一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆菌及其应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DC-Tx，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC NO.9462，保藏日期：2014年7月15日。本发明筛选出高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌DC-Tx，能够生产具有高纤溶活性和显著抗氧化功能的发酵鹰嘴豆。结果表明，本发明菌株生产的发酵鹰嘴豆，其纤溶活性可达3000FU/g，·OH清除率可达88.5％，Fe

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆菌，同时还涉及该枯草芽孢杆菌的应用，属于微生物技术领域。 

背景技术

近年来，由于饮食不平衡、环境恶化、遗传特质等原因，血管栓塞类疾病大幅增加，严重威胁着人类的健康与生命安全，每年死于脑梗塞、心肌梗死的病人多达几百万，居各种疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法，因此，具有高纤溶活性溶栓药物的研发日益受到人们的关注，有着广阔的发展前景。目前溶栓药物研究的焦点之一，是通过细菌发酵生产口服有效的溶栓功能性食品和保健食品——纳豆激酶，但该方法所得的纳豆激酶纤溶活性多不尽如人意。 

另一方面，活性氧和自由基是人体新陈代谢过程的次生代谢产物，正常情况下总是处于不断产生和消除的动态平衡中，但如果其含量过高，动态平衡被破坏，就会引起氧化应激反应，从而引发癌症、冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病、神经系统失灵、免疫力降低、关节炎等100多种常见疾病。其中动脉粥样硬化又可引起心脑血管疾病，产生血栓，因此，活性氧和自由基也是心脑血管疾病的病因之一。目前有研究表明，通过食用抗氧化性功能食品补充抗氧化物质，是预防包括心脑血管疾病在内的多种疾病的有效措施之一。 

综上所述，活性氧和自由基可引起包括心脑血管疾病在内的多种疾病，而具有抗氧化功能的食品和保健食品可以清除活性氧和自由基，因此也具有预防心脑血管疾病的作用；而高纤溶活性的保健食品可溶解已经形成的血栓，从而治疗心脑血管疾病，如能研发一种具有纤溶活性和抗氧化功能的食品，则既具有预防心血管疾病发生的功能，又能在血栓产生后具有治疗效果，从而达到预防和治疗相结合的目的，但目前还没有相关研究的报道。 

鹰嘴豆(chickpea)学名Cicer arietinum L.，富含人类所需的多种糖类、植物蛋白和氨基酸、纤维素、维生素及无机盐，具有预防高血压及动脉硬化、降低胆固醇和血脂血糖，利尿、治疗失眠等作用。有研究表明，鹰嘴豆蛋白的酶解产物(鹰嘴豆短肽)，具有显著的抗氧化功能，也有报道指出，用纳豆芽孢杆菌发酵鹰嘴豆，可以得到高纤溶活性的纳豆激酶，但目前还未见具有纤溶活性和抗氧化功能的发酵鹰嘴豆的报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆菌及其应 用，采用本发明的枯草芽孢杆菌生产发酵鹰嘴豆，可以得到具有高纤溶活性和显著抗氧化作用的鹰嘴豆发酵产物，且该方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优点，为纳豆激酶的产业化提供了技术支持，并为其作为功能性食品和保健食品的开发应用研究提供了新的思路。 

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)DC-Tx，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC NO.9462，保藏日期：2014年7月15日。 

本发明从豆豉中筛选出高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌DC-Tx，采用本发明的菌株，能够生产具有高纤溶活性和显著抗氧化功能的发酵鹰嘴豆。实验结果表明，本发明菌株生产的发酵鹰嘴豆，其纤溶活性可达3000FU/g，羟基自由基(·OH)清除率可达88.5％，Fe³⁺还原能力是鲜鹰嘴豆的3.33倍。 

本发明所采用的技术方案还在于提供一种枯草芽孢杆菌在生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆方面的应用。 

本发明枯草芽孢杆菌生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的方法，包括以下步骤： 

(1)挑取枯草芽孢杆菌接种于LB液体种子培养基，在28-40℃条件下，120-180rpm摇床恒温培养12-18h，得到枯草芽孢杆菌种子液； 

(2)将鹰嘴豆浸泡过夜，沥干水分，高压灭菌，冷却至室温后，按照1-8％的接种量接种枯草芽孢杆菌种子液，在28-40℃条件下发酵培养36-72h； 

(3)将步骤(2)的鹰嘴豆发酵培养产物低温真空冷冻干燥，粉碎，过80-120目筛即得。 

所述LB液体种子培养基包括以下质量分数的原料：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％；pH6.8，121℃高压灭菌20min。 

所述低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度﹣50℃，真空度20-100Pa，冻干温度≤﹣45℃，冻干时间24-48h。本发明中冷冻干燥选择低温真空冷冻干燥，而不采用喷雾干燥，目的是为了更好地保持所得发酵产物的纤溶和抗氧化功能。 

本发明利用枯草芽孢杆菌DC-Tx发酵生产具有高纤溶活性和显著抗氧化功能的发酵鹰嘴豆，该方法具有操作简单，成本低，周期短和易于实现的优点。同时，本发明采用鹰嘴豆为原料，来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、试剂价格便宜，便于规模化生产。 

附图说明

以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 

图1为本发明发酵鹰嘴豆纤溶活性测定结果； 

图2为本发明发酵鹰嘴豆·OH清除率测定结果；其中， 

a为GSH，b为发酵36h鹰嘴豆，c为发酵48h鹰嘴豆，d为发酵72h鹰嘴豆，e为鲜鹰嘴豆； 

图3为本发明发酵鹰嘴豆Fe³⁺还原能力测定结果；其中， 

a为GSH，b为发酵36h鹰嘴豆，c为发酵48h鹰嘴豆，d为发酵72h鹰嘴豆，e为鲜鹰嘴豆。 

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 

实施例1 

1、纳豆激酶高产菌株的筛选 

1.1纳豆激酶高产菌株的初筛 取市售豆豉，分离样品10g，加入100mL无菌水中，充分振荡，100℃沸水煮沸5min，静置片刻，取上层混浊液，梯度稀释后，分别取100μL不同稀释度的溶液，均匀涂布于LB平板上，37℃过夜培养，挑单菌落进行划线培养，连续两次。挑取LB分离平板上的单菌落点种到纤维蛋白平板上，37℃培养18h，测量溶解圈直径，溶解圈较大的菌株液体发酵进行复筛。 

1.2纳豆激酶高产菌株的复筛 将初筛透明圈直径较大的菌株，用LB种子培养基活化(37℃、150r/min、过夜)，按照5％的接种量分别接入液体发酵培养基(以质量分数计：6％大豆粉，2％葡萄糖，0.06％CaCl₂，0.07％MgSO₄，pH6.5)中，37℃发酵72h，其发酵产物用pH7.4的磷酸缓冲液稀释，取稀释液10μL，加样于纤维蛋白平板上37℃恒温培养18h，测定透明圈直径，选取溶解圈最大的菌株，命名为DC-Tx。 

菌株DC-Tx的特征如下： 

形态特征： 

LB平板上37℃培养24h，菌株DC-Tx菌落呈圆形，边缘微有叶状齿，白色不透明；菌体形态呈小短杆状，长3.0-4.0μm，宽0.8-1.0μm，革兰氏阳性，芽孢中生，椭圆形。 

生理生化特征见表1。 

表1 菌株DC-Tx的生理生化特征 

16S rDNA测序鉴定： 

提取菌株DC-Tx的基因组DNA，用16S rDNA基因通用引物PCR扩增；得到的PCR产物，与pGM-T载体连接，转化DH5α感受态细胞；筛选阳性克隆，提质粒DNA进行酶切鉴定；连接正确的阳性克隆进行16S rDNA测序，其测序结果如下： 

比较发现，菌株DC-Tx的16S rDNA的全基因序列与网上公布的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌符合率均达到99％。 

综合上述形态特征、生理生化分析和分子测序鉴定的结果，表明DC-Tx是一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 

实施例2 

本实施例用枯草芽孢杆菌DC-Tx生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的方法，包括以下步骤： 

(1)挑取枯草芽孢杆菌DC-Tx接种于LB液体种子培养基，在28℃条件下，180rpm摇床恒温培养15h，得到枯草芽孢杆菌DC-Tx种子液； 

(2)将鹰嘴豆浸泡过夜，沥干水分，121℃高压灭菌20min，冷却至室温后，按照8％的接种量接种枯草芽孢杆菌DC-Tx种子液，在28℃条件下发酵培养36h； 

(3)将步骤(2)的鹰嘴豆发酵培养产物低温真空冷冻干燥，粉碎，过100目筛即得；低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度﹣50℃，真空度20Pa，冻干温度﹣50℃，冻干时间24h。 

实施例3 

本实施例用枯草芽孢杆菌DC-Tx生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的方法，包括以下步骤： 

(1)挑取枯草芽孢杆菌DC-Tx接种于LB液体种子培养基，在34℃条件下，120rpm摇床恒温培养12h，得到枯草芽孢杆菌DC-Tx种子液； 

(2)将鹰嘴豆浸泡过夜，沥干水分，121℃高压灭菌20min，冷却至室温后，按照5％的接种量接种枯草芽孢杆菌DC-Tx种子液，在34℃条件下发酵培养48h； 

(3)将步骤(2)的鹰嘴豆发酵培养产物低温真空冷冻干燥，粉碎，过80目筛即得；低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度﹣50℃，真空度60Pa，冻干温度﹣55℃，冻干时间48h。 

实施例4 

本实施例用枯草芽孢杆菌DC-Tx生产具有纤溶和抗氧化功能发酵鹰嘴豆的方法，包括以下步骤： 

(1)挑取枯草芽孢杆菌DC-Tx接种于LB液体种子培养基，在40℃条件下，150rpm摇床恒温培养18h，得到枯草芽孢杆菌DC-Tx种子液； 

(2)将鹰嘴豆浸泡过夜，沥干水分，121℃高压灭菌20min，冷却至室温后，按照1％的接种量接种枯草芽孢杆菌DC-Tx种子液，在40℃条件下发酵培养72h； 

(3)将步骤(2)的鹰嘴豆发酵培养产物低温真空冷冻干燥，粉碎，过120目筛即得；低温真空冷冻干燥的条件为：预冷温度﹣50℃，真空度100Pa，冻干温度﹣45℃，冻干时间36h。 

实验例、本发明发酵鹰嘴豆纤溶和抗氧化功能的测定 

样品的制备：配制质量分数2％的发酵鹰嘴豆粉生理盐水悬液，4℃浸提4h，5000×g离心10min后，所得上清液15000×g重复离心10min后，上清液用于纤溶和抗氧化功能的测定。 

1、维平板法测定发酵鹰嘴豆的纤溶活性 

纤维蛋白平板的制备：1g琼脂糖溶于0.01M pH7.4的磷酸钠盐缓冲液100mL中，取该琼脂糖溶液7.5mL，50℃水浴保温5min，加入溶于生理盐水的100BP/mL凝血酶225μL，混匀，50℃水浴5min，取7.5mL 3.6mg/mL牛纤维蛋白原溶液(溶于0.1M pH7.4的磷酸钠盐缓冲液)，加入保温的凝血酶—琼脂糖溶液中，迅速混匀，倒入直径9cm的培养皿，待凝。 

标准曲线的绘制：用灭菌生理盐水分别配制20、40、60、80和100IU/mL的尿激酶标准品溶液，各取10μL点样于纤维蛋白平板上，37℃保温18h，测定纤维蛋白平板上溶解圈的直径(见附图1)，取三次试验的平均直径，计算溶解圈面积；以尿激酶活性(IU/mL)为横坐标，溶解圈面积为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线。 

纤溶活性的测定：用微量加样器移取10μL发酵鹰嘴豆粉浸提液，点样于纤维蛋白平板上，7℃保温18h，测量纤维蛋白平板上溶解圈的直径，计算溶解圈面积。根据标准曲线，计算纤溶活性。 

测定结果发现，48h之前，随发酵时间的延长，纤溶活性显著增加，48h后，纤溶活性随时间的延长基本不变，发酵48h时发酵产物纤溶活性可以达到3000FU/g。 

2、发酵鹰嘴豆清除·OH能力的测定 

取50μL 3mM 1,10邻二氮杂菲(溶于0.1M pH7.4的磷酸钠盐缓冲液)加入96孔板中，加入50μL样品，混匀，加50μL FeSO₄(3mM)水溶液，混匀，加50μL质量分数0.01％双氧水(H₂O₂)的水溶液，盖上盖子，37℃恒温60min，测定536nm处的吸光度，此为样品组(A1)，Control用蒸馏水代替样品(A0)，Blank用蒸馏水代替样品和0.01％双氧水(A2)。 

用如下公式计算样品对·OH的清除率：·OH清除率(％)＝[(A1-A0)/(A2-A0)]×100％ 

结果发现，发酵48h的鹰嘴豆的·OH清除率达到88.5％，是谷胱甘肽(GSH)清除·OH能力(47.7％)的近两倍，且显著高于鲜鹰嘴豆对·OH的清除率(52.3％)(测定结果见附图2)，说明本发明发酵得到的发酵鹰嘴豆具有很强的·OH清除能力。 

3、发酵鹰嘴豆还原Fe³⁺能力的测定 

取250μL样品与250μL质量分数1％的铁氰化钾水溶液混合(对照中不含样品)，50℃恒温水浴20min，后加入250μL质量分数10％三氯乙酸水溶液，混匀后5000×g离心10min，取100μL上清液，加入96孔板中，加20μL质量分数0.1％FeCl₃水溶液，后加入80μL蒸馏水，混匀，混合液25℃静置10min，测定上清液700nm处的吸光度。 

测定结果表明，发酵鹰嘴豆Fe³⁺还原能力在发酵72h时最强，OD_700nm值为0.40，虽与GSH OD_700nm值(1.57)相差较大，但却是鲜鹰嘴豆Fe³⁺还原能力(OD_700nm值为0.12)的3.33倍，表明发酵鹰嘴豆具有较强的Fe³⁺还原能力(见附图3)。 

实验结果说明，本发明发酵鹰嘴豆具有非常高的纤溶活性和较强的抗氧化能力。本发明为发酵鹰嘴豆的规模化生产提供了一种新的途径，并为其作为功能性食品和保健食品的开发应用研究提供了新的思路。