鹅胚成纤维细胞系的建立及鹅细小病毒细胞适应株的培育

摘要

鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)是小鹅瘟的病原，易感染4-20日龄各品系的雏鹅和雏番鸭，而对其他禽类和哺乳动物均没有感染性。该病具有传播速度快，发病率高和死亡率高的特点，临床表现为腹泻、精神萎靡、食欲减退和呼吸困难。主要传播方式主要是水平传播和垂直传播，水平传播是通过消化道传播，垂直传播是通过种蛋传染。该病没有显著的季节性，全年都有可能发生，但以冬、春季发生为主。由于该病传播快、病程短、病死率高，是严重危害养鹅业的重要疾病之一，引起国内外学者的广泛重视。 为培育鹅细小病毒鹅胚成纤维细胞适应毒株，采用在鹅胚上连续传代的方法，培育细胞适应毒株。本研究将原代鹅胚成纤维细胞(GEF)进行连续传代培养，建立了鹅胚成纤维细胞系，并成功传至31代次，传代的GEF具有典型的成纤维细胞形态，培养48 h后形成单层细胞。选取不同代次的GEF接种GPVYN分离株，并在GEF中连续传代至F20代，病毒滴度由102.5TCID50/0.1 mL达到106.16TCID50/0.1 mL，表明GPV已适应GEF，传代至F12代细胞在72h后出现细胞病变。对细胞适应毒F20和亲本病毒F0代进行基因序列比对结果显示，F20与F0存在133个核苷酸差异位点，主要集中在5'和3'非编码区。氨基酸序列共出现22个变异位点，主要集中在VP3蛋白上。这些变异与病毒对细胞培养的适应过程有关，其机理有待进一步研究。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 鹅细小病毒概述

1．1．1 鹅细小病毒的理化特征

1．1．2 鹅细小病毒的培养特征

1．1．3 GPV的分类地位

1．2 小鹅瘟的研究进展

1．2．1 小鹅瘟的流行病学特点

1．2．2 小鹅瘟的临床症状及病理变化

1．2．3 小鹅瘟的诊断

1．2．4 小鹅瘟的防治

1．3 鹅细小病毒的分子生物学特点

1．3．1 基因组结构

1．3．2 开放阅读框及编码区的分布

1．3．3 GPV的结构蛋白

1．3．4 GPV的非结构蛋白

1．4 鹅细小病毒适应株的研究进展

1．4．1 鹅胚和鸭胚适应株的研究进展

1．4．2 成纤维细胞适应株的研究进展

1．5 细胞系的概述

1．5．1 细胞系、细胞株及克隆的定义

1．5．2 二倍体细胞的转化

1．5．3 细胞系的应用

1．6 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病毒株及实验动物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 引物设计及序列分析软件

2．1．5 主要试剂的配置

2．2 鹅胚成纤维细胞系的建立

2．2．1 鹅胚成纤维细胞(GEF)的制备

2．2．2 GEF的传代培养及纯化

2．2．3 GEF的冻存及复苏

2．3 鹅细小病毒细胞适应毒株的培育

2．3．1 GEF细胞接种鹅细小病毒

2．3．2 PCR检测

2．3．3 GEF细胞中病毒增殖检测

2．3．4 半数感染量(TCID50)的测定

2．4 全基因组的扩增及序列分析

2．4．1 引物设计与合成

2．4．2 全基因组扩增

2．4．3 PCR产物的纯化

2．4．4 PCR产物与pMD18-T载体的连接

2．4．5 氯化钙法制备DH5α感受态

2．4．6 连接产物的转化

2．4．7 pMD18-T载体克隆质粒的提取

3 结果

3．1 鹅胚成纤维细胞系的建立

3．1．1 原代细胞的生长状况

3．1．2 传代细胞的生长状况

3．1．3 细胞的冻存及复苏

3．2 鹅细小病毒细胞适应毒株的培育

3．2．1 显微镜观察CPE

3．2．2 PCR检测

3．2．3 GEF细胞中病毒增殖检测

3．2．4 TCID50测定结果

3．3 全基因组序列分析

3．3．1 全基因组扩增

3．3．2 核苷酸序列分析

3．3．3 推导的氨基酸序列分析

4 讨论

4．1 鹅胚成纤维细胞系的建立

4．2 GPV细胞适应株的培育

4．2．1 小鹅瘟疫苗的研究进展

4．2．2 细胞适应株的培育

4．2．3 细胞适应株的特点

4．3 全基因组序列分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文