一种金介导的近红外光热效应与自噬抑制剂联合杀伤肿瘤细胞的方法

摘要

本发明提供一种金介导的近红外光热效应与自噬抑制剂联合杀伤肿瘤细胞的方法，与现有技术相比，本发明中自噬抑制剂的引入，可以降低金纳米颗粒的用量，使用较低剂量的激光即可获得良好的肿瘤细胞杀伤效果，从而降低激光和金纳米颗粒对正常细胞组织造成危害的风险。

说明书

技术领域

本发明涉及金介导的近红外光热效应与自噬抑制剂的联合，用于杀伤 肿瘤。

背景技术

癌症是由于控制细胞周期的相关基因发生突变，并且遗传不稳定性累 积形成的发生在各种人群，年龄阶段和不同人体器官上的一种难以治愈的 顽疾，严重威胁人类的健康及生命。目前还没有较为行之有效的诊疗手段， 能够彻底治愈癌症。

目前治疗癌症的手段主要是：外科手术直接切除病灶处肿瘤，放疗， 化疗或者以上几种治疗手段的组合治疗。然而，采用手术治疗，很难将所 有的肿瘤组织切除，对于难以行使肿瘤切除的部位，或者非实体瘤，手术 治疗将变得束手无措。放化疗受限于无法区分肿瘤细胞及正常细胞，会对 正常细胞产生较大的毒副作用，最终有可能引起癌症病人较大的毒副反 应。

纳米技术在癌症的诊疗上具有独特的优势。诊疗用纳米材料具有与核 酸、多肽以及蛋白质等生物大分子类似的尺度，使得纳米材料极易穿过组 织间隙进入组织及细胞内部，通过毛细血管、甚至穿透血脑屏障，躲避机 体的生物防御系统，便于生物降解或吸收；纳米颗粒的较大的比表面积， 提供了功能基团或活性分子锚定修饰的位点，可以被加工修饰成多功能性 的纳米颗粒；纳米结构特性(如多孔、中空、多层等)，使得纳米颗粒具 有较高的药物载负能力，便于药物的输送及药物缓释控制；纳米颗粒表面 可以修饰PEG等分子，可以通过“渗透-滞留增强效应”选择性的在肿瘤部 位选择性的聚集及滞留，增强肿瘤的诊疗效果。

纳米材料介导的肿瘤光热治疗，是通过选择性进入肿瘤细胞内部的纳 米颗粒将光的能量转换为局部热量杀伤癌细胞的一种方法。此种肿瘤治疗 手段，可以借助于高效低毒纳米颗粒在肿瘤部位的选择性聚集，在活体外 通过非介入式激光直接照射肿瘤灶，实现肿瘤的光热杀伤。具有毒副作用 小，靶向治疗效果好等特点，其相关的临床前及临床研究试验方兴未艾。

近红外激光具有较强的深层组织穿透能力，加之，金纳米颗粒在近红 外区的光吸收特性以及其自身的低毒性，使金介导的光热治疗方案成为肿 瘤光热治疗的理想平台之一

自噬是细胞的一种细胞自我降解机制，包括自噬泡的起始，包裹待降 解物质，最后形成的自噬泡与溶酶体融合，降解内含物的完整过程。自噬 与人体的重要生理与病理过程相关

调控自噬，可以抑制肿瘤的生长，增强化疗药物、纳米抗癌试剂对癌 细胞的杀伤效果。自噬相关基因Becline 1在细胞的正常表达，可以导致肿 瘤的发生。在癌症发生的早期，细胞自噬水平的降低，可以导致癌细胞的 持续增殖，这说明自噬是抑制癌症的。诸如银纳米颗粒，本身可以作为抗 癌试剂，抑制银纳米颗粒引起的自噬效应，可以增强其对肿瘤的杀伤效果， 降低纳米制剂的剂量，减少毒副作用。C60，MnO等纳米颗粒也可以通过 调节细胞自噬效应，增强化疗药物对癌细胞的杀伤，降低化疗药物的使用 剂量。

发明内容

本发明的目的在于通过联合金介导的光热效应及自噬抑制剂，提高金 介导的光热效应对癌细胞的杀伤效果，降低金纳米颗粒及激光的使用剂 量。

本发明的第一个方面提供一种纳米颗粒和自噬抑制剂用于制备基于光 热效应杀伤肿瘤的药物或试剂盒的用途。

在一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒选自金纳米颗粒，聚多巴胺 纳米颗粒，单壁碳纳米管，石墨烯或其组合，优选金纳米颗粒，所述金纳 米颗粒包括笼形金纳米颗粒，球形金纳米颗粒，棒状金纳米颗粒，星状金 纳米颗粒。

在一个优选的实施方案中，所述肿瘤为宫颈癌，乳腺癌或胶质瘤。

在一个优选的实施方案中，所述自噬抑制剂选自3-MA,Wortmannin(渥 曼青霉素)，自噬相关基因的siRNA、shRNA或其组合。

在一个优选的实施方案中，所述自噬相关基因包括Atg5[NCBI  Reference Sequence:NM_058484.5],Becline-1[mRNA NCBI Reference  Sequence:NM_003766.3；mRNA NCBI Reference Sequence:NM_019584.3], Atg7[mRNA NCBI Reference Sequence:NM_001253717.1；mRNA NCBI  Reference Sequence:NM_001136031.2]。

本发明的第二个方面提供自噬抑制剂用于制备增强纳米颗粒介导的光 热杀伤肿瘤的药物或试剂盒的用途。

在一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒选自金纳米颗粒，聚多巴胺 纳米颗粒，单壁碳纳米管，石墨烯或其组合，优选金纳米颗粒，所述金纳 米颗粒包括笼形金纳米颗粒，球形金纳米颗粒，棒状金纳米颗粒，星状金 纳米颗粒。

在一个优选的实施方案中，所述肿瘤为宫颈癌，乳腺癌或胶质瘤。

在一个优选的实施方案中，所述自噬抑制剂选自3-MA,Wortmannin， 自噬相关基因的siRNA、shRNA或其组合。

在一个优选的实施方案中，所述自噬相关基因包括Atg5,Becline-1, Atg7。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、自噬抑制剂的引入，可以降低金纳米颗粒的用量

2、使用较低剂量的激光即可获得良好的肿瘤细胞杀伤效果，从而降低 激光对正常细胞组织的造成危害的风险。

附图说明

图1合成的金纳米颗粒的透射电镜(TEM)结果；

图2合成的金纳米笼子的光热转换曲线，Au：金纳米颗粒；PVP:聚乙烯 基吡咯烷酮；

图3笼形金纳米颗粒对细胞活力的影响，Con：空白对照，Au：金纳米颗 粒；PVP:聚乙烯基吡咯烷酮；

图4显示金介导的光热效应随金纳米颗粒用量的增加，增强对癌细胞的杀 伤效果，Au：金纳米颗粒；NIR:近红外激光；

图5显示增加激光的照射时间可以增加金纳米颗粒杀伤肿瘤细胞的效果 Con：空白对照Au：金纳米颗粒；NIR:近红外激光；

图6金纳米颗粒，单独近红外激光，以及近红外激光联合金纳米颗粒处理 GFP-LC3/HeLa细胞对自噬相关蛋白LC3的影响，其中A为荧光显微照片， B为蛋白质印记结果及相应Image J软件分析结果，Con：空白对照Au： 金纳米颗粒；NIR:近红外激光；Wort：渥曼青霉素；3-MA:3-甲基腺嘌呤； 图7在HeLa细胞中，自噬抑制剂Wortmannin可以显著抑制金吸收近红外 激光引起细胞LC3-II过度积累；

图8自噬抑制剂3-MA,Wortmannin增强金介导的光热杀伤人宫颈癌细胞 HeLa及小鼠乳腺癌细胞4T1的效果，Con：空白对照Au：金纳米颗粒； NIR:近红外激光，Wort：渥曼青霉素，3-MA:3-甲基腺嘌呤；

图9Atg 5siRNA沉默ATG5的表达后，可以显著增强金介导的光热杀伤 人宫颈癌细胞HeLa的效果。NIR:近红外激光

具体实施方式

制备金纳米笼子，聚多巴胺纳米颗粒所用的化学试剂均购自于sigma； 基化单壁碳纳米管Short-SWCNT(-COOH,1-2nm,>90％)及石墨烯购自于 南京先丰纳米；微管相关轻链3(LC3)质粒获赠于N.Mizushima(东京， 日本)[Man,N.；Chen,Y.；Zheng,F.；Zhou,W.；Wen,L.P.,Induction of  genuine autophagy by cationic lipids in mammalian cells.Autophagy 2010,6 (4),449-54.]；3-methyladenine(3-MA,08592),海藻糖(Tre,T9531),Hoechst  33342(B2261),碘化丙啶(PI,P4864)和氯喹(Chloroquine，CQ,C6628)从 sigma公司购买；噻唑蓝(MTT,TB0799)从上海生工生物购买；渥曼青霉 素(Wortmmanin,Wort,s1952)购自于碧云天生物科技；细胞培养相关试剂购 自于Invitrogen；LC3抗体(NB100-2220)购自于Novus(Littleton,CO)，绿 色荧光蛋白抗体GFP(sc-101536)购自于Santa Cruz Biotechnology；磷酸 甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体(MAB374)购自于Millipore；带有HRP抗鼠 的二抗(W4021)及抗兔的二抗(W4011)购自于Promega(Wisconsin,USA)； 增强化学发光试剂盒购自于Biological Industries(Kibbutz Beit Haemek, Israel)；Geneticin/G418(Gibco,11811-031)溶解在灭菌的去离子水中，制备 成100mg/mL的储液，低温冷冻保存。

实施例1：金纳米笼子的制备及表征

银纳米立方体的合成制备：

100mL乙二醇加入到250mL的圆底烧瓶中，随后放入150℃的油浴 中预热1小时，并磁力搅拌。1.2mL，3mM的硫氢化钠(NaHS)乙二醇 溶液加入到反应溶液中；2分钟后，10mL，3mM盐酸(HCl)乙二醇溶 液加入到反应溶液中；随后加入25mL，20mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮 (PVP，分子量～55000)；2分钟后，8mL，282mM的三氟醋酸银 (CF3COOAg)。反应进行20分钟左右，通过紫外可见吸收光谱仪确定反 应溶液吸收光谱在440nm左右(对应40nm左右的银纳米立方体)，将反 应烧瓶迅速置入冰水浴中终止反应。所得银纳米立方体用丙酮洗一次，随 后用去离子水离心洗涤2次，随后悬浮于15mL的水溶液中待用。

金纳米立方笼的制备：

将20mL去离子水加入到100mL反应烧瓶中，随后加入1mL银纳米 立方体悬浮液，然后将1mM的氯金酸溶液以1mL/min的速率滴加到反应 溶液中，待到吸收光谱红移到800nm时，停止滴加氯金酸。将反应溶液 中加入过量氯化钠溶液并过夜，以溶解反应生成的氯化银，随后离心洗涤 3次。

如图1所示，透射电镜(transmition electron microscopy，TEM)的结 果显示合成的金纳米颗粒为笼形，立方体结构，大小为40-60nm。

实施例2：金纳米笼子的光热转换曲线

将400μL的DMEM,PBS,含有100μg/mL聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl  Pyrrolidone，PVP)的400μL PBS以及分别含有0.5,1,2，2.5,3,4,5μg/mL 的金纳米笼子的400μL体系的PBS,置于透明圆底玻璃管内，使用 MDL-III-808nm-2.5w的激光器(长春新产业光电技术有限公司)照射管底 部，输出功率为1w，此时激光器未连接耦合光纤。并使用热电偶实时测 定管内液体的温度。如图2所示，结果表明，金纳米颗粒具有较为优越的 光热转换能力。

实施例3：细胞培养及细胞活力实验

人宫颈癌细胞系HeLa细胞和小鼠乳腺癌细胞4T1由ATCC购买获得。 微管相关轻链3(LC3)质粒获赠于N.Mizushima(东京，日本)。基于此 GFP-LC3质粒构建稳定转染GFP-LC3的HeLa细胞【Zhang,Q.；Yang,W.J.； Man,N.；Zheng,F.；Shen,Y.Y.；Sun,K.J.；Li,Y.；Wen,L.P., Autophagy-mediated chemosensitization in cancer cells by fullerene C60 nanocrystal.Autophagy 2009,5(8),1107-1117.】人宫颈癌细胞系HeLa细胞， 小鼠乳腺癌细胞4T1及稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞(GFP-LC3/HeLa) 培养在温度为37℃、CO₂浓度为5％的培养箱中，DMEM培养基(含 10％的胎牛血清)中含有100units/mL的青霉素/链霉素和2.5μg/mL的 两性霉素B。GFP-LC3/HeLa细胞，在使用之前使用G418进行维持生长 一段时间。遵循无菌操作原则，在超净工作台中完成细胞培养，传代，处 理等操作。无菌实验操作过程中所用到的枪头、EP管、玻璃瓶等实验耗 材均于121℃，60分钟高温高压灭菌。

细胞培养所用磷酸盐缓冲液(PBS)的配制：准确称取氯化钠 (NaCl)8g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.27g、磷酸氢二钠(Na₂HPO 4)1.42g、 氯化钾(KCl)0.2g加入约900mL的Millipore超纯水搅拌至溶解，浓盐 酸将pH调至7.4，最后定容总体积1L，121℃高压灭菌后于室温妥 善保存。

HeLa细胞分至96孔中，细胞种植密度为10，000细胞/孔，每孔100μL 的培养基体系。待细胞贴壁20-24小时后，使用3.12,6.25,12.5,25,50,100, 200μg/mL的金纳米颗粒分别处理细胞24小时。每孔加入10μL的MTT 溶液(5mg/mL，用pH＝7.4的PBS配制)，继续孵育4小时。小心吸 去孔内的培养基上清液，每孔加入150μL的DMSO溶液，待甲囋结晶 充分溶解后，选择570nm波长，在酶标仪上测定各个培养孔的光吸收值， 记录结果并除去背景吸光度后，绘制细胞的生长曲线，计算细胞活力。

如图3所示，笼形金纳米颗粒具有较小的细胞毒性，在100μg/mL及 以下浓度，对细胞的活力没有显著影响(细胞活力大于80％)。

实施例4：金纳米颗粒对肿瘤细胞的光热杀伤

HeLa经胰酶消化，DMEM培养基重悬，种植到24孔细胞培养板内， 待细胞贴壁率达到90％左右，进行后续的实验。

近红外激光的剂量及照射时间保持不变，加入不同浓度(0，25，50， 75，100μg/mL)的金纳米颗粒，与细胞共孵育6h后，胰酶消化细胞， 1000rpm，5min离心收集细胞，并将细胞重悬于500μL的DMEM培养基 内，转移至48孔板内，进行激光照射处理5min。而后，将细胞进行适当 稀释，分别种植到96孔细胞培养板。16小时后，使用MTT法检测细胞 活力的变化

图4显示金介导的光热效应能够随着金纳米颗粒的用量的增加，增强 对癌细胞的杀伤效果。细胞活力实验结果显示，当金纳米颗粒的浓度为 50μg/mL时，能够杀伤约30％左右的细胞。

保持金纳米颗粒的剂量不变，增加激光的照射时间。使用50μg/mL 金纳米颗粒预处理细胞6小时后，对细胞分别照射5min，7.5min，10min， 检测对癌细胞的杀伤效果。图5显示，增加激光的照射时间可以增加金纳 米颗粒杀伤肿瘤细胞的效果。

实施例5：金纳米颗粒，单独近红外激光，以及近红外激光联合金纳米颗 粒在HeLa及GFP-LC3/HeLa细胞中诱导细胞自噬的发生

HeLa经胰酶消化，DMEM培养基重悬，种植到24孔细胞培养板内， 待细胞贴壁率达到90％左右，加入不同浓度50μg/mL的金纳米颗粒，与细 胞共孵育6h后，胰酶消化细胞，1000rpm，5min离心收集细胞，并将细 胞重悬于500μL的DMEM培养基内，转移至48孔板内，进行激光照射 处理5min。而后，将细胞进行适当稀释，种植到24孔细胞培养板内，每 孔10万细胞，继续培养16小时。胰酶消化，收集细胞，进行蛋白质印记 实验，检测自噬的发生。

图6中GFP-LC3/HeLa是稳定转染并持续表达GFP标签的LC3蛋白 的HeLa细胞系。当自噬发生时，GFP-LC3-I就会被加工成GFP-LC3-II， 聚集在自噬泡上，在荧光显微镜下，我们很容易观测到带有绿色荧光的膜 泡样结构(膜泡直径约为300-900nm)。经50μg/mL的金纳米颗粒，单独 近红外激光，以及近红外激光联合金纳米颗粒处理GFP-LC3/HeLa细胞， 荧光显微镜(Olympus IX71)观察细胞内部GFP点状聚集的变化，如图6A 的实验结果显示，金纳米颗粒与近红外激光共处理可以显著增强细胞内部 点状聚集的产生。

自噬相关蛋白LC3是自噬的标志物蛋白，当细胞自噬水平较低时，LC3 蛋白弥散的分布在胞质溶胶中。此时的LC3蛋白为LC3蛋白I型。但自 噬被诱导时，分布于胞质溶胶中的LC3蛋白就会被剪切加工成膜结合的 LC3-II,分布在自噬泡的膜上。通过western blotting技术分析LC3蛋白I型 到II型的转换，我们可以在一定程度上断定自噬的发生。如图6B的蛋白 质印记的结果及Image J软件分析的结果显示，金纳米颗粒与近红外激光 共处理可以显著促进自噬相关蛋白LC3从I型到II型的转换。

实施例6：金介导的光热杀伤肿瘤细胞与自噬抑制剂联合使用

HeLa经胰酶消化，DMEM培养基重悬，种植到24孔细胞培养板内， 待细胞贴壁率达到85％左右时，加入或不加自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤 (3-MA)或者渥曼青霉素(Wortmannin)，预处理1h后，加入50μg/mL 金纳米颗粒，继续处理细胞6小时。胰酶消化细胞，1000rpm，5min离心 收集细胞，并将细胞重悬于有或无自噬抑制剂的500μL DMEM培养基内， 转移至48孔板内，进行激光照射处理5min。而后，使用有或无自噬抑制 的DMEM培养基将细胞进行适当稀释，分别种植到96孔细胞培养板或者 24孔细胞培养板内，继续培养16小时。Hochest3342/PI双染，统计细胞 死亡的比例。其中，使用Hochest3342/PI双染检测光热治疗后的细胞死亡 情况的步骤如下：移出细胞培养基，使用10μg/mL的hochest3342着色细 胞核；死亡的细胞，细胞膜通透性改变，可以被10μg/mL的碘化丙啶(PI) 着色，使用荧光显微镜(Olympus IX71)进行拍照，统计视野中，PI阳性 细胞及hoechst33342着色的细胞，前者与后者的比值乘以100％，即为死 亡率。胰酶消化，收集细胞，进行蛋白质印迹实验，检测3-MA及wortmannin 对自噬的抑制作用。

如图7所示，在HeLa细胞中，自噬抑制剂Wortmannin可以显著抑 制金吸收近红外激光引起细胞LC3-II过度积累。在GFP-LC3HeLa细胞中， 自噬抑制剂3-MA可以抑制GFP-LC3II的积累，抑制细胞内部游离GFP 的释放，抑制细胞自噬的水平。

如图8所示，自噬抑制剂3-MA,Wortmannin本身对细胞没有毒性，并 且能够通过抑制细胞自噬，增强金介导的光热杀伤人宫颈癌细胞HeLa及 小鼠乳腺癌细胞4T1的效果。

实施例7：金介导的光热杀伤肿瘤细胞与自噬相关基因(Atg5)siRNA的联 合使用

Atg5 siRNAs

(四种Atg5siRNA的等质量混合物，其序列分别为:Sense 5'-GGA AUA UCC  UGC AGA AGA ATT-3'(SEQ ID No：1),Anti-sense 5'-UUC UUC UGC AGG  AUA UUC CTT-3'(SEQ ID No：2)；Sense 5'-CAU CUG AGC UAC CCG GAU  ATT-3'(SEQ ID No：3),Anti-sense 5'-UAU CCG GGU AGC UCA GAU  GTT-3'(SEQ ID No：4)；Sense 5'-GAC AAG AAG ACA UUA GUG  ATT-3'(SEQ ID No：5),Anti-sense 5'-UCA CUA AUG UCU UCU UGU  CTT-3'(SEQ ID No：6)；Sense 5'-CAA UUG GUU UGC UAU UUG  ATT-3'(SEQ ID No：7),Anti-sense 5'-UCA AAU AGC AAA CCA AUU  GTT-3'(SEQ ID No：8))，阴性对照siRNA序列为Sense 5'-UUC UCC GAA  CGU GUC ACG UTT-3'(SEQ ID No：9),Antisense 5'-ACG UGA CAC GUU  CGG AGA ATT-3'(SEQ ID No：10))由上海吉玛生物合成。将细胞分到24 孔板内，使用lipo2000(Invitrogen，11668-027)转染阴性对照siRNA及 Atg5siRNAs。36小时后，加入或者不加入50μg/mL金纳米颗粒，继续处 理细胞6小时。胰酶消化细胞，1000rpm，5min离心收集细胞，并将细胞 重悬于500μL DMEM培养基内，转移至48孔板内，进行激光照射处理 5min，或者常温放置5min。

而后，使用DMEM培养基将细胞进行适当稀释，分别种植到96孔细 胞培养板或者24孔细胞培养板内，继续培养16小时。使用实施例6的细 胞死亡检测方法检测处理前后细胞死亡的情况。实验结果见附图9。金纳 米颗粒与近红外激光对细胞并没有细胞毒性，但当两者联合在一起可以杀 伤肿瘤细胞，Atg5siRNAs沉默掉ATG5表达之后，可进一步增强金介导 的光热杀伤人宫颈癌细胞HeLa的效果。

本发明所涉及的激光器型号为MDL-III-808-2.5(长春新产业光电技术 有限公司)，耦合芯径400μm，长1米，SMA905接口的光纤，对细胞进 行激光照射处理时，激光器输出功率为2.5W，光纤输出端距离细胞培养 板底部5厘米。