一种植物乳杆菌在葡萄酒酿造中降解生物胺的应用

摘要

本发明公开了一种利用植物乳杆菌降解葡萄酒酿造过程中的生物胺的方法，属于生物技术与发酵领域。该菌株是从酿酒葡萄表面筛选得到，该菌种不仅能够有效的降低添加了腐胺、组胺和酪胺的MRS培养基中的生物胺的含量，更能直接应用于葡萄酒的酿造过程中，具有较好的高酸、高酒精度及高SO2的耐受性，苹果酸-乳酸的转化率极高，可以有效的降低葡萄酒酿造过程中的生物胺的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物乳杆菌在葡萄酒酿造过程中降解生物胺的应用，属于生物技术和发酵领域。

背景技术

生物胺（Biogenic amines,BAs）是一类具有生物活性的含氮低分子量有机化合物的总称。普遍存在于多种食品和含酒精的发酵饮料中，如干酪、肉制品、水产品、啤酒、葡萄酒和黄酒中等。生物胺是生物有机体内的正常的活性成分，在机体内起着重要的生理作用。它是真核细胞中合成荷尔蒙、生物碱、核酸、蛋白质等物质的前体，是重要的神经传递子，人们摄入少量的生物胺不会对人体产生影响。但当生物胺的含量达到一定的浓度时，会引起一系列的不良反应，如头痛、呼吸紊乱、心悸等不良症状。各类胺的毒性大小不同，组胺对人体健康的影响最大，其次是酪胺、腐胺和尸胺虽然没有直接的毒性作用，但可以增强组胺的毒性。另外，生物胺是生产卫生条件的指示剂且与酒精类饮品“多饮上头”有关。因此，部分欧盟国家已经设定部分生物胺的最大限量值，我国也对部分食品中生物胺的相关限量做了明确的规定。

葡萄酒作为一种健康饮品，是国民经济发展中增长较快、最具活力的产业之一。近几年葡萄酒的年增长率在20%以上。2013年，葡萄酒产量为117.83万千升,销售收入408.17亿元，利润43.81亿元。虽然近年来发展迅速，但受宏观经济增速放缓和进口葡萄酒冲击等因素的影响，国产葡萄酒出口无论在数量，还是在金额上，与进口葡萄酒相比，所占比重都很低；并且我国葡萄酒产业存在产品同质化、质量安全隐患大的缺陷，已严重影响到行业的健康发展。因此，提高国产葡萄酒的质量、降低生产成本、消除质量安全隐患是提高葡萄酒国际竞争力的主要策略，也是我国葡萄酒行业持续稳定发展的关键所在。

葡萄酒作为一种发酵酒，其质量受原料、发酵剂、发酵条件和贮藏条件等因素的影响。作为发酵副产物中的一类，生物胺是酿造过程中由微生物脱羧酶催化氨基酸脱羧产生的一类碱性有机化合物。其含量多少对葡萄酒的安全卫生质量有很大影响，其中组胺和酪胺的毒性最大。国外科研人员已经检测出葡萄酒中含有有20多种生物胺；部分欧盟国家已经设定葡萄酒中组胺的最大限量值，如德国：2mg/L；比利时：6 mg/L；荷兰：4 mg/L；法国：8 mg/L；瑞士和奥利地：10 mg/L。我国国家卫生部也颁布制定了发酵食品中生物胺检测标准（GB/T 5009.208-2008），重点检测组胺和酪胺等八种生物胺。可见，做好葡萄酒中生物胺的预防控制是至关重要的。

由于生物胺在人体内积累会产生一定的毒性作用，那么降低食品中生物胺的研究是至关重要的。降低食品中生物胺的含量主要包括两个方面：一是控制生物胺的生成，而是降解已经生成的生物胺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用植物乳杆菌在葡萄酒酿造过程中降解生物胺的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所提供的降解生物胺的植物乳杆菌，拉丁名为lactobacillus plantarum，编号L9，是从酿酒葡萄表面分离得到的，目前已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.9263，保藏日期为：2014年06月04日。菌株的生理生化性质如下：革兰氏阳性菌，细胞形态为长杆形、单生或对生、一字排列，菌落形态：菌落1.0-1.2mm、突起、圆形、较小、光滑、边缘整齐、乳白色。

采用细菌通用引物27F/1492R进行16S rDNA序列鉴定，为植物乳杆菌。

本发明主要是通过两种方式进行了植物乳杆菌降解生物胺的应用：一是将植物乳杆菌接种于添加了单体生物胺的MRS培养基中进行培养，与空白对照，观察生物胺含量的变化情况。二是将植物乳杆菌接种于葡萄汁经酒精发酵之后的发酵液中进行发酵试验，与空白对照，观察生物胺含量的变化情况。

本发明所用的添加了三种生物胺（组胺、酪胺、腐胺）的改良MRS培养基，其所含组分为：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖20.0g、（NH4）₂HC₆H₅O₇ 2.0 g、CH₃COONa·3H₂O 5.0g、K₂HPO₄·3H₂O 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.58g、MnSO₄·H₂O 0.25 g、吐温80 1.0 mL、腐胺1mol/L、组胺1mol/L、酪胺1mol/L、蒸馏水 1L，pH=5.5。

本发明所用的葡萄酒发酵液采用昌黎地区赤霞珠葡萄汁为原料，葡萄汁总糖含量为208.45g/L。在28℃条件下培养6天后，分离酵母后使用。

本发明对该菌株的酒精、pH、SO₂的酿酒适应性实验设计：菌株酒精适应性的MRS培养基中酒精度（体积分数）为10%、12%、14%；菌株pH适应性的MRS培养基的pH为3.4、3.2、3.0；菌株SO₂适应性的MRS培养基中SO₂浓度为20mg/L、30mg/L、50mg/L。采用上述培养基进行该植物乳杆菌的发酵实验，测定其OD₆₀₀值变化。

本发明测定该菌株苹果酸-乳酸特性的方法：取活化菌悬液1.0mL接入100mL葡萄汁经酒精发酵后的发酵液中，20℃下静置培养，采用离子色谱法测定初始、5d、10d、15d、20d时的苹果酸、乳酸含量。

具体实施方式：

实施实例一：植物乳杆菌用于降解添加了单体生物胺的MRS培养基中的生物胺

从MRS斜面上挑取植物乳杆菌，于MRS培养基活化2-3次，挑取3-5环经过活化的植物乳杆菌接入已灭菌的10mL MRS培养基中，于30℃条件下培养18h，取此菌悬液1.0mL接入100mL已灭菌的添加了生物胺单体的MRS培养基中，经25℃条件下培养5天后检测培养液中组胺、酪胺和腐胺含量的变化。检测结果如下表：

表1 MRS培养基中生物胺含量变化（mg/L）

菌种腐胺组胺酪胺总和L9-12.64-6.36-14.76-33.76

注：表中数据为培养液中腐胺、组胺和酪胺与空白培养基中三种胺的差值，负值表示生物胺含量降低。

实施实例二：植物乳杆菌用于降解葡萄酒发酵液中的生物胺

从MRS斜面上挑取植物乳杆菌，于MRS培养基活化2-3次，挑取3-5环经过活化的植物乳杆菌接入已灭菌的10mL MRS培养基中，于30℃条件下培养18h，取此菌悬液1.0mL接入100mL葡萄汁经酒精发酵后的发酵液中，经20℃条件下培养20天后检测培养液中组胺、酪胺和腐胺含量的变化。检测结果如下表所示：

表2 植物乳杆菌对苹乳发酵过程中生物胺含量变化的影响（单位：mg/L）

菌种腐胺组胺酪胺总和空白3.1160.9262.8726.914L92.2980.1540.3422.794

实施实例三：植物乳杆菌的酿酒适应性和苹果酸-乳酸转化评价

从斜面上挑取植物乳杆菌，于MRS培养基活化2-3次，挑取3-5环经过活化的植物乳杆菌接入MRS培养基中，于30℃条件下静置培养18h；取此菌悬液按照接入100mL已灭菌的特定MRS培养基（酒精度、SO₂和pH培养基如上所述）中，于25℃条件下静置培养，测定初始和培养10d的OD₆₀₀值，OD₆₀₀值增加5倍及以上则菌株生长状况良好。结果表明该植物乳杆菌具有良好的酿酒适应性，可耐受酒精度为12°(V/V)，pH为3.2，SO₂浓度为30mg/L，即该菌株能在高酸、高SO₂和高酒精度的葡萄酒环境中生长。

为进一步分析该菌株苹果酸-乳酸转化的能力，模拟苹乳发酵过程：葡萄汁在28℃条件下培养6天，完成酒精发酵后，分离底层酵母，将已经活化的植物乳杆菌L9按照10⁷cfu /ml的量接种到发酵液中，25℃发酵20天，测定该过程中苹果酸、乳酸含量，结果如表3，使乳酸的增长量4.5～5.0g/L之间，苹果酸降低量在2.0～2.5g/L之间。

表3 植物乳杆菌的苹果酸-乳酸转化能力测定（单位：g/L）

菌种苹果酸乳酸0d5.8107.1195d4.9878.52310d4.0039.01315d3.89410.98420d3.69511.748

本发明所用的L9植物乳杆菌的酿酒适应性良好，苹果酸-乳酸转化率极高，苹果酸降低2.115g/L,乳酸增加4.629 g/L，酒体更加柔和，香气协调，且能够降解葡萄酒发酵液中组胺、腐胺和酪胺，降解率高达59.59%，因此可以做苹果酸乳酸发酵的启动子。

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