IFN-α处理细胞所分泌外体在制备抑制肝炎病毒的药物中的应用

摘要

本发明属分子生物学和医药领域，涉及干扰素-alpha处理细胞所分泌外体作为新型抗乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染等治疗药物的应用研究。本发明提供了外体在制备抑制乙肝病毒或者丙肝病毒的药物中的应用，所述的外体由干扰素-alpha处理的细胞分泌产生。本发明还提供了体外抑制细胞中肝炎病毒的方法及药物。外体被肝细胞内化后能抑制其内乙肝病毒和丙肝病毒的复制，展示了IFN-α刺激细胞所分泌外体作为一种新型的抗HBV和HCV的药物的前景并提供了实验理论基础。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和医药领域，涉及干扰素-alpha(IFN-α)处理细胞所分泌外体 作为抗病毒治疗的应用。

背景技术

由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）和和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus， HCV）持续性感染引起的慢性肝炎是严重危害人类健康的疾病。临床上针对HBV和HCV感染 的抗病毒药物主要为核苷类似物和干扰素-α（Interferon-α,IFN-α），但均有一定的局 限性，包括应答效率低，耐药性，以及耐受性等问题。

肝脏是一个具有极强固有免疫功能的器官，由肝实质细胞（肝细胞）和肝非实质细胞 组成。肝非实质细胞主要包括库否细胞（肝脏常驻的巨噬细胞）、肝窦内皮细胞和淋巴细胞 等细胞组成。肝非实质细胞是否在IFN-α治疗乙型肝炎和丙型肝炎中的起作用，以及通过 何种方式作用以前均未有研究。近期研究报道外体（exosomes）是一类由细胞主动分泌的 大小介于30-100nm，内含蛋白质、RNA和脂质的微囊结构，广泛存在于各种体液中。已报 道外体能介导细胞间的通信，通过水平转移到邻近或远处的靶细胞，参与调控多种重要的 细胞生理或病理活动。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制HBV和HCV再复制的物质，所述的物质优选干扰素-alpha (IFN-α)处理细胞所分泌外体。

本发明的另一个目的是提供一种抑制HBV和HCV在肝细胞中复制的方法。

本发明经细胞和动物模型水平的实验证实，IFN-α刺激肝非实质细胞（包括巨噬细胞 和肝窦内皮细胞）所分泌外体（exosomes）能抑制HBV和HCV在肝细胞中复制，可作为一 种新型抗病毒治疗手段。

IFN-α处理肝非实质细胞上清通过一系列分步超速离心纯化得到外体，分离的外体经 过电子显微镜负染确定外体大小，与Western blot检测外体标志蛋白或保守蛋白，鉴定外 体纯度。

IFN-α处理肝非实质细胞后纯化得到的外体，加入乙肝病毒复制细胞或丙型肝炎病毒 复制细胞中，通过Southern blot和Northern blot方法，以及Gaussia荧光素酶报告系 统方法确定外体能否抑制HBV和HCV生活周期的关键环节。发现经超速离心纯化的、IFN-α 处理的肝非实质细胞分泌的外体能下调病毒的RNA和DNA水平直接抑制HBV的复制，同时 也能抑制HCV的复制及蛋白表达。同时，肝非实质细胞所分泌外体能被肝细胞以内吞的方 式内化，并且这种内化过程为外体抑制HBV复制所必需。

进一步通过Wenstern blot和生物芯片（microarray）方法发现IFN-α处理的肝非实 质细胞释放的外体有多种内容物，其中抗病毒蛋白去氨基酶APOBEC3G，及618个mRNA和3 个microRNA在IFN-α处理的肝非实质细胞释放的外体中上调表达；利用qRT-PCR技术验 证了microAarry的结果。

通过检测外体的去氨基酶活性、mRNA的翻译能力和抑制microRNA靶报告质粒的荧光素 酶活性，证实外体携带的差异分子是有功能的。进一步通过体外共转染mRNA表达质粒（或 miRNA mimic）与pHBV1.3质粒，用Southern blot和Northern blot检测HBV复制抑制， 发现APOBEC3G、mRNA和microRNA在外体抑制HBV复制中发挥了重要作用。

本发明提供了由干扰素-alpha处理的细胞分泌产生的外体在制备抑制乙肝病毒或者 丙肝病毒的药物中的应用。

所述的抑制乙肝病毒或者丙肝病毒包括对乙肝病毒HBeAg、HBsAg蛋白的产生，cccDNA 转录活性，pgRNA、cccDNA含量的抑制作用，或者对丙肝病毒的蛋白、RNA的抑制作用。

所述的外体可以由扰素-alpha刺激细胞后，收集上清，分步超速离心，获得纯化的外 体。

在本发明的一个优选例中，采用1000IU/ml的IFN-α处理细胞。

超速离心一般不超过10,000。在本发明的一个优选例中，经过300g离心10分钟，小 心吸取上清到新管，以后依次，2000g离心10分钟，10000g离心30分钟，100,000g离心 70分钟，最后加入PBS清洗100,000g离心70分钟，获得纯化外体。

通常，该外体含有抗病毒蛋白去氨基酶、mRNA和microRNA。

所述的细胞是肝非实质细胞。

所述的肝非实质细胞是巨噬细胞或者肝窦内皮细胞。

本发明还提供了一种体外抑制细胞中乙肝病毒或者丙肝病毒的方法，在细胞的培养环 境中加入干扰素-alpha。

更好的，加入干扰素-alpha后，收集上清，分步超速离心，获得纯化的外体，然后再 加入细胞的培养环境中。

所述的细胞是巨噬细胞或者肝窦内皮细胞。

本发明还提供了一种抑制乙肝病毒或者丙肝病毒的药物，所述的药物的活性成分是干 扰素-alpha处理细胞分泌产生的外体。

所述的药物还含有抗病毒及免疫调节药物。

本发明证实，IFN-α刺激肝非实质细胞（包括巨噬细胞和肝窦内皮细胞）分泌外体 （exosomes），其外体内含物中包含抗病毒活性分子，外体被肝细胞内化后能抑制其内乙肝 病毒和丙肝病毒的复制，展示了IFN-α刺激细胞所分泌外体作为一种新型的抗HBV和HCV 的药物的前景并提供了实验理论基础。

本发明经由细胞和动物模型水平的实验证实，干扰素-alpha(Interferon-alpha, IFN-α)处理的肝非实质细胞（包括巨噬细胞和肝窦内皮细胞）所分泌外体(exosomes)能抑 制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的 复制。进一步通过Westernblot和生物芯片（microarray）等方法发现，IFN-α能特异地 将一些具有抗病毒活性的蛋白（比如APOBEC3G）、mRNA(比如IFI6)、microRNA（比如 miRNA-638）分子分选到外体中。外体从供体细胞释放后，这些抗病毒分子通过外体内吞的 方式被转运到肝细胞中，发挥抗病毒作用。该发明为优化干扰素-alpha治疗HBV和HCV慢 性感染提供了新的思路，并提供了实验理论基础。

附图说明

图1IFN-α处理LNPCs(MΦ和LSEC)所分泌外体的纯化鉴定及其外体直接抑制HBV复 制效果，

其中，

(1a)HepG2.2.15培养上清中，加入经或未经IFN-α处理巨噬细胞上清，这些上清 预先经过生物素标记的CD63抗体或者对照IgG，或者使用链霉亲和素珠（streptavidin  beads）免疫去除。Southernblot检测HepG2.2.15中HBV的复制情况，同时Westernblot 检测CD63和外体标志蛋白LAMP2的表达量（底图）。(1b)通过分步超速离心从细胞培养 上清分离纯化外体的流程图。(1c)经或不经过IFN-α处理巨噬细胞所分泌的外体电镜负 染，标尺为100nm。(1d)Westernblot比较经或不经过IFN-α处理巨噬细胞所分泌的 外体(5μg/well)与细胞裂解液(15μg/well)中外体标志蛋白含量。(1e)通过Western blot 分析在蔗糖密度梯度超速离心分析经或不经过IFN-α处理巨噬细胞所分泌的外体不同密 度组分中LAMP2和β-actin的表达。(1f)HepG2.2.15培养上清中，以梯度依赖的方式 加入经IFN-α处理巨噬细胞所分泌的外体，通过Northern blot和Southern blot分析 病毒RNAs(前图)和病毒DNA（中和中后图），同时也用Westernblot鉴定组分中LAMP2 的含量（底图）。1a,1e,1g图均为两组独立重复试验结果；1c,1d,1f图为三组独立重 复试验结果；3.5kb,为HBVpregenomicRNA；2.4kb,HBVpre-S1/SRNA;2.1kb,10HBV pre-S2/SRNA。

图2IFN-α处理LNPCs(MΦ和LSEC)所分泌外体的直接抑制HCV复制效果，

其中，

(2a,2b)Huh7HCV亚基因组复制子细胞中，加入IFN-α处理巨噬细胞和LSEC所分 泌的外体48小时，通过western blot检测病毒蛋白NS3(2a)和qRT-PCR检测病毒RNA(2b)。 (2c-f)Huh7细胞中，加入IFN-α处理巨噬细胞和LSEC所分泌的外体12小时，接着用细 胞培养感染性病毒HCVcc系统（表达HCVGaussia荧光素酶报告系统）处理48小时，收集 细胞培养上清，通过Promega荧光素酶报告系统试剂盒检测荧光素酶活性(2c)。同时通过 western blot检测病毒蛋白NS3表达水平(2d)，以及PARP-1切割实验分析细胞凋亡(2e)， 和CCK-8检测细胞活力(2f)。

图3LNPCs分泌的外体能被HepG2.2.15细胞内化，

其中，

(3A)1000IU/mlIFN-α处理肝巨噬细胞和肝窦内皮细胞，分离纯化上清外体，绿色 荧光染料PKH67标记外体，加人到HepG2.2.15细胞培养上清中，2小时后固定细胞，利用 共聚焦显微镜观察外体是否在细胞中存在。(3C)同时利用AnnexinV抑制外体的内化，(3B) 再观察外体的抗病毒作用。

图4IFN-α处理与未处理肝非实质细胞所分泌外体间蛋白和RNA差异表达分子，

其中，

(4A)1000IU/mlIFN-α处理肝巨噬细胞和肝窦内皮细胞，分离纯化上清中的外体 通过Western blot分析外体中抗病毒蛋白APOBEC3G、PKR和MyD88的表达水平；(4B,4C) 同时抽提外体中总RNA，利用基因芯片分析IFN-α处理和不处理外体之间差异的mRNA和 microRNA，分别通过Agilent平台Human4x44K Gene Expression Array芯片检 测mRNA表达谱，Exiqon平台miRCURY^TMLNA Expression Array芯片检测miRNA 表达谱（进行3组独立重复），通过上调或下调倍数≥1.5倍，p<0.05筛选差异 表达基因。（4C）显著上调的microRNA有has-miR-638,has-miR-4284, has-miR-1260。

图5IFN-α处理肝窦内皮细胞外体携带的差异表达的APOBEC3G、mRNA和microRNA 在外体介导的抗病毒作用中的活性，

其中，

(5A-D)表达APOBEC3GshRNA的慢病毒感染巨噬细胞和肝窦内皮细胞，1000IU/ml IFN-α处理肝巨噬细胞和肝窦内皮细胞，分离纯化上清外体，加入到HepG2.2.15细胞培养 上清中；利用mRNA翻译抑制剂CHX（10ug/ml）预处理HepG2.2.15细胞2h，然后加入1000 IU/mlIFN-α处理的肝巨噬细胞和肝窦内皮细胞来源的外体；把microRNA的抑制剂（50nM) 转染入HepG2.2.15细胞中，12h后加入1000IU/mlIFN-α处理的肝巨噬细胞和肝窦内皮 细胞来源的外体；最后用EPA检测上清中的病毒量。(5E,5F)表达图示基因（4ug）或者 microRNA(50nM)的表达质粒分别与HBV复制质粒pHBV1.3(2ug)共转染HepG2细胞，48h 后用Northern blot和Southern blot分别检测细胞内病毒RNA和病毒DNA的表达水平。

图6小鼠高压尾静脉注射乙肝模型中，通过nSMase2shRNA或Rab27shRNA 抑制外体的释放，削弱IFN-α抗HBV活性，

其中，

（6a）鼠nSMase2shRNA高压尾注法转导入小鼠体内，通过Western blot检测不同 时间点肝组织和脑组织中nSMase2的表达；(6b)将鼠nSMase2shRNA和pHBV1.3高压尾 注法共转导入小鼠体内，用IFN-α处理一周，用PCR法检测血清中病毒拷贝；(6c)将鼠 Rab27shRNA（抑制exosome释放）和pHBV1.3高压尾注法共转导入小鼠体内，qPCR检测 血清HBVDNA拷贝数，72小时后用IFN-α处理或不处理，24小时后采血，用PCR法检测 血清中病毒拷贝。同时取肝组织，裂解后用Westernblot检测Rab27a和β-actin，及提 取外体检测外体中LAMP2的表达。

具体实施方式

本发明提供了一种新型治疗乙肝病毒和丙肝病毒的方法，即通过干扰素-α处理肝非 实质细胞细胞分泌外体，外体介导细胞间抗病毒分子传递，抑制乙肝病毒和丙肝病毒复制， 为治疗乙肝病毒和丙肝病毒提供一种新型治疗药物。

为便于理解，以下将通过具体的优选例和附图对本发明的方法设计及应用进行详细地 描述。需要特别指出的是，下述优选例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员 可根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出修改，这些修改也纳入本发明的范围内。

实施例1细胞系模型实施方式

1．IFN-α处理肝非实质细胞和外体体外分离纯化鉴定

1.1用含10%血清（经过100,000g离心预处理，去除血清中外体）的合适培养基培养 的人肝窦内皮细胞（LSECs)与巨噬细胞（THP-1）

1.21,000U/mlIFN-α处理肝窦内皮细胞或巨噬细胞48小时，收集上清，通过分步 超速离心方式，经过300g离心10分钟，小心吸取上清到新管，以后依次，2000g离心10 分钟，10000g离心30分钟，100,000g离心70分钟，最后加入PBS清洗100,000g离心70 分钟，获得纯化外体。分离的外体需同时经过电子显微镜负染鉴定外体大小，与Western blot 检测外体标志蛋白或保守蛋白（Lamp2，CD63，TSG101，β-actin,and Hsp90）与外体中 不存在的蛋白（GRP94，EEA1和cytochrome C），鉴定外体。

2.IFN-α处理肝非实质细胞所分泌外体直接抑制抗病毒效果

分别将不同剂量（5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml）外体加入到HepG2.2.15或者转染 pHBV1.3的Huh7或HCVcc细胞培养上清中，48小时后通过Southern blot检测HBV复制中 间体水平和Northern blot方法检测HBV毒RNA水平，以及通过Promega公司的荧光素酶 报告系统，检测HCVcc系统表达分泌Gaussia荧光素酶的活性，通过Western blot检测HCV NS3蛋白表达情况。结果表明，IFN-α处理的肝非实质细胞释放的外体能直接抑制HBV和 HCV的复制。

3.IFN-α处理肝窦内皮细胞所分泌外体内含蛋白和RNA分子

通过Western blot检测IFN-α处理肝窦内皮细胞所分泌外体内含物中差异表达蛋白 Apobec3G，MxA蛋白；通过生物芯片检测IFN-α处理肝窦内皮细胞所分泌外体内含物中差 异表达RNA，将15cmdish中LSEC细胞按传代比例铺板，12h后加入1000UI/mlIFN-α处 理或不处理经过48小时，收集上清，分步超速离心分离纯化外体（外体的抽提和鉴定如前 所述）。抽提外体中加入TRIzolRNA抽提试剂，按照RNA抽提步骤，抽取RNA后，通过Agilent 平台Human4x44K Gene Expression Array芯片检测mRNA表达谱，Exiqon平台miRCURY^TM  LNA Expression Array芯片检测miRNA表达谱。进行3组独立重复，分析结果发现618个 mRNA和3个microRNA在IFN-α处理的肝非实质细胞释放外体中上调表达。通过随机选择 11种mRNA（IFI6，ALDH3A2，TNFAIP8L2，CALHM1，AGBL4，TRAF4，FABP5，DDIT3，USP20， IFITM1，GTPBP2）和3种microRNA，进行qRT-PCR验证芯片结果可信。

4.IFN-α处理肝窦内皮细胞所分泌外体内含物蛋白和RNA分子的体外抗病毒活性检 测

通过APOBEC3GshRNA在肝非实质细胞中抑制APOBEC3G的表达、在肝细胞中利用mRNA 翻译抑制剂Cycloheximide(CHX)阻断外体携带的mRNA的翻译和利用microRNA抑制剂抑制 外体携带的microRNA的功能。

将pHBV1.3质粒和携带有上述11种mRNA目的基因的质粒或3种miRNAmimic分别共 转染入HepG2细胞，并设置一份对照（以pcDNA3.1代替含目的基因的质粒与pHBV1.3共转 染），通过Southernblot方法检测HBVDNA和Northernblot方法检测HBVRNA，结果显 示CALHM1，FABP5，DDIT3，USP20，IFITM1，GTPBP2和has-miR-638抑制病毒RNA水平， FABP5，IFITM1，GTPBP2，has-miR-638分子抑制HBV病毒DNA水平。

实施例2小鼠模型实施方式

（1）高压水动力尾静脉注射nSMase2shRNA表达载体（或者Rab27shRNA表达载体） 和pHBV1.3质粒，24小时后注射IFN-α(1.4x10⁵U/鼠)；或高压水动力尾静脉注射表 达载体和pHBV1.3质粒，24小时后注射IFN-α(1.4x10⁵U/鼠)。

（2）在随后1-7天每天眼眶采血，通过匹基HBVDNA定量试剂盒检测HBV拷 贝数

（3）结果显示，在小鼠体内通过干扰素诱导细胞分泌外体对乙肝病毒的基 因组DNA含量相对对照组有显著抑制作用。