry chemical)下FAD-GDH的酶学性质。

本发明的主题是提供改善了的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶。特别感兴趣的是在干燥条件下的温度稳定性方面提供这种改善的酶。

发明详述

本发明的主题是糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，其选自：

（a）糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，其中根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基的至少一个已被不适于糖基化的一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点，和

（b）糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，其显示出根据(a)的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶大约80%或更高（优选90％，更优选95％）的氨基酸序列同一性，其中根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2的选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基的至少一个已被不适于糖基化的一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点，和

（c）根据(a)或(b)的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的活性（功能性）片段

条件是与根据(a)的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶相比，在根据(b)的FAD-GDH或者根据(c)的片段中，消除或失活所述潜在一个或更多个糖基化位点的所述一个或更多个取代被保留，以及条件是根据(b)的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或者根据(c)的片段显示出根据(a)的FAD-GDH酶活性的至少80％（优选90％，更优选95％）并显示出根据(a)的FAD-GDH的干燥条件下温度稳定性的至少80％（优选90％，更优选95％），其中“显示出干燥条件下的温度稳定性”的表述意指冻干的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶（FAD-GDH）自身（当包含在冻干组合物中时）的残留活性，所述活性是在以下步骤之后进行计算并与未受压力的冻干物(unstressed lyophilizate)对比：1）冻干并将冻干酶在80℃下在分子筛(3A, MS551, Grace)存在下孵育8天。

应当理解的是，在整个说明书中，百分比值不是绝对值，而是包括± 5%的某些误差界限的相对值。在考虑到本发明的主题时，本领域技术人员会意识到这样的变化是显然的。

术语“其一个或更多个活性片段”或同义词“其一个或更多个功能性片段”是指根据本发明的任意经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，其中缺失根据SEQ ID No. 3至6的相应序列的至少一个氨基酸，条件是这样的片段仍然显示出本发明意义上的酶活性以及干燥条件下的改善了的温度稳定性方面的基本性质。

当与现有技术的那些FAD-GDH相比，根据本发明的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶显示出了干燥条件下改善了的温度稳定性。

这已经通过用不适于糖基化的一个或更多个氨基酸取代根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID No: 2（野生型）的选自N2、N168和N346的至少一个天冬酰胺残基的取代并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点而实现。应当理解的是，显示出上述(a) 的根据本发明的FAD-GDH至少80％（优选90％，更优选95％）氨基酸序列同一性的FAD-GDH也是本发明的主题，条件是它们显示出与根据本发明的FAD-GDH相同的一个或更多个取代并显示出与根据本发明的FAD-GDH基本上相同的性质，那些基本性质是酶活性和干燥条件下改善了的温度稳定性。应当理解的是，也包括显示出与根据本发明的FAD-GDH相同的一个或更多个取代并显示出与根据本发明的FAD-GDH基本上相同性质的所述FAD-GDH的片段，那些基本性质是酶活性和干燥条件下改善了的温度稳定性。

序列同一性可通过BLAST算法即局部序列比对基本检索工具(BLAST) (Altschul, S.F.等，1990. J. Mol. Biol. 215:403；Altschul, S.F.等，1997. Nucleic Acid Res. 25:3389-3402)来确定。上述氨基酸序列同一性百分比是指通过所述BLAST算法确定的序列同一性，其中用于确定同源性的区域是根据(a)的经修饰的FAD-GDH的完整序列，其中根据(a)的FAD-GDH的所述序列是参照序列。

在整个说明书和相应权利要求中，与“一个或更多个序列”相关的术语“成熟”是指相应的一个或更多个蛋白质序列的原始序列形式，没有任何添加的信号序列，例如信号肽或其等价序列。

在整个说明书中，术语“温度稳定性”是指本文提供的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)在其温度变化（特别是温度上升）时，其天然的生物物理和生物化学性质耐受变化的能力。在这一语境下，100％温度稳定性将反映天然的生物物理和生物化学性质不发生改变，当与在暴露于该温度下一段时间(t)之前的酶进行比较时，就酶的特别定义的性质而言。因此，本文提供的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段在暴露于该温度下一段时间(t)期间保持了它的天然酶活性，并例举性地显示出了根据作为具体实施方案的根据实施例3所测量的酶活性，但并不限于此。

在整个说明书全文中，术语“干燥条件”是与根据下文所述实施例7的测试条件具体相关的，即将各个冻干样品在干燥剂（分子筛3A, MS 551, Grace）存在下暴露于80℃下8天，但不限于此。

在整个说明书和相应权利要求的上下文中，“显示出干燥条件下的温度稳定性”的表述意指冻干的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶（FAD-GDH）自身（当包含在冻干组合物中时）的残留活性，所述活性是在以下步骤之后进行计算并与未受压力的冻干物对比：1）冻干并将冻干酶在80℃下在分子筛(3A, MS551, Grace)存在下孵育8天。

“未受压力的冻干物”是已被冻干的但是未在80℃下在分子筛(3A, MS551, Grace)存在下孵育8天的酶部分。“未受压力的冻干物”意指在冻干后确定温度稳定性。这意味着在确定温度稳定性之前既不储存也不处理该未受压力的冻干物。可根据实施例7确定干燥条件下的温度稳定性，但并不限于此。

在另一具体实施方案中，本发明也预期了经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，其序列是本文提供的SEQ ID No. 3至6序列的功能性等价物。在本发明上下文中，功能性等价物是与SEQ ID No. 3至6序列中提供的至少一个氨基酸不同的氨基酸序列分子，它编码具有相同或类似功能的蛋白质/酶，特别是就酶活性和干燥条件下的热稳定性而言。

在本发明进一步的具体实施方案中，根据本发明的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的功能性等价物是与SEQ ID No. 3至6具有同源性的氨基酸序列。在本发明的具体实施方案中，同源性程度或百分比是SEQ ID No. 3至6的至少80、90、95、99或100%；条件是它们显示出与上述(a)同样的取代并显示出与根据本发明的FAD-GDH基本相同的性质，那些基本性质是酶活性和干燥条件下改善了的温度稳定性。应当理解的是，也包括根据本发明的所述FAD-GDH的活性片段，它们显示出与根据本发明的FAD-GDH同样的取代并显示出与根据本发明的FAD-GDH基本相同的性质，那些基本性质是酶活性和干燥条件下改善了的温度稳定性。

同样适用于功能性等价核苷酸序列分子，它具有不同于SEQ ID No. 13或其互补序列的核苷酸序列，但编码完全相同的蛋白质/酶。

在进一步的具体实施方案中，如SEQ ID No. 13所给出的核苷酸分子功能性等价物是RNA分子，它由所述DNA序列或者与SEQ ID No. 13的序列基本互补的序列所编码。

本发明上下文中的术语“RNA分子”意指核糖核苷酸分子的线性多聚体，它是单链的并用作本文提供的根据SEQ ID No. 3至6的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的蛋白质合成的模板。

本发明上下文中的“干燥剂”是例如硅胶、硫酸钙、氯化钙和分子筛的干燥剂，但并不限于此。

特别地，本发明的主题是糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段，其中：

- 与根据SEQ ID No: 1的糖基化FAD-GDH相比，所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶显示出干燥条件下改善了的温度稳定性，其中根据SEQ ID No: 1的所述FAD-GDH可通过在米曲霉中表达而获得，以及

- 其中根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基的至少一个已被不适于糖基化的一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点。

经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)是糖基化的。在本发明的一个实施方案中，与根据SEQ ID NO: 1的糖基化FAD-GDH相比，所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段显示出更均一的糖基化模式（具有更小的分子量分布），其中根据SEQ ID No: 1的所述FAD-GDH可通过在米曲霉中的表达而获得。在另一具体实施方案中，根据本发明的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段显示出大约103 876的重均分子量(M_w)和大约99 901的数均分子量(M_n)。重均分子量(M_w)和数均分子量(M_n) 是根据Viscotek Triple Detektors（折射率 (RI)和直角光散射(RALS)）的原始数据借助软件计算的。M_W/M_n比是多分散性并给出了蛋白质的大小分布。单分散性蛋白质具有1的M_W/M_n值。

因此，在本发明的一个实施方案中，包含根据本发明的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段的组合物显示的所述组合物中所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的分子量分布如下：大约103 876的重均分子量(M_w)和大约99 901的数均分子量(M_n)。这样的组合物是本发明的另一个实施方案。

进一步地，本发明的一个实施方案是糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段，其中根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基的至少一个已被不适于糖基化的一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点，且其中糖基化程度< 50%，优选< 40%以及更优选< 30%，和/或M_w/M_n比< 1.02，更优选< 1.01（这些值的计算参见例如实施例4）。

此外，经修饰的FAD-GDH或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段也是本发明的主题，其中根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基的至少一个已被一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点，并且其中包含所述经修饰的FAD-GDH的组合物显示出M_w/M_n比< 1.02的分子量分布，更优选所述组合物中的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的M_w/M_n比< 1.01，和/或其中所述经修饰的FAD-GDH的糖基化程度< 50%，优选< 40%以及更优选< 30%。这样的组合物是本发明的另一个实施方案。

可根据以下公式计算糖基化程度：

(M_w (糖基化酶) – M_w (根据蛋白质序列的无糖基化的酶))*100%。对于根据表3的例举性酶，可进行如下计算（参见实施例4）：

FAD-GDH变体1 (SEQ ID No: 3)：

(76333-61461)/61461*100%=24%

曲霉菌属FAD-GDH (SEQ ID No: 1) ：

(103876-61592)/61592*100%=69%。

这意味着与根据SEQ ID No: 1的糖基化FAD-GDH相比，根据本发明的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其片段显示出更均一的糖基化模式（具有更小的分子量分布），其中根据SEQ ID No: 1的所述FAD-GDH可通过在米曲霉中的表达而获得，和/或根据本发明的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其片段显示出比根据SEQ ID No: 1的FAD-GDH更低的糖基化程度，其中根据SEQ ID No: 1的所述FAD-GDH可通过在米曲霉中的表达而获得。

在本发明的一个具体实施方案中，冻干的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段的残留活性是至少80％，优选至少84％，所述活性是在以下步骤之后进行计算并与未受压力的冻干物对比：1）冻干并将冻干酶在80℃下在分子筛(3A, MS551, Grace)存在下孵育8天。

酶活性可根据实施例3 i)例举性确定，但并不限于此。

根据本发明的经修饰的FAD-GDH或其活性片段的糖特异性是与糖基化的成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的糖特异性大约相同的，即对于麦芽糖< 0.5%以及对于半乳糖< 13%；糖特异性的计算参见实施例3 ii)。

在具体实施方案中，根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的选自N2、N168和N346的所述天冬酰胺残基的至少一个已被选自Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val的一个或更多个氨基酸取代。在更具体的实施方案中，根据米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的选自N2、N168和N346的所述天冬酰胺残基的至少一个已被选自Arg、Asp、Gln、Glu、Gly His、Lys、Met、Pro、Ser和Thr的一个或更多个氨基酸取代。

本发明的另一具体实施方案中，提供了经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段，其中只有一个选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基已被一个或更多个氨基酸取代，这导致了相应糖基化靶位点的失活（或缺失）。

本发明的另一具体实施方案中，提供了根据上述实施方案的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段，其中所述天冬酰胺残基已被S、P、SP或D取代。

根据本发明的具体实施方案是经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段，其中源自成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶具有至少一个以下取代：N2S、N168P、N168SP和N346D。在该语境中，N168SP意指根据SEQ ID No: 2（野生型）的168位天冬酰胺残基已被丝氨酸(S)和脯氨酸(P)取代。

本发明的特别具体的实施方案是提供经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段，其中源自成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶具有一个或更多个以下取代：N2S、N168P、N168SP和N346D。

本发明的另一具体实施方案是，所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段仅具有以下取代之一：N2S、N168P、N168SP和N346D。

本领域技术人员会理解，所述经修饰的FAD-GDH可具有或可没有不同于前述取代的进一步修饰。同样适用于所有上文提到的和所有下文提到的根据本发明的经修饰的FAD-GDH。

本发明的另一特别具体的实施方案是提供经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段，其中源自成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶具有根据SEQ ID NO: 3的特定取代N2S。

本发明的另一具体实施方案是提供经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段，其中源自成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶具有根据SEQ ID NO: 4的取代N168P。

本发明的另一具体实施方案是提供经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段，其中源自成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶具有根据SEQ ID NO: 5的以下取代N168SP。

本发明的另一具体实施方案是提供经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或对其显示出至少80％（优选至少90％，更优选至少95％）序列同源性的FAD-GDH或其功能性片段，其中源自成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶具有根据SEQ ID NO: 6的以下取代N346D。

本发明也包括显示出与所有上述酶具有至少70％序列同源性、优选80％、更优选90％、最优选95％序列同源性的酶，条件是具体而言，对于根据序列SEQ ID No. 3至6提供的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，特征性酶活性和温度稳定性，特别是在干燥条件下，与整个说明书中提到的保持基本相同，当所述酶活性是根据实施例3 i)例举性确定时，但并不限于此。

本发明的另一具体实施方案是编码根据本发明的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段的分离的多核苷酸，条件是所述分离的多核苷酸不编码源自米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）具有选自N168K、N168P、N168Y或N168W的单一取代的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段。分离的多核苷酸可以是编码序列表部分明确列出的以下序列的DNA或RNA分子或其相应基因：

SEQ ID No: 3，其中2位天冬酰胺残基被丝氨酸残基替换。

SEQ ID No: 5，其中168位天冬酰胺残基被两个氨基酸即丝氨酸和脯氨酸替换。

SEQ ID No: 6，其中346位天冬酰胺残基被天冬氨酸残基替换。

本发明的另一具体实施方案是包含一个或更多个由本发明提供的经修饰的FAD-GDH的组合物，对其相关序列或同源序列没有任何限制。

本发明的另一具体实施方案是包含一个或更多个分离的多核苷酸的组合物，所述多核苷酸是由本发明提供的DNA或RNA分子或者相应基因。然而，根据本发明的所述分离的多核苷酸不编码源自米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）具有选自N168K、N168P、N168Y或N168W的单一取代的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段。

本发明的另一个实施方案是含有根据本发明的分离的多核苷酸的表达载体。然而，根据本发明的所述分离的多核苷酸不编码源自米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）具有选自N168K、N168P、N168Y或N168W的单一取代的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段。所述表达载体可以可操作地连接到能够引导它在宿主细胞中表达的启动子序列上。该研究中的特定载体是表达载体pPICZαA (Invitrogen)。该质粒允许在大肠杆菌中复制（pUC复制起点）用于克隆表达构建体以及在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的重组基因表达，通过使用AOX1启动子/AOX1终止子序列（进一步的细节参见图1）。

可用于本发明的表达载体通常含有复制起点(ori)、用于选择的抗生素抗性、用于表达的启动子和经修饰的FAD-GDH基因变体的全部或部分。然而，根据本发明的所述基因变体不编码源自米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）具有选自N168K、N168P、N168Y或N168W的单一取代的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段。

表达载体也可包括本领域已知的其它DNA序列，如信号序列（为更好折叠、转运到周质中或分泌）、为了更好调节表达的诱导物、或者用于克隆的切割位点。所选表达载体的特征必须与待使用的宿主细胞相容。可使用合适的复制起点例如ColE1质粒复制起点。合适的启动子包括例如lac和trp。表达载体包括编码选择标记（例如抗生素抗性基因）的序列也是合意的。作为选择标记，可以方便地使用氨苄青霉素抗性或卡那霉素抗性。所有这些材料都是本领域已知的，并且是市售的。

包含所希望的编码序列和控制序列的合适表达载体可以采用本领域已知的标准重组DNA技术构建，所述技术中的许多技术描述于Sambrook等，载于“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(1989) Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbour Laboratory Press。

本发明的另一个实施方案是包含根据本发明的表达载体的宿主细胞。本领域技术人员会理解，根据本发明的所述宿主细胞必须适于糖基化。因此，根据本发明的宿主细胞——作为必要条件——具有内源糖基化酶类，特别是用于N-连接糖基化。

因此，本发明的另一个实施方案是包含根据本发明的表达载体的宿主细胞，条件是所述宿主细胞通过具有内源糖基化酶类能够糖基化，特别是N-连接糖基化。

本发明的另一具体实施方案是包含根据本发明的表达载体的宿主细胞，条件是所述宿主细胞通过具有内源糖基化酶类能够糖基化，特别是N-连接糖基化，并且所述宿主细胞不是大肠杆菌株。

“糖基化酶”催化将碳水化合物即糖基供体连接到另一分子的羟基或其它官能团上的反应。这是将聚糖连接到蛋白质、脂类、或其它有机分子上的酶学过程。糖基化是共翻译和翻译后修饰的形式。在粗面内质网中合成的大多数蛋白质都经过糖基化。它是酶引导的位点特异性过程，是与“糖化(glycation)”的非酶的化学反应相对的。

根据本发明，“通过具有内源糖基化酶类能够糖基化特别是N-连接糖基化的宿主细胞”源自但不限于以下的宿主细胞：黑曲霉(Aspergillus niger)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、米曲霉、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。合适的毕赤酵母宿主细胞包括但不限于可得自Invitrogen (5791 Van Allan Way, Carlsbad, CA 92008, USA)的巴斯德毕赤酵母X33或巴斯德毕赤酵母KM71H。

本领域技术人员会意识到，天然大肠杆菌株通常缺乏糖基化系统，且因此不表达糖基化蛋白质。只有在糖基化系统已被遗传工程改造到大肠杆菌中（例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的N-连接糖基化系统）的情况下，它们才能够产生糖蛋白。

宿主细胞优选包含表达载体，所述表达载体包含编码根据本发明的具有一个或更多个突变的经修饰的FAD-GDH酶的DNA序列之一的全部或部分。

根据SEQ ID No.: 01的酶可在米曲霉中表达且可按照例如日本专利JP 2010/239969、US-A1 20090259024、US-A 20090155848、US-A1 020080090278；US-A1 20080020426、US-A1 20080014612、US-A1 20080014611、US-A1 20080003628、US-B2 7,871,805、US-B2 7,741,100、US-B2 7,655,130、US-B2 7,553,649和US-B2 7,494,794中所述进行表达。

根据本发明的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的重组生产可以在本领域已知的宿主中进行。合适的宿主可选自丝状真菌株例如黑曲霉、酱油曲霉和米曲霉。合适的宿主可选自酵母株例如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母和多形汉逊酵母。合适的毕赤酵母宿主细胞包括例如可得自Invitrogen (5791 Van Allan Way, Carlsbad, CA 92008, USA)的巴斯德毕赤酵母X33或巴斯德毕赤酵母KM71H。

本领域技术人员理解的是，按照本发明的经修饰的FAD-GDH可具有或者可没有不同于前述一个或更多个修饰的进一步修饰。

在具体实施方案中，根据本发明的经修饰的FAD-GDH或其功能性片段可通过在酵母特别是巴斯德毕赤酵母中表达编码根据本发明的所述经修饰的FAD-GDH的多核苷酸而获得。

可通过本领域已知的各种方法将表达载体引入宿主细胞中。例如，可通过聚乙二醇介导的原生质体转化法(Sambrook等，1989，见上文)进行用表达载体的宿主细胞的转化。然而，也可以使用用于将表达载体引入宿主细胞中的其它方法，例如电穿孔、弹道式DNA注射(ballistic DNA injection)或原生质体融合。

合适的宿主细胞可以是但不限于酵母细胞如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母或多形汉逊酵母，或者丝状真菌如黑曲霉或酱油曲霉。

本发明的具体实施方案是包含根据本发明的表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞来自酵母，特别是巴斯德毕赤酵母。

一旦已将包含经修饰的FAD-GDH变体的表达载体引入合适的宿主细胞中，则可以在允许所希望的经修饰的FAD-GDH变体表达的条件下培养所述宿主细胞。可通过例如抗生素选择或营养缺陷型突变体的互补以及在基本培养基上选择(J. Sambrook, D. W. Russell: “Molecular Cloning: a laboratory manual”，第3版，Cold Spring Harbor, New York (2001))而容易地鉴别包含所希望的表达载体的宿主细胞，其中所述表达载体具有编码全部或部分经修饰的FAD-GDH的DNA序列。经修饰的FAD-GDH变体的表达可通过不同方法鉴别，例如测量FAD-GDH mRNA转录物的产生、免疫学检测基因产物或检测基因产物的酶活性。优选应用酶学测定。

本领域技术人员应当理解，并不是所有的表达载体和DNA调节序列都能同样好地用来表达本发明的DNA序列。也不是所有的宿主细胞用相同表达系统都可以同样好地起作用。然而，在不需过度实验的情况下，本领域普通技术人员采用本文中提供的指南会在表达载体、DNA调节序列和宿主细胞中做出合适的选择。就此而言应当理解的是，本发明的另一具体实施方案提供了包含根据本发明的表达载体的合适宿主细胞，所述表达载体包括编码经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段的分离的多核苷酸，其源自米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）具有选自N168K、N168P、N168Y或N168W的单一取代，条件是所述宿主细胞通过具有内源糖基化酶类能够糖基化，特别是N-连接糖基化，并且所述宿主细胞不是大肠杆菌株。

本发明的另一个实施方案是生产经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段的方法，所述方法包括培养根据本发明的转化体。

本发明也涉及生产本发明FAD-GDH变体的方法，包括在适合于生产本发明经修饰的FAD-GDH的条件下培养本发明的宿主细胞。对于细菌宿主细胞而言，典型培养条件是含有碳和氮源、合适抗生素和诱导剂（取决于所使用的表达载体）的液体培养基。典型的合适抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素（以及用于巴斯德毕赤酵母的博来霉素(Zeomycin)）等。典型诱导剂包括IPTG、葡萄糖、乳糖（用于大肠杆菌）以及用于巴斯德毕赤酵母的甲醇等。

本发明的另一个实施方案是，本发明的多肽是通过在表达编码经修饰的FAD-GDH的DNA序列的宿主细胞中生产来获得的。本发明的多肽也可通过体外翻译mRNA来获得，该mRNA由编码经修饰的FAD-GDH的DNA序列编码。例如，可以如上所述合成DNA序列并将其插入到合适的表达载体中，其进而可以用于体外转录/翻译系统。

包含以上定义和描述的分离多核苷酸的表达载体代表本发明的另一具体实施方案，其中所述分离多核苷酸与能够在无细胞的肽合成系统中启动其表达的启动子序列可操作地连接。

然后，可以采用各种常规蛋白质纯化技术分离并纯化例如通过如上所述的程序生产的多肽。例如，可以使用层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析。

因此，本发明的另一主题是可通过本发明的方法获得的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段。

本发明的改善了的FAD-GDH变体的主要应用之一是用于测试条以监测糖尿病患者先体外后体内(ex vivo)样品的血糖水平。当然，可研究多种样品。体液如血清、血浆、肠液或尿液是这些样品的优选来源。

本发明的FAD-GDH变体特别适用于在测试条中使用，因为与根据现有技术的FAD-GDH相比，它们显示出了更均一的糖基化模式和更小的分子量分布以及干燥条件下改善了的温度稳定性。术语“干燥条件下”已在上文定义。

本发明的另一主题是使用根据本发明的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段检测、确定或测量样品中葡萄糖的方法，所述检测、确定或测量包括将样品与所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段接触。根据本发明的所述方法的具体实施方案是一种方法，其中使用传感器或测试条装置进行葡萄糖的所述检测、确定或测量。

用于检测、确定或测量样品中葡萄糖的装置也属于本发明范围，所述装置包含根据本发明的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段，特别是连同样品中葡萄糖的所述检测、确定或测量所需要的其它试剂。

本发明的具有改善的热稳定性的FAD-GDH变体也可以有利地在生物传感器中使用(D’Costa, E. J.等，Biosensors 2 (1986) 71-87；Laurinavicius, V.等，Analytical Letters 32 (1999) 299-316；Laurinavicius, V.等，Monatshefte fuer Chemie 130 (1999) 1269-1281；Malinauskas, A.等，Sensors and Actuators, B: Chemical 100 (2004) 395-402) 用于在线监测样品或反应器中的葡萄糖。为此目的，FAD-GDH变体例如可用于包被具有锇络合物的氧不敏感玻璃电极，所述络合物含有氧化还原导电环氧化物网格(Ye等，1993，见上文)用于更准确地确定葡萄糖浓度。

根据以上所述，本发明进一步的特定方面如下：

本发明的第一方面涉及糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，其选自：

（a）糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，其中根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）的选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基的至少一个已被不适于糖基化的一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点，和

（b）糖基化的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶，其显示出对根据(a)的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶大约80%或更高的氨基酸序列同一性，其中根据成熟米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2的选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基的至少一个已被不适于糖基化的一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点，和

（c）根据(a)或(b)的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的活性片段，条件是与根据(a)的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶相比，在根据(b)的FAD-GDH或者根据(c)的片段中，消除或失活所述潜在一个或更多个糖基化位点的所述一个或更多个取代被保留，以及条件是根据(b)的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或者根据(c)的片段显示出根据(a)的FAD-GDH酶活性的至少80％并显示出根据(a)的FAD-GDH的干燥条件下温度稳定性的至少80％，其中“显示出干燥条件下温度稳定性”的表述意指冻干的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶（FAD-GDH）自身（当包含在冻干组合物中时）的残留活性，所述活性是在以下步骤之后进行计算并与未受压力的冻干物对比：1）冻干并将冻干酶在80℃下在分子筛(3A, MS551, Grace)存在下孵育8天。

本发明的第二方面涉及根据第一方面的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段，其中与根据SEQ ID NO: 1的糖基化FAD-GDH相比，所述的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶显示出了改善了的干燥条件下的温度稳定性，其中所述根据SEQ ID NO: 1的FAD-GDH可通过米曲霉中的表达获得。

本发明的第三方面涉及根据第一或第二方面的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段，其中所述的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段显示出< 50％的糖基化程度，和/或M_w/M_n比例< 1.02。

本发明的第四方面涉及根据第一至第三方面任一方面的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段，其中选自N2、N168和N346的天冬酰胺残基的仅一个已被不适于糖基化的一个或更多个氨基酸取代，并从而分别消除或失活了该位置的潜在糖基化位点。

本发明的第五方面涉及根据第一至第四方面任一方面的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段，其中源自米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID NO: 2（野生型）的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段具有以下取代N2S、N168P、N168SP和N346D的一种或更多种。

本发明的第六方面涉及根据第一至第五方面任一方面的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段，其中源自米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID NO: 2（野生型）的所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段具有以下取代N2S（SEQ ID NO:3）。

本发明的第七方面涉及包含根据第一至第六方面任一方面的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段的组合物，其中所述的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段显示出< 50％的糖基化程度，和/或M_w/M_n比< 1.02。

本发明的第八方面涉及编码根据第一至第六方面任一方面的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段的分离的多核苷酸，条件是所述的分离的多核苷酸不编码源自米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）具有选自N168K、N168P、N168Y或N168W单一取代的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段。

本发明的第九方面涉及包含根据第八方面的分离的多核苷酸的表达载体。

本发明的第十方面涉及包含根据第九方面的表达载体的宿主细胞，包括编码源自米曲霉FAD-GDH野生型序列SEQ ID: 2（野生型）具有选自N168K、N168P、N168Y或N168W的单一取代的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段的分离的多核苷酸，条件是所述宿主细胞通过具有内源糖基化酶类能够糖基化，特别是N-连接糖基化，以及所述宿主细胞不是大肠杆菌株。

本发明的第十一方面涉及用于生产经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段的方法，所述方法包括培养根据第十方面的转化体。

本发明单的第十二方面涉及可通过第十一方面的方法获得的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段。

本发明的第十三方面涉及用于检测、确定或测量先体外后体内样品中葡萄糖的方法，使用根据第一至第六方面或第十二方面任一方面的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段或者根据第七方面的组合物，所述检测、确定或测量包括将先体外后体内样品分别与所述经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段或者组合物接触。

本发明的第十四方面涉及第十三方面的方法，其中使用传感器或测试条装置进行葡萄糖的所述检测、确定或测量。

本发明的第十五方面涉及用于检测、确定或测量先体外后体内样品中葡萄糖的装置，包含根据第一至第六方面或第十二方面任一方面的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其活性片段或者根据第七方面的组合物。

在以下实施例中，所有的试剂、限制性酶和其它材料都获自Roche Diagnostics Germany（除非具体说明其它商业来源），并且按照供应商提供的说明来使用。用于纯化、表征和克隆DNA的操作和方法是本领域熟知的(Ausubel, F.等，载于"Current protocols in molecular biology" (1994), Wiley)，并且可根据技术人员的要求进行修改。

以下实施例进一步阐明本发明。这些实施例不是用来限制本发明范围，而是提供对本发明的进一步理解。

实施例

实施例1

经修饰的FAD-GDH的表达

为产生用于在毕赤酵母中重组表达FAD-GDH变体的合适载体，使用了连接到质粒pBluescript SK (Stratagene, La Jolla)衍生质粒中的合成FAD-GDH野生型基因(SEQ ID No: 7)。第一步，通过沉默突变消除限制性内切酶XhoI的固有识别位点而产生SEQ ID No: 10，通过使用Quick Change II位点特异性诱变试剂盒(Stratagene, La Jolla)和突变引物(SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9)。使用该构建体作为模板经PCR扩增添加侧翼序列，所述侧翼序列包括5’-端XhoI位点和3’-端AgeI位点，所述PCR使用SEQ ID No: 11和SEQ ID No: 12的PCR引物。扩增后，用限制性内切酶XhoI和AgeI (New England Biolabs)水解PCR产物并连接到经XhoI/AgeI水解的表达载体pPICZαA (Invitrogen)中，得到编码α-因子信号序列、蛋白水解切割位点(KEX2)和成熟FAD-GDH的融合基因(SEQ ID No: 13)。

为引入单个氨基酸取代，使用携带SEQ ID No: 13的pPICZαA作为模板用于位点特异性诱变。对于个别取代，根据制造商说明使用表1中可见的诱变引物对连同Quick Change II位点特异性诱变试剂盒(Stratagene, La Jolla)。

表1：氨基酸取代，诱变引物对和所得到的序列

为产生相应的重组表达株，用5-10 μg的携带编码相应FAD-GDH变体的DNA (分别是SEQ ID No: 16, No: 19, No: 22和No: 25)的线性化pPICZαA经电穿孔转染巴斯德毕赤酵母株X33 (Invitrogen)的电感受态细胞。所有实验步骤根据制造商说明进行。将转染的细胞铺平板在含有100 μg/ml、250 μg/ml或500 μg/ml博来霉素作为选择标记的YPD琼脂平板（1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％右旋糖（葡萄糖））上，在28℃孵育2-3天。

为测试转染的巴斯德毕赤酵母克隆的产率，从选择平板上挑取许多单个集落并接种在4 ml的BMMY培养基（1％酵母提取物、2％蛋白胨、100 mM磷酸钾、pH 6.0、1.34％酵母氮源(YNB, Invitrogen)、0.0004％生物素）中。通过每天加入0.5％甲醇诱导重组基因的表达。将培养物接种在200 rpm，28℃下至多7天。用分光光度法(O.D.₆₀₀)测量细胞密度。在分光光度酶学测定中确定上清液中的FAD-GDH活性。

最后将最佳的生产菌转移到10 L发酵中以获得用于纯化和生化表征不同FAD-GDH变体的足够材料。

实施例2

经修饰的FAD-GDH的纯化

通过超滤/超透析将来自发酵的1L空白过滤的上清液浓缩到0.05 L，并使用20 mM磷酸钾缓冲液调节到pH 7.5。然后，通过加入固体硫酸铵将上清液调节到2.5 M的硫酸铵浓度。在室温孵育大约1h后，离心溶液并丢弃沉淀。将清澈的上清液施加到1000 ml苯基琼脂糖柱上。用pH 7.5且2.5 M的硫酸铵浓度的3 L 20 mM磷酸钾缓冲液洗涤柱子后，通过pH 7.5且2.5 M的硫酸铵浓度的20 mM磷酸钾缓冲液与pH 7.5的20 mM磷酸钾缓冲液的线性梯度(5 L)洗脱。收集含有FAD-GDH的级分，纯化，并通过超滤/超透析浓缩成大约0.05 L，在pH 8.5的20 mM Tris/HCl缓冲液中浓缩。将样品加到500 ml Q-琼脂糖柱上，用pH 8.5的2.5 L 20 mM Tris/ HCl缓冲液洗涤，通过含有100 mM NaCl的pH 8.5的20 mM Tris/HCl缓冲液的线性梯度(5L)洗脱。收集含有FAD-GDH的级分，纯化，并在pH 7.1的100 mM PIPES缓冲液中通过超滤/超透析浓缩成大约50 mg/ml的蛋白浓度。冻干所得到的样品。

实施例3

经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶或其功能性片段的酶活性和糖特异性

i) 确定酶活性（1M D-葡萄糖作为底物）

混合pH 6.5的50 mM PIPES缓冲溶液（包括0.1 % Triton X-100）、163 mM PMS溶液、6.8 mM 2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)溶液、1 M D-葡萄糖溶液、15.6 ml的前述PIPES缓冲液、0.2 ml的DCPIP溶液和4 ml的D-葡萄糖来制备反应试剂。

ii) 确定糖特异性（1M麦芽糖或1M木糖作为底物）

混合pH 6.5的50 mM PIPES缓冲溶液（包括0.1 % Triton X-100）、163 mM PMS溶液、6.8 mM 2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)溶液、1 M D-麦芽糖或D-木糖溶液、15.6 ml的前述PIPES缓冲液、0.2 ml的DCPIP溶液和4 ml的D-麦芽糖或D-木糖溶液来制备反应试剂。

酶活性和糖特异性的测量条件

在37℃预热2.9 ml的各个反应试剂5分钟。加入0.1 ml FAD-GDH溶液并缓慢混合。使用水作为参照在37℃下600 nm处校准分光计5分钟。由线性部分确定每分钟的吸光度变化(Δ OD _测试)。作为空白测试，以上述相同方式确定每分钟的吸光度变化(Δ OD _空白) ，除了将FAD-GDH溶液的溶剂添加到试剂中而不是FAD-GDH溶液中。根据由此获得的值，经以下方程计算FAD-GDH活性。在本发明中，一个单位(U)的FAD-GDH活性定义为每分钟减少1 μmol的DCPIP的酶的量，其中存在

i) 200 mM D-葡萄糖用于确定酶活性

ii) 200 mM D-麦芽糖或D-木糖用于确定糖特异性。

活性(U/ml)={- (Δ OD _测试- Δ OD _空白) × 3.0 ×稀释比例}/{16.3 × 0.1 × 1.0}

在方程中，3.0是各个反应试剂 + 酶溶液的量(ml)，16.3是测量本发明活性的条件下的毫摩尔分子吸收系数(cm²/微摩尔)，0.1是酶溶液的量(ml)以及1.0是吸收池的光学光程9(cm)。

实施例4

通过SEC-RALS确定的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的分子量分布

将pH6.9的含300 mM NaCl的50 mM磷酸钾缓冲液中的具有大约10 mg/ml浓度的10 μl蛋白质溶液加到G3000SWXL TSKgel柱(30 cm, Tosoh Biosep)上。HPLC泵的流速是0.7 ml/min。为校准Viscotek Triple检测器，使用新鲜制备的牛血清白蛋白溶液(Albumin RPLA4, Art.-Nr. 11 726 544, Roche Diagnostics GmbH)。对所有样品的评估使用0.185的dn/dc值。使用软件OmniSEC 4.7.0 (Malvern Instruments)进行评估。借助软件由Viscotek Triple Detektors的原始数据（折射率(RI)和直角光散射(RALS)）计算重均分子量(M_W)和数均分子量(M_n)。M_W/M_n比是多分散性并给出了蛋白质的大小分布。单分散性蛋白质具有1的M_W/M_n值。

实施例5

用C-亚硝基苯胺介质进行的FAD-GDH活性测定

溶液1(S1)

25 mM N,N-双-(羟乙基)-3-甲氧基-亚硝基苯胺盐酸盐(CAS 733686-00-5) 于pH 7.1的100 mM Pipes缓冲液中，含5%(w/v) PVP (聚乙烯吡咯烷酮USP K25, FLUKA #81399)。

溶液2(S2)

饱和的~15% (w/v) 2,18 磷钼酸钠盐((Na₆[P₂Mo₁₈O₆₂] *24 H₂O) CAS 50811-90-0, Honeywell Specialty Chemicals, Article No. 04137)于水中。

溶液3 (S3)

1 M葡萄糖于水中。

酶溶液

将10 mg/ml冻干的酶溶解在pH 7.1的100 mM Pipes缓冲液中。

将该溶液在pH 7.1的100 mM Pipes缓冲液中以大约1:100稀释以得到0.02-0.05 Δ E/min的速度。

测量程序

表2

在25℃下测量724 nm处吸光度20 min。

葡萄糖的K_M-值

通过改变S3中的葡萄糖浓度使得反应混合物中的葡萄糖浓度在0.1-170 mM的范围内变化。

对于计算K_M值，将测得的FAD-GDH活性拟合到米氏方程(Michaelis-Menten equation)：

v = 测得的FAD-GDH活性

V_Max = 最高的FAD-GDH活性

K_M = mM为单位的米氏(Michaelis-Menten)常数

c = mM为单位的葡萄糖浓度。

实施例6

在液体中的温度稳定性

每ml溶解10 mg冻干的酶到pH 7.1的100 mM Pipes缓冲液中。将1 ml该溶液的等份试样储存在封闭的塑料小瓶中，在控温水浴中孵育至多12天。根据实施例3测量酶活性。

实施例7

干燥条件下的温度稳定性

借助分析天平确定玻璃容器的空重量。称量10 mg的冻干酶样品。通过确保内部空间与环境的受控气体交换但防止样品脱离容器的方式用塞子封闭所有容器。在干燥剂（分子筛3A, MS 551, Grace）存在下于干燥器中暴露样品于80℃下8天。这段时间后，将样品冷却到室温，进一步允许与环境的气体交换。此后，将容器完全封闭，并确定各自的重量。与酶的初始量无关，用超纯水稀释样品到10 mg/ml的终浓度，通过轻轻涡旋完全溶解。在室温下储存样品进行重构恰好一个小时，且此后用冰冷却。基于该原液，在冰冷的工作缓冲液中进行稀释，然后确定活性。

结果

表3：例举性分子量分布：SEQ ID No.1和SEQ ID No.3

根据实施例4通过SEC-RALS确定的经修饰的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶的分子量分布

图：来自曲霉菌属的FAD-GDH (SEQ ID No: 1)，参见图2。

图：FAD-GDH (SEQ ID No: 3)变体1；N2S，参见图3。

根据实施例7的干燥条件下的温度稳定性

参照：                            根据SEQ ID No: 1的FAD-GDH：67 +/- 5%

N2S修饰（变体1）：   根据SEQ ID No: 3的FAD-GDH： 79 +/- 5%

附图说明  

图1:

毕赤酵母表达载体pPICZαA：

PAOX1 = AOX1启动子（起始目标基因的转录）

αFactor-ss = 编码α-因子信号序列的基因（将目标基因在框架内融合到该序列中；经巴斯德毕赤酵母将相应多肽分泌到培养基中）

TAOX1 = AOX1终止子（停止目标基因的转录）

Zeo = 博来霉素抗性基因－选择标记

ColE1 = 复制起点（允许在大肠杆菌中克隆）。

图2:

通过SEC-RALS确定的根据SEQ ID NO:1的分子量分布。

图3:

通过SEC-RALS确定的根据SEQ ID NO:3（变体1；N2S）的分子量分布。

本文描述的方法和组合物代表具体实施方案，仅仅是例证性的而不意在被理解为对本发明范围的限制。本领域技术人员在考虑本说明书时将会想到其它目标、方面和实施方案，它们也包括在如所附权利要求所定义的本发明的范围之内。对本领域技术人员来说显而易见的是，可以对本文披露的本发明进行各种取代和修改，而不脱离本发明的范围和精神。本文阐释性描述的本发明合适地可以在缺少任何元素、或者限制的情况下实施，它们并非是作为必要的而在本文具体公开。

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