一种生物转化富马酸生产L-苹果酸的方法

摘要

本发明涉及一种生物转化富马酸生产L-苹果酸的方法。利用自主选育的葡萄牙棒孢酵母CICC33054（Clavispora lusitaniae CICC 33054），经发酵培养，离心得酵母细胞。酵母细胞加入富马酸钠溶液进行生物转化，经富马酸钙置换沉淀、过滤、硫酸酸解、过滤、浓缩、结晶干燥得L-苹果酸成品。葡萄牙棒孢酵母CICC33054易于培养，转化效率高，用于L-苹果酸生产可提高生产效率，降低生产成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用富马酸生产L-苹果酸的方法，尤其是涉及葡萄牙棒孢酵母CICC 33054生物转化富马酸生产L-苹果酸的方法。 

背景技术

L-苹果酸又名羟基琥珀酸或羟基丁二酸，分子式为C₄H₆O₅，分子量为134.09。在常温下，L-苹果酸为白色结晶或结晶性粉末，无臭，有爽快的酸味，比重1.601，熔点98~99℃。在20℃下，34%的L-苹果酸水溶液无旋光性，加水稀释后可出现左旋，当其浓度超过34%时，又出现右旋。 

由于L-苹果酸分子中含有-OH基及-COOH基，因此对极性溶媒的溶解度大，化学性质较为活泼。在常温下它极易溶于乙醇中，在水中其溶解度随水温的升高而增大，呈强酸性。它还能与醇类、浓硫酸、苯酚、过氧化氢、三氯乙醛及醋酸铅等发生反应，并能与β-萘酚、间苯酚及2，7-萘二酚作用，使溶液呈不同的颜色。 

L-苹果酸是生物体代谢过程中所产生的重要有机酸。在微生物中，它的产生与多条重要的代谢途径有关，出现于三羧酸循环（TCA）及其支路乙醛酸循环中，也是CO₂固定反应的产物。 

几十年来，人们对L-苹果酸在微生物中的代谢途径进行了研究，尤其对裂褶菌（Schizphylhls commne）代谢途径的研究比较深入。目前从事这方面工作的研究者大都认为CO₂固定反应是L-苹果酸生成及积累的重要过程。 

L-苹果酸在水中溶解度大、酸味柔和、风味别致、质地稳定，其用途相当广泛： 

1.在食品工业上，L-苹果酸是国际上公认的一种安全性食品添加剂，也是一种优良的调酸剂和保鲜剂。与柠檬酸相比，L-苹果酸的刺激较为缓慢，酸味可保留较长时间，与柠檬酸配合使用，可以模拟天然果实的酸味特征，使甜酸口感显得自然、丰满、调谐。现在欧美及日本各国的食品生产中，它已成为不可缺少的基本原料之一。另外，由于食品中添加L-苹果酸可使pH值得到调整，加上其本身固有的抗菌作用， L-苹果酸亦被广泛地用于其它食品工业，如作水产品的保鲜剂等。

2.在医药上，L-苹果酸具有重要的生理功能。L-苹果酸直接参与人体代谢，对人体的健康有帮助。可用于治疗贫血、肝功能不全、肝衰竭，并可作混合氨基酸注射液的组分和乳酸钙注射液的安定剂。把L-苹果酸加入药物中还可增进药物的稳定性、改善人体对药物的吸收能力。L-苹果酸钾可作为钾的重要来源，亦具防止水肿、血压过高及脂肪积聚之功效。L-苹果酸及其盐类还能作动物的生长促进剂。 

3.工业上的其它用途。由于L-苹果酸具抗氧化作用和较强的鳌合作用，因此广泛地应用于印染工业作为保色剂和增效剂。在化学工业方面，由于L-苹果酸可调节pH值，因此可作牙膏及烟草的调味剂、皮肤清洁剂、焊锡助焊剂、空气清新剂、洗涤剂助剂和废气脱硫剂，还可代替柠檬酸作为各种金属容器及表面的除锈剂。在建材上，添加适量的L-苹果酸于水泥中，可缩短凝固时间，防止碱性凝聚反应的发生，提高混凝土的强度。L-苹果酸还可代替草酸作为各种石块的表面清洗剂，使其表面变得光滑、平整和美观。 

随着L-苹果酸应用研究的不断深入，其市场需求量逐年增加。经过不断努力，L-苹果酸的生产方法已从早期单一的直接提取法，发展到今天的多种生产方法。根据生产原料的不同，可将L-苹果酸的生产分为5种: 

1.直接提取法：把石灰乳直接加人富含L-苹果酸的果汁及蔬菜汁中，形成的L-苹果酸钙沉淀用硫酸处理，然后再回收游离的L-苹果酸。

2.拆分法：在一定条件下，糖醛、β-内醋、环戊二烯及丁烯二酸等均可合成DL-苹果酸。将化学合成的DL-苹果酸拆分就可获得L-苹果酸。 

3.利用微生物转化富马酸生产L-苹果酸。以能够产生富马酸酶的微生物转化富马酸生产L-苹果酸。到目前为止，筛选出来具有较高富马酸酶活性的菌种有短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、产氨短杆菌（Brevibacterium ammoniagenes）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）、副肠道菌(Porocolobactoriuo sp.)、解脂假丝酵母（Candida lipolytica）及温特曲霉（Aspergillus wentii）等。生物转化法采用的方法有固定化酶或固定化细胞以及游离细胞法。固定化酶或固定化细胞法的酶和细胞能重复利用，但是固定化操作繁琐，设备要求高。游离细胞法操作简单工艺易控。 

4.利用微生物发酵糖质原料生产L-苹果酸。采用此法的生产途径有两条:第一条是用单一菌种一步发酵生产L-苹果酸，所用的菌种有黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）及出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）等；第二条是混种发酵两步生产L-苹果酸，首先采用少根根霉（Rhizopus arrizus）或华根霉（Rhizopus chinensis）把糖质原料转化成富马酸，然后利用膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）及宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）中的一种，把富马酸转化成L-苹果酸。由于发酵周期较长，产酸率相对较低、副产物较多，因此直到目前为止还尚未见有应用于大规模工业生产的报道。 

5．利用微生物发酵非糖质原料生产L-苹果酸。目前人们已成功地采用布伦假丝酵母（Candida brumptii）发酵正构石蜡，宛氏拟青霉发酵乙醇、甘油、醋酸及丙酸等，产碱菌（Alcaligenes sp. T501）发酵马来酸，其转化率分别达80%、48%及98.4%。但这些非糖质原料发酵生产L-苹果酸的试验目前仍处于实验室阶段，尚未投人工业生产。 

发明内容

本发明所解决的技术问题为提供一种以产富马酸酶的微生物菌种葡萄牙棒孢酵母CICC 33054（Clavispora lusitaniae CICC 33054））生物转化富马酸生产L-苹果酸。 

本发明自主选育的葡萄牙棒孢酵母CICC 33054保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9848。 

葡萄牙棒孢酵母CICC 33054的26S rDNA序列见序列表。 

本发明的葡萄牙棒孢酵母CICC 33054富马酸酶活力高，经过发酵培养酶活力可达2000U/g湿细胞。用于生物转化富马酸生产L-苹果酸，转化效率高，便于后续提取，可提高生产效率，降低生产成本。 

本发明进一步提供一种微生物转化富马酸生产L-苹果酸的方法。将葡萄牙棒孢酵母CICC 33054发酵培养后发酵液离心获得酵母细胞，加入富马酸钠溶液，通过菌体细胞内的富马酸酶，光学专一性合成L-苹果酸，然后经过富马酸钙置换沉淀、过滤水洗得L-苹果酸钙沉淀，再经硫酸溶液酸解，过滤水洗得L-苹果酸溶液，经浓缩、结晶、干燥得L-苹果酸成品。 

具体步骤为： 

（1）葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌种接种种子培养基发酵培养18~24h，得接种液；

（2）接种液接入发酵培养基，发酵20~30h得发酵液，发酵液离心获得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054细胞；

（3）葡萄牙棒孢酵母CICC 33054细胞加入富马酸钠溶液，生物转化生成苹果酸，经沉淀、过滤、酸解、过滤、浓缩、结晶、干燥得成品L-苹果酸酸。

葡萄牙棒孢酵母CICC 33054的斜面种子培养可采用本领域常用技术手段。斜面培养基可以采用试管或者茄子瓶制备。通常情况下可采用摇瓶发酵培养获得适量种子培养液，若需大规模培养，可再进行发酵罐扩大培养，获得量大的种子培养液。工业生产中，葡萄牙棒孢酵母CICC 33054细胞发酵液可通过发酵罐进行发酵培养。 

一些典型的培养基组成如下： 

斜面培养基（g/L）：麦芽浸粉80~150.0，琼脂15.0，pH值6.0 ~7.0。

种子培养基（g/L）：葡萄糖30.0~70.0，酵母粉2.0~8.0，硫酸铵3.0~8.0，磷酸二氢钾 1.0~5.0，七水硫酸镁 0.1~0.6，调节pH6.0~7.0。 

发酵培养基（g/L）：葡萄糖50.0~120.0，酵母粉2.0~8.0，硫酸铵3.0~8.0，磷酸二氢钾 1.0~5.0，七水硫酸镁 0.1~0.6，调节pH值6.0~7.0。 

微生物保藏信息 

微生物分类命名：葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）

保藏编号：CGMCC No.9848

保藏日期：2014年10月27日；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明。

实施例1 

微生物菌种鉴定

1、基因组DNA提取

（1） 用接种环挑取一环斜面菌种，悬浮于1ml 0.85% NaCl溶液中，10000r/min离心2min，弃上清；

（2）沉淀重悬于550ul 1×TE中，沸水浴10min；

（3）加3ul蛋白酶K（20ug/ml），37℃温育30min；

（4）加30ul 10% SDS，37℃温育30min；

（5）加100ul 5M NaCl溶液充分混匀，再加80ul CTAB/NaCl混匀，65℃水浴10min；

（6）加等体积氯仿/异戊醇（24:1），轻轻震荡混匀，10000r/min离心8min；

（7）取上清液，加等体积酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），轻轻震荡摇匀；13000r/min离心8min；

（8）重复步骤6；

（9）取上清，加0.6-0.8倍体积异丙醇，轻轻混匀后室温静置30min；

（10）10000r/min离心8min，弃上清，加500ul 70%乙醇，颠倒数次洗盐，弃上清；重复洗盐两次；

（11）倒置离心管，至DNA沉淀干燥；沉淀溶于50-100ul dd H₂O，-20℃保存备用。

2、26S rDNA扩增 

PCR反应体系50ul：DNA模版0.5ul（约10ng），10×Taq DNA聚合酶Buffer 5ul，10pmol /ul dNTP 1ul，10pmol/ul正反向引物各1ul（正向引物NL1 5‘—GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG—3’和反向引物NL4 5‘—GGT CCG TGT TTC AAG ACG G—3’），2.5u/ul Taq DNA聚合酶0.5ul，添加ddH₂O至50ul。PCR扩增反应程序：94℃ 5min；94℃ 30s；50℃ 30s；72℃ 1min 30s；35 cycles；72℃ 10min；4℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用ABI3700基因测序仪测序。

3、序列比对鉴定 

微生物菌种26S rDNA序列于NCBI数据库比对与模式株  Clavispora lusitaniae CBS 4413^T (AY190538)， Clavispora lusitaniae CBS 6936^T (U44817)，相似性最高，分别为100.0%、93.4%。菌株鉴定命名为葡萄牙棒孢酵母CICC 33054（Clavispora lusitaniae CICC 33054）。

实施例2 

斜面培养基（g/L）：麦芽浸粉90.0、琼脂15.0、pH值6.0。

种子培养基（g/L）：葡萄糖40.0，酵母粉3.0，硫酸铵4.0，磷酸二氢钾 2.0，七水硫酸镁 0.2，调节pH6.0。 

发酵培养基（g/L）：葡萄糖70.0，酵母粉6.0，硫酸铵6.0，磷酸二氢钾2.0，七水硫酸镁0.2，调节pH6.0。 

取葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌种一环接种到装有30mL种子培养基的三角瓶中，摇床200rpm，29℃培养18h得接种液。取3mL接种液，接种到装有300mL发酵培养基的三角瓶中，200rpm培养28h，获得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054发酵液，发酵液5000rpm离心10min得酵母细胞，加入300mL的139g/L的富马酸溶液（氢氧化钠调节pH值为6.0），再加入0.2mL甲苯，30℃生物转化31h生成L-苹果酸。加入富马酸钙置换，过滤得L-苹果酸钙沉淀，再经硫酸酸解后过滤得L-苹果酸溶液，80℃浓缩，冷却结晶、干燥后得L-苹果酸成品，纯度达到99.8%。浓缩母液可合并到下一批L-苹果酸溶液中。 

实施案例3 

斜面培养基（g/L）：麦芽浸粉150.0、琼脂15.0、pH值7.0 。

种子培养基（g/L）：葡萄糖70.0，酵母粉8.0，硫酸铵8.0，磷酸二氢钾 5.0，七水硫酸镁0.6，调节pH值7.0。 

发酵培养基（g/L）：葡萄糖120.0，酵母粉15.0，硫酸铵12.0，磷酸二氢钾5.0，七水硫酸镁0.6，调节pH值为7.0。 

取葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌种一环接种到装有300mL种子培养基的1L三角瓶中，摇床200rpm，33℃培养24h得接种液，合并得发酵液600mL。取600mL接种液，接种到装有30L发酵培养基的50L发酵罐，33℃，通气量1v/v.min，500rpm培养24h，获得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054发酵液，发酵液5000rpm离心10min得酵母细胞，加入60L的139g/L的富马酸溶液（氢氧化钠调节pH值为6.0），再加入300ml甲苯，40℃生物转化28h生成L-苹果酸。加入富马酸钙置换，过滤得L-苹果酸钙沉淀，再经硫酸酸解后过滤得L-苹果酸溶液，80℃浓缩，冷却结晶干燥后得L-苹果酸成品，纯度达到99.8%。浓缩母液可合并到下一批L-苹果酸溶液中。加入富马酸钙置换过滤得L-苹果酸钙沉淀后的过滤液可再用于转化生产L-苹果酸。 

实施案例4 

斜面培养基（g/L）：麦芽浸粉150.0、琼脂15.0、pH值7.0 。

种子培养基（g/L）：葡萄糖70.0，酵母粉8.0，硫酸铵8.0，磷酸二氢钾 5.0，七水硫酸镁0.6，调节pH值7.0。 

发酵培养基（g/L）：葡萄糖120.0，酵母粉15.0，硫酸铵12.0，磷酸二氢钾5.0，七水硫酸镁0.6，调节pH值为7.0。 

取葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌种一环接种到装有300mL种子培养基的1L三角瓶中，摇床200rpm，33℃培养24h得接种液，合并得发酵液600mL。取600mL接种液，接种到装有30L种子培养基的50L发酵罐，33℃，通气量1v/v.min，500rpm培养20h，获得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054二级种子液。取300L二级种子液接入装有15m³发酵培养基的20 m³发酵罐，33℃，通气量0.5v/v.min，200rpm培养20h。发酵液离心10min得酵母细胞，加入30 m³的139g/L的富马酸溶液（氢氧化钠调节pH值为6.0），再加入400L甲苯，40℃生物转化30h生成L-苹果酸。加入富马酸钙置换，过滤得L-苹果酸钙沉淀，再经硫酸酸解后过滤得L-苹果酸溶液，80℃浓缩，冷却结晶干燥后得L-苹果酸成品，纯度达到99.8%。浓缩母液可合并到下一批L-苹果酸溶液中。加入富马酸钙置换过滤得L-苹果酸钙沉淀后的过滤液可再用于转化生产L-苹果酸。 

以上所述的实施案例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明的设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。 

序列表 

<110> 中国食品发酵工业研究院

<120>一种生物转化富马酸生产L-苹果酸的方法

<160> 1                                                                    

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211>482

<211>DNA

<213>葡萄牙棒孢酵母CICC 33054（Clavispora lusitaniae CICC 33054）

<400>1

gctcaaattt gaaatcctgc gggaattgta atttgaaggt ttcgtggtct gagtcggccg          60

cgcccaagtc cattggaaca tggcgcctgg gagggtgaga gccccgtatg gcgcacgccg   120

actctttgca ccgcggctcc gacgagtcga gttgtttggg aatgcagctc taagtgggtg        180

gtaaattcca tctaaagcta aatattggcg agagaccgat agcgaacaag tacagtgatg        240

gaaagatgaa aagcactttg aaaagagagt gaaacagcac gtgaaattgt tgaaagggaa     300

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