一种快速检测花生过敏原Ara h 2的胶体金试纸条及其制备方法

摘要

一种快速检测花生过敏原Ara h 2的胶体金试纸条及其制备方法，属于免疫检测技术领域。本发明应用的抗体是利用从花生粗蛋白中提取纯化的Ara h 2免疫雌性BALB/c小鼠得到的高特异性的单克隆抗体。由于采用的是单克隆抗体，稳定性和特异性较好，适用于花生过敏原Arah2的快速检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种花生过敏原成分Ara h 2的免疫胶体金快速检测试纸条及其制备方法，且可以通过对Ara h 2的监测实现对花生过敏原的快速诊断，属于免疫检测技术领域。

背景技术

花生过敏是食物过敏中导致死亡人数最高的一种。因食物过敏引发的死亡90%都是由花生导致的。花生过敏反应因其潜在的危险性、长期性以及不断增加的发病率而日益受到重视。

花生过敏原包括多种蛋白质成分，其中Ara h 2是一种分子质量为17kDa~20kDa的同种异型蛋白，约占花生蛋白总量的10%。Ara h 2被认为是主要的过敏原成分，90%以上的花生过敏患者对其过敏。因此，可通过对Ara h 2的监测实现对花生过敏原的快速诊断。

目前，对过敏原的定量检测方法很多，如双免疫扩散试验、放射免疫法和高效液相法、聚合酶链式反应（PCR）分析法、组胺释放实验（HRT）、过敏原指纹图谱快速检测方法等。但都存在各自不同的问题，如检测速度慢、成本高、需要特定的分析仪器等。而免疫层析胶体金试纸条具有操作简单快速、处理样品量大、灵敏度高且廉价等优点，而且不需要借助专门仪器，适合现场快速检测，因此对于大量样品的现场检测具有重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速检测花生过敏原Ara h 2的胶体金试纸条，操作简单，快速方便，灵敏度高，稳定性好，成本低廉，用于食品中花生过敏原的快速大量检测。

本发明另一个目的在于提供一种免疫胶体金试纸条的制备方法，包括抗Ara h 2特异性抗体的制备，Ara h 2双抗体检测的配对筛选，Ara h 2免疫胶体金检测试纸条的制备。该试纸条操作简便、快速、准确，检测全过程只需5min，不受环境条件的干扰，特异性好，检测灵敏度高，最低检测限为1ng/mL。

本发明适用于医院，企业及普通家庭等，可实现食品或临床样本中花生过敏原Ara h 2的快速检测。

本发明的技术方案：一种快速检测花生过敏原Ara h 2的胶体金试纸条，包括PVC底板，在PVC底板两端分别设有样品垫和吸水垫；PVC底板中部设置有硝酸纤维素膜检测层，在硝酸纤维素膜检测层与样品垫之间设置有胶体金结合垫；所述胶体金结合垫一端与样品垫相连接叠放，另一端叠放于硝酸纤维素膜检测层上。

所述硝酸纤维素膜检测层上依次设置有检测线和质控线。所述胶体金结合垫包被有金标标记抗Ara h 2抗体Ara h 2-mAb-5（CGMCC No.9314），所述检测线上包被有抗Ara h 2抗体Ara h 2-mAb-1（CGMCC No.9315）。所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。

所述花生过敏原Ara h 2的胶体金快速检测试纸条的制备方法，步骤为：

（1）提取花生过敏原粗蛋白：

将新鲜花生仁去皮，经高速粉碎机处理得到粉末状，称取10g，按1:10（W/V）浸入石油醚（60~90℃）中脱脂，4 ℃磁力搅拌下浸提4h，8000 r/mim离心10 min，弃上清，沉淀反复浸提三次后置于通风橱使石油醚挥发得脱脂花生。随即按1:10（W/V）浸入0.01 M pH7.4 PBS中在4 ℃下浸提过夜， 8000 r/min离心10 min，弃去沉淀，上清即为花生粗蛋白浸提液。

（2）提取纯化Ara h 2：

在花生粗蛋白浸提液中缓慢加入饱和硫酸铵固体，边加边搅拌，加入的完全溶解后才继续往后加，直至饱和度为40%，4 ℃静置1 h，8000 r/min 离心20 min，收集沉淀复溶于0.01 M pH7.4 PBS中，得40%饱和度组分。上清中继续加入饱和硫酸铵固体直至饱和度为60%，按上述40%饱和度组分获得方法得到60%饱和度组分。同样继续往上清中加入硫酸铵得到80%饱和度组分。上述三个分级组分别在0.01 M pH7.4 PBS中透析24 h后用SDS-PAGE鉴定，Ara h 2含量最高的组分再进行凝胶过滤层析分离。对洗脱峰进行SDS-PAGE鉴定，Ara h 2含量最高的洗脱峰将用于下一步实验。

（3）抗Ara h 2特异性单克隆抗体的制备：

将步骤(2)中提取纯化的Ara h 2作为免疫原免疫BALB/c小鼠，多次免疫后用直接ELISA法挑选亲和性最高的小鼠进行融合，通过筛选得到6个对Ara h 2具有强亲和性的细胞株。

（4）抗Ara h2特异性单克隆抗体的配对筛选：

将步骤(3)得到的细胞株制备抗体纯化后分别用辣根过氧化物酶HRP进行标记。标记成功后进行双抗体夹心ELISA法配对筛选。确定特异性免疫胶体金快速检测试纸条所需要抗体；Ara h 2-mAb-5为金标抗体, Ara h 2-mAb-1为检测抗体。

（5）花生过敏原Ara h 2免疫胶体金快速检测试纸条的制备：

A：胶体金的制备：

采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金溶液：在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL 1%的氯金酸,搅拌加热至沸腾,快速加入4mL 1%的柠檬酸钠,继续加热15-20min至呈亮红色，然后室温中冷却，4℃冷藏保存。

B：抗Ara h2抗体-胶体金标记物的制备：

取步骤A中制备的胶体金溶液,每1mL中加入4μL 0.1M K₂CO₃调节pH至6，搅拌中滴加150μL 0.2mg/mL抗体Ara h 2-mAb-5（CGMCC No.9314）, 继续搅拌30min，离心，吸取上清,用金标抗体保存液重悬。

金标抗体重悬液为pH 8.2的含10%蔗糖，0.05% Tween-20，1% BSA，0.2% PEG20000, 1% PVP-K30的0.05M Tris-HCl 溶液。

C：胶体金结合垫的制备：

调试三维平面点膜喷金仪仪器HM3055，将标记好胶体金的抗Ara h 2抗体Ara h 2-mAb-5 (CGMCC No.9314)均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.6pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

D：检测层的制备：

调试三维平面点膜喷金仪仪器HM3055，将稀释好的抗Ara h 2抗体Ara h 2-mAb-1(CGMCC No.9315)均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠IgG均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.6pL/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

E：试纸条的组装：

将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上,即得到用于检测花生过敏原Ara h 2的免疫胶体金层析试纸条。

生物材料样品保藏： 

一株单克隆细胞株，细胞株S号，株号为Ara h 2-mAb-5,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC No.9314，保藏日期为2014年5月28日；

一株单克隆细胞株，细胞株T号,株号为Ara h 2-mAb-1,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC No.9315，保藏曰期为2014年5月28日。

本发明试纸条的工作原理：采用胶体金免疫层析技术,选用Ara h 2特异性抗体作为固相物,利用双抗体夹心法原理检测样品中是否含有Ara h 2。当待检样品中含有Ara h 2时，抗原先和胶体金标记的抗Ara h 2抗体Ara h 2-mAb-5结合,由于层析作用复合物沿检测层向前移动,当遇到检测线上的抗Ara h 2抗体Ara h 2-mAb-1时，形成抗体-抗原-金标抗体复合物,在检测线上富集，形成红色沉淀线。

本发明的有益效果：本发明与现有技术相比，费用较低且操作简单，不需要仪器设备及专业人员容易普及到食品企业，医院和家庭。检测速度快，全程仅5min适用于大批量样品的的现场快速检测。并且灵敏度高，最低检测线为1ng/mL。

附图说明

图1一种快速检测花生过敏原Ara h 2的胶体金试纸条，1、PVC底板，2、样品垫，3、胶体金结合垫，4、硝酸纤维素膜检测层， 5、吸水垫，6、检测线， 7、质控线； 

图2、一种快速检测花生过敏原Ara h 2的胶体金试纸条的硝酸纤维素膜检测层示意图。

图3是本发明花生粗蛋白提取液三个不同饱和度组分的SDS-PAGE电泳图；

1，2：低分子量标准蛋白；3，6：40%饱和硫酸铵沉淀组分；4，7：60%饱和硫酸铵沉淀组分；5，8：80%饱和硫酸铵沉淀组分；

图4 是本发明花生粗蛋白提取液的80%饱和硫酸铵沉淀组分的凝胶过滤层析图；

图5是本发明花生粗蛋白提取液的80%饱和硫酸铵沉淀组分经凝胶过滤层析后洗脱峰的SDS-PAGE电泳图；1,2：80%硫酸铵组分；3,4：80%硫酸铵组分第一个洗脱峰（峰1）；5,6：80%硫酸铵组分第二个洗脱峰（峰2）；M：低分子标准蛋白；

图6 是本发明制备的Ara h 2胶体金试纸条实际检测样品图；1、5 ppb，2、2.5 ppb，3、2 ppb，4、1 ppb，5、0.5 ppb，6、0 ppb。

具体实施方式

本发明通过提取过敏原粗蛋白后作为免疫原，免疫小鼠得到抗体，经过细胞融合技术，得到特异性识别Ara h 2 的单克隆抗体。利用该单抗，采用胶体金免疫层析技术，制备一种快速检测花生过敏原Ara h 2的胶体金试纸条。

实施例1

（1）提取花生过敏原粗蛋白：

将新鲜花生仁去皮，经高速粉碎机处理得到粉末状，称取10g，按1:10（W/V）浸入石油醚（60~90℃）中脱脂，4 ℃磁力搅拌下浸提4h，8000 r/mim离心10 min，弃上清，沉淀反复浸提三次后置于通风橱使石油醚挥发得脱脂花生。随即按1:10（W/V）浸入0.01 M pH7.4 PBS中在4 ℃下浸提过夜， 8000 r/min离心10 min，弃去沉淀，上清即为花生粗蛋白浸提液

（2）提取纯化Ara h 2：

在花生粗蛋白浸提液中缓慢加入饱和硫酸铵固体，边加边搅拌，加入的完全溶解后才继续往后加，直至饱和度为40%，4 ℃静置1 h，8000 r/min 离心20 min，收集沉淀复溶于0.01 M pH7.4 PBS中，得40%饱和度组分。上清中继续加入饱和硫酸铵固体直至饱和度为60%，按上述40%饱和度组分获得方法得到60%饱和度组分。同样继续往上清中加入硫酸铵得到80%饱和度组分。上述三个分级组分别在0.01 M pH7.4 PBS中透析24 h后经SDS-PAGE鉴定，80%饱和度组分中Ara h 2含量最高,对进行凝胶过滤层析分离。对洗脱峰进行SDS-PAGE鉴定，第二个洗脱峰中Ara h 2含量最高。

（3）抗Ara h2特异性单克隆抗体的配对筛选：

将步骤（2）得到的细胞株制备抗体纯化后分别用辣根过氧化物酶HRP进行标记。标记成功后进行双抗体夹心ELISA法配对筛选。确定特异性免疫胶体金快速检测试纸条所需要抗体；Ara h 2-mAb-5为金标抗体, Ara h 2-mAb-1为检测抗体。

（4）花生过敏原Ara h 2免疫胶体金快速检测试纸条的制备：

A：胶体金的制备：

采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm胶体金溶液；

B：抗Ara h 2抗体-胶体金标记物的制备：

取步骤A中制备的胶体金溶液,每1ml中加入4μL 0.1M K₂CO₃调节pH至6，搅拌中滴加150μL 0.2mg/mL抗体Ara h 2-mAb-5（CGMCC No.9314），继续搅拌30min，离心，吸取上清，用金标抗体重悬液重悬；

C：胶体金结合垫的制备：

调试三维平面点膜喷金仪仪器HM3055，将标记好胶体金的抗Ara h 2抗体Ara h 2-mAb-5 (CGMCC No.9314)均匀的喷在玻璃纤维膜上,喷液量0.6pL/cm，37℃烘干过夜,封袋备用；

D：检测层的制备：

调试三维平面点膜喷金仪仪器HM3055，将稀释好的抗Ara h 2抗体Ara h 2-mAb-1 (CGMCC No.9315)均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将稀释好的羊抗鼠IgG均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线,喷液量为0.6pL/cm，37℃烘干过夜,封袋备用；

E：试纸条的组装：

将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在PVC底板上，即得到用于检测花生过敏原Ara h 2的免疫胶体金层析试纸条。