一株枯草芽孢杆菌产溶纤酶的研究

摘要

溶纤酶是指能溶解血液中纤维蛋白的一类酶的总称。微生物是溶纤酶最重要的来源之一，微生物溶纤酶具有分子量小、无免疫原性、安全无毒、酶活性高、不易引起出血、半衰期长和可经消化道直接吸收等优点，被认为是安全、廉价、最具开发潜力的溶栓剂之一。本课题从诱变选育溶纤酶高产突变株开始，主要完成了以下研究内容： 从实验室保藏菌种B2（溶纤酶活470IU/mL）出发，采用紫外线、硫酸二乙酯单独及复合诱变处理方式进行诱变，经过平板初筛和摇瓶发酵初筛、复筛选育到一株产酶水平较高且性状稳定的溶纤酶高产突变株SFF-B2，产酶活力达790IU/mL，比出发菌株活力提高了68.2％；对菌株SFF-B2进行了菌落、菌体形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析，初步鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（GenBank登录号：FJ612600）。 对溶纤酶高产突变株SFF-B2的发酵产酶培养基和培养条件进行了优化。确定的最佳培养基为（g/L）：可溶性淀粉60，豆粕粉18，玉米浆2，CaCl20.5，MgSO40.5，K2HPO42，NaCl0.4；确定的最佳发酵条件为：种龄14h，接种量5％，初始pH值7.0，装液量30mL/250mL三角瓶，摇床转速180 r/min，培养温度37℃。在最佳培养基和最佳发酵条件下，突变株SFF-B2产酶活力达到1218 IU/mL，比优化前提高了54％。 采用硫酸铵分级盐析、透析袋脱盐、Sephadex G-25凝胶过滤层析、DEAESepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析分离技术，从发酵液中分离纯化出溶纤酶，酶活回收率达到48％，纯化倍数为28；纯化后的溶纤酶经SDS-PAGE鉴定为单一组分，其相对分子量为29.8 kDa。 溶纤酶在常温下稳定，50℃以上容易失活；酶最适反应温度40℃；在KH2PO4-NaOH缓冲体系和磷酸盐缓冲体系中酶活较稳定，最适pH为7.0；Cu2+、Ag+、Al3+对酶有比较明显的抑制作用，且离子强度越大时，抑制作用越明显；Ca2+、Mg2+对酶有比较明显的激活作用。 综上所述，突变株SFF-B2所产溶纤酶具有较好的温度和pH稳定性，是一株具有开发潜力的溶纤酶生产菌株。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 绪论

1.1溶栓类药物的发展

1.2溶纤酶的概述

1.2.1溶纤酶

1.2.2溶纤酶的作用机理研究

1.2.3溶纤酶的生产方法

1.2.4溶纤酶酶活力测定方法

1.3微生物溶纤酶的种类及性质

1.4发酵法生产溶纤酶技术研究现状

1.4.1产溶纤酶微生物

1.4.2溶纤酶发酵工艺

1.4.3溶纤酶的分离纯化

1.4.4产溶纤酶微生物的分子生物学研究

1.4.5溶纤酶类产品的开发

1.5立题的背景及研究意义

1.6课题的主要研究内容

1.6.1溶纤酶生产菌的选育

1.6.2高产突变株产溶纤酶发酵条件的优化

1.6.3溶纤酶的分离纯化及其酶学特性的初步研究

第2章 溶纤酶生产菌的选育

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1实验菌种

2.2.2实验试剂

2.2.3实验器材

2.2.4培养基配制

2.2.5试剂的配制

2.2.6酶活力分析方法

2.2.7诱变及筛选方法

2.2.8菌株鉴定方法

2.3结果与讨论

2.3.1菌种的诱变选育

2.3.2菌株SFF-B2的初步鉴定

2.4小结

第3章 菌株SFF-B2产溶纤酶发酵条件的优化

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1实验菌种

3.2.2实验试剂

3.2.3实验器材

3.2.4培养基配制

3.2.5培养方法

3.2.6酶活力分析方法

3.3结果与讨论

3.3.1菌株SFF-B2发酵培养基的优化

3.3.2菌株SFF-B2发酵条件的优化

3.3.3优化前后菌株SFF-B2发酵进程比较

3.4小结

第4章 溶纤酶的分离纯化及其酶学特性的初步研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1实验试剂

4.2.2实验器材

4.2.3 Bradford法测定蛋白质的含量

4.2.4溶纤酶粗酶液的制备

4.2.5 Sephadex G-25凝胶过滤层析

4.2.6 DEAE Sepharose FF Fast Flow离子交换层析

4.2.7 Sephadex G-75凝胶过滤层析

4.2.8 SDS-PAGE法测定溶纤酶的分子量

4.2.9溶纤酶酶学特性研究

4.3结果与分析

4.3.1溶纤酶粗酶液的制备

4.3.2溶纤酶的层析纯化结果

4.3.3溶纤酶分子量的测定及纯度分析

4.3.4溶纤酶酶学性质

4.4小结

第5章 结论与展望

5.1结论

5.2展望

参考文献

致谢

在学期间主要科研成果