逆转肿瘤多药耐药的基因组合物h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA及其应用

摘要

本发明公开了一种能够逆转肿瘤多药耐药的基因组合物-h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA及其制备方法与应用。本发明所提供的抗肿瘤多药耐药基因组合物，由末端为氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、靶点为EGFR的尼妥珠单抗h-R3和针对多药耐药基因MDR1的小干扰RNA自组装制成。本发明具有以下优点：1)以EGFR为靶点，通过自组装的方法形成尼妥珠单抗h-R3修饰的PAMAM载体作为基因递送载体，利用h-R3与肿瘤细胞EGFR介导的内吞作用，提高PAMAM载体对肿瘤细胞的靶向性，从而将针对MDR1基因的小干扰RNA成功递送到细胞内，实现目的基因MDR1 siRNA的沉默，进一步增加化疗药物的敏感性。2)采用自组装方法制备h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA组合物，与化学合成相比，分子自组装方法可更方便、灵活的对体系进行修饰，并且保持配体的生物活性。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种逆转肿瘤多药耐药的基因组合物 -h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是常见且严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一，正在成为世界“头 号杀手”。随着抗肿瘤新药的不断研发，化疗方案的不断改进，化疗在肿瘤综合治疗中 的作用和地位日益重要。但是，抗肿瘤化学药物的选择性低、对正常组织毒副作用大， 这些因素很大程度上影响临床化疗的效果。除此之外，肿瘤细胞多药耐药的产生也成 为目前肿瘤化疗失败的一个主要原因，据美国癌症协会估计，90％以上肿瘤患者死于不 同程度的耐药。因此，如何成功逆转肿瘤多药耐药也已成为目前肿瘤治疗领域中亟待 解决的重要问题[van Vlerken et al.,2008]。

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐 药性的同时，对结构和作用机制不同的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性，从而大大降 低了抗肿瘤药物的疗效。MDR形成机制复杂，肿瘤细胞可以通过不同途径导致MDR的 产生。

随着肿瘤细胞MDR分子机制研究的不断深入，克服MDR的方法研究也取得了较大 进展，目前研究较多的是化学合成抑制剂和基因治疗。化学合成的抑制剂能够增加肿 瘤细胞对化疗药物的敏感性，但这些药物在临床应用中特异性不高、毒副作用严重， 难以达到逆转MDR的有效血浆浓度，并且肿瘤细胞也可以对这些药物产生耐药性，其 临床应用受到限制。目前逆转肿瘤多药耐药的基因治疗方法主要集中在：1)抑制P-gp 药泵功能(Lin et al,2003)；2)干扰MDR相关基因的表达，如MDR1基因的反义寡 聚脱氧核糖核酸(AOD)，MDR1和MRP基因的反义RNA联合抑制，切割MDR1mRNA的 核酶(Stuart et al 2000；Wang et al,2003；Huesker et al,2002)；3)针对MDR1 基因调节的基因治疗(Efferth et al,2001)；4)mdr1/siRNA的RNA干扰(Hannon  et al,2002；Yague et al,2004)。与反义寡核苷酸、反义RNA和人工转录因子相 比，siRNA的应用前景最好，其它均存在体内特异性不强、转染效率和稳定表达不足 等问题。

尽管siRNA相比于反义寡核苷酸、反义RNA等具有较好的应用前景，但具有核酸 和小分子化合物的双重特性的siRNA，其本身的亲水性和阴离子特性使其很难通过细 胞膜，而且由于易被核酸酶(RNase)降解导致其具有稳定性差、半衰期短、转染效率 低等特点。因此应用siRNA分子的关键是如何使其有效地穿过细胞膜，进入细胞质中 的RNAi通路。而且将siRNA分子导入生物体内治疗疾病更为复杂，除了细胞膜障碍外， 还要克服靶细胞的选择性、体内siRNA分子的稳定性、动态平衡的机制以及对非靶细 胞的毒性等问题。因此，siRNA是否能够有效递送是其能否应用于临床的关键，设计 和合成安全、高效、靶向的siRNA递送载体已经成为目前siRNA药物研究的重要方向。

新型树枝状高分子聚酰胺-胺(PAMAM)，以其独特的分子结构和表面性质，成为 了治疗性基因载体研究的热点。以末端为胺基的PAMAM树枝状大分子为例，它在生理 pH条件下具有很好的溶解性，其正电性的特征可以实现更多数量基因的运载，而且体 系稳定，能够保护目的基因不受体内血浆或组织细胞中各种酶的破坏，因而可以实现 体内的有效转染[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:4897-4902]。但PAMAM作为基因 递送载体在体内应用尚存在以下几个问题需要解决：1)转染效率相对较低；2)在体 内环境下，PAMAM可以非特异性的结合大量的负电大分子和红细胞，影响转染效率并 且发生溶血现象；3)如何实现PAMAM纳米基因递送系统的靶向性。

为了解决上述问题，目前研究多直接在PAMAM分子上进行修饰，如在PAMAM表面 修饰鸟氨酸等残基[Int J Pharm,2010,392:294–303]，增强PAMAM分子表面正电 性以增强转染效率，但此方法在增强过多正电性的同时，也提高了细胞毒性；另一方 面，对PAMAM表面修饰PEG[Nanotechnology,2009,20:105-103]，以提高生物相容 性，减少非特异性的结合血浆中的负电大分子和红细胞，另外，在PEG末端修饰特定 蛋白如乳铁蛋白[Biomaterials,2008,29(2):238-246]，以实现组织靶向性，但PEG 的修饰增加了PAMAM分子和DNA分子结合的空间位阻，降低了转染效率。

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是一种具有酪 氨酸激酶活性的生长因子受体，在正常细胞表达率低，而在多种肿瘤如肺癌、大肠癌、 肾癌和头颈部鳞癌等多种肿瘤细胞中存在过度表达。EGFR信号通路在癌症的发生发展 中起着重要作用，EGFR的异常表达常与恶性肿瘤的特征如细胞增殖、免疫逃避、转移 复发、肿瘤血管形成以及化疗抗拒、不良预后等相关，为以EGFR为靶点的肿瘤治疗和 针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。

目前以EGFR为靶点的肿瘤治疗方式中单克隆抗体为常见治疗方法，EGFR单克隆 抗体与内源性配体竞争结合EGFR，通过抑制酪氨酸激酶的激活、促进EGFR内化等作 用产生抗肿瘤效应，也可与抗癌药物或毒素相偶联，从而达到特异性抑制肿瘤生长的 目的。

例如，尼妥珠单克隆抗体(Nimotuzumab，h-R3)为抗人EGFR人源化单克隆抗体 (mAb)，具有人源性、高选择性和半衰期长的特点，能够竞争性抑制内源性配体与 EGFR的结合，抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，阻断由EGFR介导的下游信号转导通路。 体内外研究表明，h-R3有抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成 以增加放化疗敏感性的作用[Expert Rev Anticancer Ther,2003,3(3):367-380；Lung  Cancer,2013,79(3)270-275]。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于抗肿瘤多药耐药的组合物。

本发明提供的组合物，由末端带有氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物、尼妥珠单抗 h-R3和MDR1 siRNA复合制成。

上述的组合物中，所述聚酰胺-胺树枝状聚合物的数均分子量为28824.81。

上述的组合物中，所述MDR1 siRNA为由序列比表中序列1所示的单链正义链和序 列表中序列2所示的单链反义链组成。

上述的组合物中，所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与所述MDR1 siRNA的氮/磷比为 1:1-40:1。

上述的组合物中，所述聚酰胺-胺树枝状聚合物与所述MDR1 siRNA的氮/磷比为 20:1。

上述的组合物中，所述尼妥珠单抗h-R3与所述MDR1 siRNA的质量比为 0.05:1-5:1。

上述的组合物中，所述尼妥珠单抗h-R3与所述MDR1 siRNA的质量比为0.05:1、 0.1:1或0.5:1。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述的抗肿瘤多药耐药组合物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

将末端为氨基的聚酰胺-胺树枝状聚合物的水溶液与MDR1 siRNA混合后，孵育条 件下自组装形成聚酰胺-胺树枝状聚合物与MDR1 siRNA的组合物；再将所述聚酰胺- 胺树枝状聚合物与MDR1 siRNA的组合物中加入到尼妥珠单抗h-R3中，孵育条件下自 组装形成聚酰胺-胺树枝状聚合物、尼妥珠单抗h-R3和MDR1 siRNA的组合物，即得到 所述的抗肿瘤多药耐药基因组合物。

上述的组合物在在制备逆转肿瘤细胞多药耐药产品中的应用或在制备抗肿瘤细胞 多药耐药产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，

所述肿瘤细胞为多药耐药肿瘤细胞，所述多药耐药肿瘤细胞具体为MCF-7/ADR； 所述产品为药物。

上述的组合物在靶向运输核酸或制备靶向运输核酸产品中的应用也是本发明保护 的范围，在本发明中的核酸为MDR1 siRNA。

本发明的实验证明，本发明具有以下优点：

1)以EGFR为靶点，通过自组装的方法形成尼妥珠单抗h-R3修饰的PAMAM载体作 为基因递送载体，利用h-R3与肿瘤细胞EGFR介导的内吞作用，提高PAMAM载体对肿 瘤细胞的靶向性，从而将针对MDR1基因的小干扰RNA成功递送到细胞内，实现目的基 因MDR1 siRNA的沉默，进一步增加化疗药物的敏感性；2)通过单克隆抗体h-R3对 PAMAM的修饰，可降低PAMAM载体过强的正电荷强度，有利于降低细胞毒性和溶 血现象的发生；3)采用自组装方法制备h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA组合物，与化学 合成相比，分子自组装方法可更方便、灵活的对体系进行修饰，并且保持配体的生物 活性。

附图说明

图1为Western Blot法检测敏感细胞MCF-7与耐药细胞MCF-7/ADR中GCS蛋白的 表达。

图2为PCR检测敏感细胞MCF-7与耐药细胞MCF-7/ADR中GCS蛋白的表达。

图3为不同氮/磷比(N/P比)的PAMAM G5/MDR1 siRNA的凝胶电泳阻滞实验 结果。

图4为h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物凝胶电泳阻滞实验结果。

图5为h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物Zeta电位检测结果。

图6为h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物粒度检测结果。

图7为h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA转染24h后的平均荧光强度。

图8为h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA(h-R3-dendriplex,N/P 20:1,h-R3/siRNA 0.1:1)在HepG2转染24后的激光共聚焦图。

图9为MCF-7/ADR转染h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA后沉默多药耐药基因 MDR-1的效果。

图10为激光共聚焦考察h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA在MCF-7/ADR细胞转染 48h后加入阿霉素(ADM)的摄取情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)：末端带有氨基，以乙二胺为核，5.0代，(购 自Sigma-Aldrich，货号：536709，规格5g，数均分子量为28824.81)；采用旋转蒸 发仪抽真空，去掉甲醇溶剂，获得PAMAM G5，再用PBS缓冲液(pH7.4)溶解，制备 成10mg/mL储存液于4℃备用。

尼妥珠单抗(Nimotuzumab，h-R3)：购自百泰生物药业有限公司。

多药耐药基因(MDR1)小干扰RNA(MDR1 siRNA)：购自苏州瑞博生物技术公司， 其由序列表中序列1所示的单链正义链和序列表中序列2所示的单链反义链组成的双 链RNA。

正义链CAGAAAGCUUAGUACCAAAdTdT(序列1)

反义链UUUGGUACUAAGCUUUCUGdTdC(序列2)

耐药细胞株(MCF-7/ADR)：购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，其细 胞中MDR1的表达量检测如下：

首先采用蛋白质印迹法(Western Blot，WB)检测耐药细胞MCF-7/ADR中MDR1 的表达，并与敏感细胞MCF-7进行比较。结果如图1所示，1为MCF-7细胞、2为 MCF-7/ADR细胞；由结果可知MDR1在耐药细胞株MCF-7/ADR中的表达明显高于在敏 感细胞株MCF-7中的表达。进一步采用PCR检测转录水平上敏感细胞和耐药细胞中 MDR1表达的差异，结果如图2所示，1：Marker；2：MCF-7中的MDR1；3：MCF-7/ADR 中的MDR1；4：MCF-7中的MDR1；5：MCF-7/ADR中的MDR1；6：MCF-7中的 GAPDH；7：MCF-7/ADR中的GAPDH；表明在MCF-7和MCF-7/Adr细胞株中，不 仅MDR1的表达存在差异，多药耐药蛋白MDR1的表达也存在差异。

实施例1、制备h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物及其表征

一、PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物

首先将上述制成的PAMAM G5(数均分子量为28824.81)10mg/mL储存液溶解于 消毒蒸馏水中，振荡混匀，配制成1mg/mL的工作溶液，4℃储存备用。转染前取1.0μg MDR1 siRNA置于EP管中，分别加入0.7μL、1.4μL、3.5μL、7μL、14μL、21μL、 28μL浓度为1mg/mL的PAMAM G5工作溶液，再加入opti-MEM培养基(购自invitrogen， 产品目录号为11058-021)500uL，混匀后置室温孵育30min形成PAMAM G5/MDR1 siRNA 复合物。形成的PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物中，PAMAM与MDR1 siRNA的氮/磷比分 别为1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1。

将上述制备的PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物采用琼脂糖凝胶电泳阻滞实验证明 PAMAM与MDR1 siRNA的复合情况以及稳定性。所检测的PAMAM G5/MDR1 siRNA复合 物中，PAMAM与MDR1 siRNA的氮/磷比分别为1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1。

具体方法如下：

称取适量琼脂糖，加入1×TAE溶液，加热溶解，配制1％琼脂糖凝胶溶液，室温 冷却至约50℃，加入1μL溴化乙锭溶液(500μg/ml)插入DNA染色，灌胶，加样， 120V电泳30min左右，紫外透射仪观察并拍照。新鲜配制所需转染复合物，1％琼脂 糖凝胶电泳鉴定包封效果。

结果如图3所示，泳道1为裸MDR1 siRNA；泳道2-8为氮/磷比分别为1，2，5， 10，20，30，40；泳道9为RNA Marker，结果显示siRNA在没有与PAMAM完全结合时 (泳道2-5)，能够出现正常电泳条带；当N/P比为20(泳道6)时，PAMAM-siRNA能够 完全阻滞其包裹的siRNA的电泳，使其滞留在点样孔附近，无法电泳出正常电泳条带， 表明N/P达到20时，能够形成稳定的PAMAM-siRNA。

二、h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物及其表征

1、h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物

将尼妥珠单抗(Nimotuzumab，h-R3)用PBS缓冲液(pH7.4，NaCl 8.0g,KCl 0.2g, NaH₂PO₄·H₂O 1.56g,KH₂PO₄0.20g，蒸馏水定容至1000ml)，配制成浓度为1mg/mL的 单抗溶液，向100μL氮/磷比20的PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物加入不同体积的浓度 为1mg/mL的单抗溶液，混匀后置室温孵育30min形成h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA 复合物。形成h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物中，h-R3与MDR1 siRNA的质量比分 别为0.05:1、0.1:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1，PAMAM G5与MDR1 siRNA的氮/磷比为 20:1。

2、表征

1)琼脂糖凝胶电泳阻滞实验

将上述制备的h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物采用琼脂糖凝胶电泳阻滞实验 证明PAMAM与MDR1 siRNA的复合情况以及稳定性，所检测的h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA 复合物中，PAMAM与MDR1 siRNA的氮/磷比为20:1；h-R3与MDR1 siRNA的质量比分 别为0.05，0.1，0.5，1，2，5。方法同上。

h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA三元复合物的琼脂糖凝胶电泳阻滞实验结果如图4所 示，泳道1为裸MDR1 siRNA；泳道2-7为PAMAM G5与MDR1 siRNA氮/磷比为20:1、 且h-R3与MDR1 siRNA的质量比分别为0.05，0.1，0.5，1，2，5的h-R3/PAMAM G5/MDR1  siRNA复合物；泳道8为Marker，从图中可见，当h-R3与MDR1 siRNA的质量比为0.05、 0.1、0.5时，无裸siRNA条带，此时形成的h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物是稳 定的，可以有效包裹MDR1 siRNA。

因此，结合上述结论，h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物，PAMAM与DNA 的氮/磷比为20:1，且h-R3与MDR1 siRNA的质量比为0.05、0.1、0.5，为最佳反应组 合物。

2)、h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物的Zeta电位

采用激光粒度及Zeta电位测定仪(英国Malvern公司，型号Zetasizer Nano ZS 90) 对1制备的h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物(PAMAM与MDR1 siRNA的氮/磷比为20:1； h-R3与MDR1 siRNA的质量比分别为0.05，0.1，0.5，1，2，5)的Zeta电位进行测 定。

结果如图5所示，h-R3与MDR1 siRNA的质量比从0.05提高到0.5时， mAb/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物的电位无明显降低趋势，而当h-R3与MDR1 siRNA的质量比大于1时，复合物的Zeta电位明显下降。

3)、h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物的粒径

采用激光粒度及Zeta电位测定仪(英国Malvern公司，型号Zetasizer Nano ZS 90) 对制备的h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物(PAMAM与MDR1 siRNA的氮/磷比为20:1； h-R3与MDR1 siRNA的质量比分别为0.05，0.1，0.5，1，2，5)的粒径大小进行测定。

结果如图6所示，随着h-R3与MDR1 siRNA的质量比的提高，复合物的粒径呈 增大趋势，当h-R3与MDR1 siRNA的质量比大于1时，复合物的粒径明显增大。

实施例2、h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物在抑制肿瘤细胞多药耐药中的应用

1、h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物的细胞胞吞情况测定

采用流式细胞仪检测h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物(氮/磷比为20:1；h-R3 与MDR1 siRNA质量比为0.5)的细胞胞吞情况。具体转染方法为：

转染前12h，24孔板以5×10⁴/孔HepG2细胞铺板,培养基为含10％血清的 DMEM,培养于37℃的含5％CO₂的细胞培养箱中。按照要求配制不同转染复合物,复 合物体系中含1μg cy5-siRNA。细胞密度长至60％左右进行转染,每皿加入相应转染 opti-MEM液。转染后4h,每皿补充1ml新鲜的培养基；继续培养44h后，消化收集 转染后的细胞，PBS冲洗3遍，通过流式细胞仪检测cy5荧光信号分析吞噬siRNA情 况。

以如下为对照组：

PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物(PAMAM)：与h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物 (h-R3-dendriplex)制备方法基本相同，不同的是不加入h-R3；

EGF/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物(EGF-dendriplex)：与h-R3/PAMAM  G5/MDR1 siRNA复合物制备方法基本相同，不同的是用同样量的EGF蛋白替换h-R3；

HSA/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物(HSA-dendriplex)：与h-R3/PAMAM  G5/MDR1 siRNA复合物制备方法基本相同，不同的是用同样量的HSA蛋白替换h-R3；

结果如图7所示，与其他修饰相比，h-R3修饰PAMAM能够明显介导MDR1 siRNA 胞吞进入耐药细胞。

2、激光共聚焦显微镜考察转染h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物进入细胞后的 胞吞情况

利用激光共聚焦显微镜考察转染h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物(氮/磷比为 20:1；h‐R3与MDR1 siRNA质量比为0.5)进入HepG2细胞后的胞吞情况。

以如下为对照组：

PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物(dendriplex)：与h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合 物(h-R3-dendriplex)制备方法基本相同，不同的是不加入h-R3；

EGF/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物(EGF-dendriplex)：与h-R3/PAMAM  G5/MDR1 siRNA复合物制备方法基本相同，不同的是用同样量的EGF蛋白替换h-R3；

HSA/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物(HSA-dendriplex)：与h-R3/PAMAM  G5/MDR1 siRNA复合物制备方法基本相同，不同的是用同样量的HSA蛋白替换h-R3；

结果如图8所示，所用siRNA为cy5标记的siRNA(红色)。观察前，用LysoTracker  Green染细胞中的溶酶体(绿色)，Hoechst33342用于对细胞核进行染色(蓝色)。结果 显示转染24h，h-R3-dendriplex和HSA-dendriplex相对于未修饰的dendriplex有较高 的转染能力,而EGF-dendriplex无明显提高转染的能力。此外，也可看到红色与绿色 共标的黄色信号，则代表此时siRNA已被胞吞，但仍在溶酶体/内涵体中没有释放出来。 转染24h后，h-R3修饰的h-R3-dendriplex有部分siRNA明显从内涵体释放到细胞质 中。由此可见，相对于非修饰的dendriplex、EGF-dendriplexh-R3-dendriplex以及 HSA-dendriplex，h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物拥有较好的逃逸过程，从而可以 更好地发挥沉默目的基因的功效。

3、h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA转染后多药耐药基因MDR1沉默效果

上述实验的结果表明，h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA相比于非修饰的PAMAM G5/MDR1  siRNA复合物以及HSA或EGF修饰的PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物具有更好的进入细 胞并且胞吞的能力，因此在之后的实验中不再选择HSA或EGF修饰的PAMAM G5/MDR1  siRNA复合物作为对照，仅选择非修饰的PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物作为对照，进 一步验证h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA转染后MDR1基因的沉默效果。

按实施例1所述的方法制备PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物和h-R3/PAMAM G5/MDR1  siRNA复合物，其中PAMAM与DNA的氮/磷比确定为20:1，h‐R3与MDR1 siRNA的质 量比为0.5:1。利用RT-PCR法检测两种复合物转染进入耐药细胞MCF-7/ADR后MDR1 基因表达量的变化。

引物序列为：MDR1for ATATCAGCAGCCCACATCAT

            MDR1re GAAGCACTGGGATGTCCGGT

以GAPDH为内参基因。

结果如图9所示，1:未转染MCF-7/ADR中的MDR1；2:转染PAMAM G5/MDR1  siRNA复合物MCF-7/Adr中的MDR1；3:转染h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物 MCF-7/ADR中的MDR1；看出，相比于非修饰的PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物， h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA复合物转染后耐药细胞MCF-7/ADR中几乎检测不出 MDR1基因的表达，说明MDR1基因有可能被完全沉默，进一步证明了h-R3/PAMAM G5 能够携载MDR1 siRNA更好地靶向到肿瘤耐药细胞，并且易被细胞内吞而且可以逃逸 溶酶体，从而更为有效地发挥沉默目的基因的功能。

4、激光共聚焦显微镜检测耐药细胞摄取阿霉素的量

通过激光共聚焦显微镜检测耐药细胞摄取阿霉素的量，进一步验证MDR1基因沉 默的效果，MCF-7/ADR细胞转染48h后加入阿霉素(ADM)，观察其被细胞摄取的情 况。观察前，采用Hoechst33342对细胞核进行染色(蓝色)，阿霉素(ADM)具有自 发的荧光(红色)，结果如图10所示。图中A-C依次为未处理细胞组、PAMAM G5/MDR1  siRNA组、三元复合物h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA组(氮/磷比为20:1；h-R3与 MDR1 siRNA质量比为0.5)。结果表明，相比于未处理的细胞(A)、PAMAM G5/MDR1  siRNA组(B)，三元复合物h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA(C)转染后耐药细胞能 够明显摄取阿霉素，进一步验证了h-R3/PAMAM复合物能够更好地介导MDR1 siRNA 进入到肿瘤多药耐药细胞从而逆转肿瘤多药耐药。