一种建立鹅胚上皮细胞系的方法及建立的鹅胚上皮细胞系

摘要

本发明公开了一种建立鹅胚上皮细胞系的方法及建立的鹅胚上皮细胞系。本发明涉及一种建立鹅胚上皮细胞系的方法，其特征在于将原代鹅胚胎组织贴壁法、差速酶消化法和单克隆筛选方法相结合，优化了原代培养条件。此方法操作方法简便，便于推广应用。本发明还涉及所述方法建立的鹅上皮细胞系，其保藏号为CCTCC NO:C2014137，该细胞系的建立解决了目前尚未有完善的鹅源细胞系的问题。本发明还涉及一种用于培养和/或增殖小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒及I型鸭肝炎病毒及新型鸭肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的待感染宿主细胞即为或包括所述的鹅胚上皮细胞系。本发明，验证了所述鹅胚上皮细胞系对小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒及I型鸭肝炎病毒及新型鸭肝炎病毒感染的敏感特性。

说明书

技术领域

本发明属于动物细胞工程技术领域，具体涉及一种建立鹅胚上皮细胞系的方法及建立的鹅胚上皮细胞系。 

背景技术

我国是水禽生产大国，水禽产量占世界的60％以上，其中鹅的产量约占世界总产量的90％以上。我国的养鹅历史悠久，据考证，早在距今约6000年前的新石器时代，就已开始驯养鹅。随着我国经济的发展及人民生活水平的不断提高，动物性食物消费比例的增加和消费习惯的改善，促进了农业产业结构的调整和畜牧业生产地位的提高，养鹅业因具有产品用途广，耗粮少，生产周转快，投入低，产出高，社会经济效益好等特点进一步得到社会的认可，养鹅生产迅速发展。据统计，解放前我国仅养鹅1700万只，上世纪的五十年代增加到6000万只，八十年代初为1.2亿只，八十年代末发展到3亿只；根据FAO公布的数据，2011年我国鹅存栏3.32亿只，占世界总量的89.72％；2011年我国鹅出栏6.10亿只，占世界总量的93.98％；2012年我国鹅出栏数量接近6.29亿只。近年仍保持稳定上升趋势，成为名符其实的世界养鹅大国。养鹅业每年为社会提供鹅肉、羽毛(绒)，在国际上占有优势地位，已成为国家出口创汇和农民增加收入的支柱产业之一。尽管养鹅业今年发展较快，但鹅产品在国内市场仍供不应求。 

上世纪90年代中期以前，鹅病的传染病只有小鹅瘟、鹅的鸭瘟病、禽出败、副伤寒、大肠杆菌病、流行性感冒、曲霉菌病等几种，而90年代后期至今，随着养鹅业的兴旺发展，国内跨省和跨区域交易及引种频繁，为鹅病的广泛传播 创造了条件，极易造成鹅病的大规模流行。鹅虽然具有较强的抗病力，但伴随我国畜禽业的发展及病原微生物的不断变异，过去不引起鹅发病或很少使鹅发病的一些疾病，现在已经成为养鹅生产必须预防的疾病。近年国内鹅病流行趋势可看出，鹅的发病种类日趋增多，除了小鹅瘟、细小病毒、禽流感，逐渐出现了一些新的传染病如雏鹅新型病毒性肠炎、鹅副粘病毒病、鹅出血性坏死性肝炎、法氏囊炎、鹅鸭疫李默氏杆菌病等烈性传染病。从现实情况看，老的传染病继续存在，新的传染病又不断发生，加上常见多发的雏鹅感冒、中毒症(药物、农药、有害气体中毒)、寄生虫病(重点是绦虫)，给养鹅业造成严重损失，成为规模养鹅业健康发展的制约因素。在诸多的疾病中，鹅传染性疾病相对危害较大，尤其小鹅瘟病毒、细小病毒、禽流感等病毒性疾病。 

鹅病毒的分离多是通过鹅胚或番鸭胚来分离，但是由于目前国内外尚无商品化的无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)鹅胚和番鸭胚，用其分离鹅病毒存在内源病毒干扰等情况，影响病毒的分离。为了更好有效的分离到鹅病毒，及早检测出病毒，预防疾病爆发，许多国内外的学者都在进行鹅细胞系的研究。但目前尚无商品化的鹅源细胞系。因此，现在急需对其方法改进，建立一株能够稳定快速传代的鹅胚细胞系。 

发明内容

本发明基于上述领域的空白，利用原代鹅胚胎组织贴壁法、差速酶消化法及单克隆筛选方法相结合，优化了原代培养条件，提供了一种操作简便，易于推广的建立鹅胚上皮细胞系的方法，并成功获得了培养特性稳定、单纯、高活力的鹅胚上皮细胞系。本发明的技术方案如下： 

建立鹅胚上皮细胞系的方法，其特征在于，包括如下步骤： 

(1)原代细胞贴壁培养：无菌收集鹅胚组织，加入浓度为PBS 10mL，清洗5～10分钟，弃去PBS后，加入10～20mL含有抗生素的消毒液处理5～10分钟，取出鹅胚组织并剪成0.5～1.5mm3的组织块，将组织块平贴入培养板的孔 底，每孔一块，向培养孔加入2～3mL培养液I，置于37℃、5％CO2条件下培养至组织块完全贴壁，然后加入培养液I至2～3mL，在37℃、5％CO2条件下培养，培养期间更换培养液； 

(2)传代培养：贴壁培养的细胞长成单层细胞后，弃去培养液I，用胰酶消化处理，大部分成纤维样细胞脱落，弃去脱落的细胞，在6孔板加入细胞培养液II 2-3mL，置于37℃、5％CO2条件下培养； 

(3)鹅上皮细胞系的单克隆筛选：以传代培养法连续传代至第5代后，将细胞用胰酶消化处理至单个细胞，然后按照平均1.5个细胞/孔的密度接种到培养板，标记接种单个细胞的孔，待所述单个细胞的孔中的细胞长成上皮样细胞克隆团即得到鹅上皮细胞系的单克隆； 

所述培养液I为含有体积比10％胎牛血清，1％-2％的鹅血清及0.2％-1％鹅胚尿囊液的DMEM； 

所述培养液II为含有体积比5％新生牛血清的DMEM。 

所述胰酶消化处理指用1～5g/L的胰蛋白酶溶液消化30s～60s。 

所述含抗生素的消毒液为用PBS配制的质量百分比浓度为20％～70％的庆大霉素溶液。 

所述鹅胚组织为来源于孵化10～12日龄的鹅胚胎除脑、眼、四肢、内脏之外的任何组织。 

所述的方法建立的鹅胚上皮细胞系。 

所述的鹅胚上皮细胞系，其保藏号为CCTCC NO:C2014137。 

用于培养和/或增殖禽病毒的的试剂盒，其特征在于，包含所述的鹅胚上皮细胞系，所述鹅胚上皮细胞系用作所述禽病毒的待感染宿主细胞，所述禽病毒指小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、I型鸭肝炎病毒和/或新型鸭肝炎病毒。 

所述的试剂盒，其特征在于，还包含用于病毒培养和/或增殖的常规试剂。 

所述的鹅胚上皮细胞系在制备培养和/或增殖禽病毒的试剂盒中的用途，其特征在于，采用所述鹅胚上皮细胞系作为所述禽病毒的待感染宿主细胞，所述 禽病毒指小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、I型鸭肝炎病毒和/或新型鸭肝炎病毒。 

本发明提供的鹅胚上皮细胞系的建立方法，能够成功获得鹅胚上皮细胞系。便于操作、易于推广、限制少、成功率高。建立过程中细胞培养所用的都是最常规的培养基和试剂，除原代培养和细胞单克隆筛选加入胎牛血清外，操作简便，不需要太贵重的仪器设备。实验证明，获得的鹅胚上皮细胞系生长分裂状态良好、纯度高、体外增殖旺盛，可稳定传代50代以上。同时本发明还验证了所述鹅胚上皮细胞系对小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒及I型鸭肝炎病毒及新型鸭肝炎病毒的敏感特性，因此，本发明所述的细胞系可广泛用于与小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒及I型鸭肝炎病毒及新型鸭肝炎病毒的培养、增殖和/或分离相关的实验或研究中。 

本发明经过原代培养，差速消化及单克隆筛选相结合的方法提供了一种鹅胚上皮细胞系的建立方法，建立的细胞系来自单克隆，具有纯度高，形态均一，呈典型的上皮细胞形态，连续传代50代仍保持该形态的特点；同时细胞系还具有分裂增殖旺盛，营养要求低，连续培养50代仍保持该旺盛的增殖特性。本发明所提供的鹅胚上皮细胞系的建立方法及获得的鹅胚上皮细胞系填补了目前尚未完善的鹅源细胞系技术的空白。 

本发明还提供了培养和/或增殖小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、I型鸭肝炎病毒及新型鸭肝炎病毒的试剂盒，该试剂盒中的待感染宿主细胞即为或包括本发明所述的鹅胚上皮细胞系。本发明利用小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒、I型鸭肝炎病毒及新型鸭肝炎病毒感染所述鹅胚上皮细胞系，并于对照细胞比对，验证了所述细胞系对上述几种病毒感染的敏感特性。因此，本发明所述的鹅胚上皮细胞系可用于与上述三种病毒有关的分离、培养和/或增殖等任何相关细胞实验或研究中，本发明所述的试剂盒具有灵敏度高、成本较低、操作便捷、效果良好等特点。 

生物保藏信息： 

分类命名：鹅胚上皮细胞系WWX-GEEC03 

保藏号：CCTCC NO:C2014137 

保藏日：2014年7月9日 

保藏单位：中国典型培养物保藏中心 

地址：中国，武汉，武汉大学邮编：430072。 

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述： 

图1为原代鹅胚细胞显微镜下图； 

图2为原代鹅胚细胞传至第五代的显微镜下图； 

图3为鹅胚上皮细胞克隆； 

图4为鹅胚上皮细胞系第30代细胞显微镜下图； 

图5为鹅胚上皮细胞系第50代细胞显微镜下图； 

图6为鹅胚上皮细胞系HE染色图； 

图7为鹅胚上皮细胞生长曲线图； 

图8为外源基因在鹅胚上皮细胞系中表达48h图(pEGFP-N1质粒转染)； 

图9为鹅胚上皮细胞周期图； 

图10为鹅胚上皮细胞接毒试验中未接毒对照图； 

图11为鹅胚上皮细胞接种番鸭细小病毒病变图； 

图12为鹅胚上皮细胞接种小鹅瘟病毒病变图； 

图13为鹅胚上皮细胞接种I型鸭肝炎病毒病变图； 

图14为鹅胚上皮细胞接种新型鸭肝炎病毒病变图。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明 的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。 

主要仪器设备 

1、倒置相差荧光显微镜: 

2、-70℃超低温冰箱: 

3、CO2培养箱:日本三洋SANYO-MCO-15AC 

4、液氮贮存器：四川东亚YES-SOB-125F； 

5、电泳仪：北京六一厂DYY 6C； 

6、电泳槽：北京六一厂DYC-24A: 

7、高性能无菌实验台 

8、流式细胞仪 

主要试剂 

1、DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 

2、载体pEGEP-N1：由本实验室保存。 

3、胰蛋白酶(Trypsin 1:250)，吉姆萨(Giemsa):Amresco； 

4、特级胎牛血清(Defined FBS)：Gibco； 

5、台盼蓝(Trypan Blue)，Triton(曲拉通)X-100>99％； 

6、二甲基亚砜：invitrogen； 

7、脂质体2000：invitrogen。 

鸭胚上皮细胞培养所用液体配制： 

8、DMEM培养液：DMEM 9.6g，溶于超纯水中，用NaHCO3约3.2g调节pH至7.2～7.4，加水定容至1L，用磁力搅拌器搅拌混匀，0.22μm滤膜过滤除菌，500ml/瓶分装，贮存于4℃。 

9、培养液I：DMEM培养液中加入终浓度为10％(V/V)胎牛血清，1％-2％(V/V)的鹅血清及0.2％-1％(V/V)鹅胚尿囊液，0.22μm滤膜过滤500mL/瓶分装，4℃贮存。 

培养液II：DMEM培养液中加入终浓度为5％(V/V)新生牛血清，0.22μm滤膜过滤500mL/瓶分装，4℃贮存。 

10、双抗贮存液：100万IU的链霉素4支，80万IU的青霉素5支溶于400mL灭菌去离子水中。 

11、1×PBS缓冲液：NaCl 14.00g，KCl 0.10g，Na2HPO4×12H2O 1.45g，KH2P040.10g，加超纯水定容至500mL，pH为7.2，高压灭菌密封后4℃贮存。 

12、0.1％～0.5％(质量体积比)胰蛋白酶溶液：1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500mL，pH为7.2～7.4，0.22μm滤膜过滤分装，-20℃贮存。 

13、细胞冻存液：将5mL DMSO加入45mL全培养液(含体积比15％FBS的全培养液)中，用0.22μm滤膜过滤100mL/瓶分装，贮存于-20℃冰箱。 

14、D-Hanks培养基：称取NaCl 8.0g，KCl 0.4g，Na2HPO4·12H2O 0.133g，KH2PO40.06g，NaHCO20.35g，酚红0.02g，将上述成分加入烧杯中，加100mL超纯水搅拌使固体粉末充分溶解，再补加超纯水最后定容至1000mL。 

如无特别说明，本发明所用试剂均为本领域常规试剂。 

主要生物材料 

鹅胚组织：购自养殖场 

小鹅瘟病毒：由山东省滨州畜牧兽医研究院分离保存。(参考文献：李书光,王艳,刘吉山,苗立中,沈志强.山东省小鹅瘟病毒BZ株的分离鉴定及VP3基因的序列分析[J].黑龙江畜牧兽医,2010,11:114-115.)； 

番鸭细小病毒：由山东省滨州畜牧兽医研究院分离保存。(参考文献：王文秀,莫玲,王艳,张松林,高三阳,沈志强.番鸭细小病毒的分离及其VP1基因序列[J].中国家禽,2014,36(8):51-53.)； 

I型鸭肝炎病毒：由山东省滨州畜牧兽医研究院分离保存。(参考文献：谢金文,苗立中,王艳,肖越强,王金良,沈志强.鸭肝炎病毒的分离鉴定及其理化和生物学特性初步研究[J].安徽农业大学学报,2011,38(1):51-54.)。 

新型鸭肝炎病毒：由山东省滨州畜牧兽医研究院分离保存，本专利用的是 文献中提到的山东株(SD株)。(参考文献：赵金花,沈志强,朱辉,李峰,甄洪花,苗立中,单虎.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析[J].中国预防兽医学报,2011,33(10):772-780.)。 

实施例1 鹅胚上皮细胞系的建立 

按照下述步骤建立本发明所述的鹅胚上皮细胞系： 

(1)无菌采取11～13日龄的鹅胚胎组织，用灭菌剪刀剪去头、四肢和内脏器官后放入10mL的玻璃烧杯中，加入浓度为PBS 10mL，清洗5～10分钟；弃去PBS后，加入10～20mL用PBS配制的质量百分比浓度为20％～70％的庆大霉素溶液处理5～10分钟； 

(2)取出鸭胚组织并剪成0.5～1.5mm3的组织块，将组织块平贴入6孔培养板的孔底，每孔一块，向培养孔加入2～3mL含有体积比10％胎牛血清，1％-2％的鹅血清及0.2％-1％鹅胚尿囊液的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2条件下培养至组织块完全贴壁，然后加入上述DMEM培养液至2～3mL，在37℃、5％CO2条件下培养，培养期间更换培养液； 

(3)待贴壁培养的细胞长成单层后，用1～5g/L的胰蛋白酶溶液消化30s～60s并进行传代培养。原代鹅胚细胞大部分为成纤维样细胞，少数细胞呈上皮样形态。成纤维细胞对胰酶敏感，单层细胞弃去上述DMEM培养液后，加入2.5g/L胰酶消化30s-60s，大部分成纤维样细胞脱落，弃去脱落的细胞，在6孔板加入含有体积比5％新生牛血清的DMEM培养液2-3mL，置于37℃、5％CO2条件下培养； 

(4)以传代培养法连续传代至第5代后，将细胞用2.5g/L胰酶消化至单个细胞，然后按照平均1.5个细胞/孔的密度接种到培养板，标记接种单个细胞的孔，待这些单个细胞的孔中的细胞长成上皮样细胞克隆团即得到鹅上皮细胞系的单克隆。 

(5)单克隆鹅上皮细胞系的传代培养 

用1～5g/L的胰蛋白酶溶液消化成团的单细胞系30s～60s，然后继代培养 50代，即完成了本发明所述的鹅胚上皮细胞系的建立。 

其中一个单细胞系送保藏，信息如下： 

分类命名：鹅胚上皮细胞系WWX-GEEC03 

保藏号：CCTCC NO:C2014137 

保藏日：2014年7月9日 

保藏单位：中国典型培养物保藏中心 

地址：中国，武汉，武汉大学邮编：430072 

实施例2 鹅胚上皮细胞系的生物学特性分析 

1.形态学观察 

通过倒置显微镜观察，建立的鹅胚上皮细胞系F30代(图4)和F50代(图5)与原代细胞(图1)相比形态有明显差异，原代细胞含有多种杂细胞，大多数细胞形态为长梭状，少数为多角形和卵圆形，而建立的上皮细胞系是由细胞单克隆获得，其纯度高于99.9％，均为上皮样细胞，HE染色也显示细胞呈多角形或短梭状的的上皮样细胞形态(图6)，有圆形的细胞核，细胞生长与分裂能力十分旺盛，群体倍增时间仅为17.1h。 

2.生长曲线测定 

取待测30代、50代生长状态良好的细胞，增至接近汇合时，用常规方法消化细胞制成细胞悬液并计数。按1×104个/孔细胞量向24孔培养板内分别接种细胞，于37℃CO2培养箱中继续培养。从接种时间算起，每隔24h用2.5g/L胰蛋白消化细胞，用全自动自动计数仪计数3孔内的细胞密度，算出平均值，如此至第8天结束。以培养时间(d)为横坐标、细胞密度为纵坐标，将结果在坐标纸上绘图，即得培养细胞的生长曲线。 

通过对所培养的鹅胚上皮细胞用常规方法制备细胞悬液，计数，接种24孔培养板，每孔1mL细胞悬液，对接种于24孔培养板的细胞进行连续7d定时计数，记录各次细胞密度，绘制而成培养细胞生长曲线如图7所示，接种后第2d 细胞数开始增加，第3d进入对数生长期，第6d细胞生长缓慢，细胞生长期总体趋势均呈S型，本发明方法培养的鹅胚上皮细胞系的纯度为99.9％，细胞群体倍增时间(PDT)为17.1h，证明细胞纯度高、生命力旺盛。 

3.细胞系周期测定 

(1)将待测所述鹅胚上皮细胞系样本用2.5g/L胰酶消化后制成单细胞悬液，然后800转/分钟离心8分钟，弃去上清。 

(2)用4℃预冷的700mL/L冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。 

(3)调整细胞浓度为106个/mL，37℃孵育30分钟，进行流式细胞仪分析，见图9。 

实施例3 鹅胚上皮细胞系对番鸭细小病毒的敏感性验证 

1.方法 

取鹅胚上皮细胞系第50代细胞，待长成80％单层时吸弃培养液并以D-Hanks培养基洗2次后接种番鸭细小病毒，37℃吸附1小时，弃去病毒液并补充DMEM维持液(含有1％新生牛血清)培养，同时设空白对照(不接种番鸭细小病毒的鹅胚上皮细胞系)。同样方法接种小鹅瘟病毒、I型鸭肝炎病毒、新型鸭肝炎病毒。 

2.结果 

经观察所述鹅胚上皮细胞对番鸭细小病毒敏感，96h内感染细胞均产生特有的细胞病变，见图11；而对照细胞形态正常，见图10。 

实施例4 鹅胚上皮细胞系对小鹅瘟病毒的敏感性验证 

按照实施例3所述的方法验证鹅胚上皮细胞系对小鹅瘟病毒的敏感性，经观察所述鹅胚上皮细胞对小鹅瘟病毒敏感，96h内感染细胞均产生特有的细胞病变，见图12；而对照细胞形态正常，见图10。 

实施例5 鹅胚上皮细胞系对I型鸭肝炎病毒的敏感性验证 

按照实施例3所述的方法验证鹅胚上皮细胞系对I型鸭肝炎病毒的敏感性，经观察所述鹅胚上皮细胞对I型鸭肝炎病毒敏感，96h内感染细胞均产生特有的细胞病变，见图13；而对照细胞形态正常，见图10。 

实施例6 鹅胚上皮细胞系对新型鸭肝炎病毒的敏感性验证 

按照实施例3所述的方法验证鹅胚上皮细胞系对新型鸭肝炎病毒的敏感性，经观察所述鹅胚上皮细胞对新型鸭肝炎病毒敏感，96h内感染细胞均产生特有的细胞病变，见图14；而对照细胞形态正常，见图10。